一、短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究(英文)（论文文献综述）
王哲义[1]（2021）在《丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究》文中提出目的:缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke,CIS）具有高患病率、高复发率、高致残率和致死率的特点。丹参酮ⅡA磺酸钠是丹参脂溶性成分丹参酮ⅡA经磺化后的水溶性物质,治疗缺血性脑卒中疗效确切,但作用机制尚未完全阐明。本研究运用网状Meta分析系统评价丹参类中药注射剂治疗急性缺血性脑卒中的有效性和安全性。通过网络药理、蛋白组学技术探究丹参酮ⅡA可能作用机制,并在大鼠缺血/再灌注模型和PC12神经细胞氧糖剥夺/复氧模型中对可能的靶点和机制进行验证。方法:（1）计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI）、维普数据库（VIP）、万方数据库、PubMed、Cochrane Library,检索起止时间为建库至2021年2月。由两位研究员独立筛选文献、提取资料并按照Jadad量表对文献进行质量评价,采用Stata 16.0进行统计分析。（2）使用TCMSP数据库检索丹参的活性成分及作用靶点,在GeneCards、NCBI和OMIM数据库中获取缺血性卒中的靶点,并将药物和疾病交集后的靶点输入STRING数据库,构建蛋白质相互作用网络,利用Cytoscape3.8.2软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病网络。通过Bioconductor进行GO功能富集和KEGG通路分析。（3）采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注损伤（MCAO/R）模型,将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA磺酸钠组。根据神经功能评分（Z-Longa）、TTC染色及HE染色评价MCAO/R模型及药物疗效。（4）使用DIA定量蛋白组学分析各组大鼠脑缺血半影区蛋白表达的情况,根据|log2FC|≥0.58且p<0.05的标准筛选差异蛋白;利用R软件绘制火山图和差异蛋白聚类分析热图;运用STRING数据库,构建差异蛋白的互作（PPI）网络;利用DAVID、ClueGO等工具对差异蛋白进行GO富集分析和KEGG信号通路分析,并用平行反应监测技术（PRM）的方法验证蛋白表达。（5）利用嗜铬细胞瘤PC12细胞系构建氧糖剥夺复氧（OGD/R）模型,同时给予不同浓度（1μM、5μM、10μM、20μM、40μM）丹参酮ⅡA磺酸钠干预3h、6h、12h,使用CCK-8法检测细胞活力,确定给药剂量和时间,运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测蛋白组学预测的可能靶点。结果:（1）共纳入160项研究,总样本量18079例,共纳入7种中药注射剂和8种治疗措施,包括丹红注射剂联合常规治疗（DH+CT）、丹参注射剂联合常规治疗（DS+CT）、丹参川芎嗪注射剂联合常规治疗（DSCXQ+CT）、注射用丹参多酚酸联合常规治疗（DSDFS+CT）、复方丹参注射剂联合常规治疗（FFDS+CT）、注射用丹参多酚酸盐联合常规治疗（SI+CT）、丹参酮ⅡA磺酸钠注射剂联合常规治疗（STS+CT）和常规治疗（CT）。网状Meta分析结果显示,在总有效率方面,累积概率排序为:DSDFS+CT（93.0%）>DH+CT（80.5%）>STS+CT（66.7%）>DSCXQ+CT（66.4%）>SI+CT（50.0%）>DS+CT（26.7%）>FFDS+CT（16.7%）>CT（0.1%）。在 NIHSS评分方面,累积概率排序为:STS+CT（95.5%）>DH+CT（80.9%）>DSCXQ+CT（70.1%）>SI+CT（64.7%）>DSDFS+CT（42.0%）>FFDS+CT（24.4%）>DS+CT（20.1%）>CT（2.4%）。在 Barthel 指数方面,DH+CT（76.2%）>DSCXQ+CT（74.3%）>STS+CT（64.1%）>DSDFS+CT（62.2%）>FFDS+CT（51.8%）>SI+CT（46.0%）>DS+CT（21.7%）>CT（3.8%）。（2）从丹参中共筛选出65个活性成分和108个对应靶点,以及缺血性卒中相关靶点2558个,取交集后获得靶点87个,其中度值大于50的靶点有6个,包括AKT1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1、EGFR,即本研究的核心靶点。GO功能富集分析得到GO条目124个（p<0.05）,KEGG通路富集分析筛出134条信号通路（p<0.05）,以PI3K/AKT、HIF-1信号通路所占靶点数目最多。构建的药物-化合物-作用靶点-疾病网络显示,丹参酮ⅡA等活性化合物在整个网络中发挥着关键作用。（3）与假手术组相比,MCAO/R模型大鼠神经功能评分显着升高,TTC染色显示梗死范围扩大,HE染色显示大脑皮层及纹状体区域组织变性明显。丹参酮ⅡA磺酸钠治疗可降低神经功能评分,缩小梗死面积,减轻空泡样改变及胞核皱缩等病变。（4）蛋白组学在大鼠脑组织中共鉴定出5880个蛋白,其中模型组与假手术组差异蛋白为423个。经丹参酮ⅡA磺酸钠干预后,与模型组相比,共有285个差异蛋白。将三个组别进行整合分析,共有127个有表达趋势的差异蛋白,这些差异蛋白GO富集主要参与缺氧反应、神经元凋亡过程、钙离子转运等生物学过程;KEGG通路主要富集在PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路等通路。PPI网络获得Alb、mTOR、Dync1h1、Stxbp1、Cltc、Sptan1等核心差异蛋白。mTOR、PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路是调控自噬的上游信号,将上述通路的关键靶点及自噬相关蛋白进行PRM验证,结果显示与正常组比较,模型组的mTOR和p62蛋白表达显着下降（p<0.05）,HIF-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PI3K和AKT1蛋白表达无统计学意义（p>0.05）。经过丹参酮ⅡA磺酸钠治疗后,HIF1α和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量明显下降（p<0.05）,p62蛋白表达显着升高（p<0.05）,mTOR、PI3K和AKT1表达差异无统计学意义（p>0.05）。（5）体外研究中CCK-8结果显示,与OGD/R模型组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠1μM、5μM的给药浓度在3h、6h、12h等不同给药时间对细胞活力均无显着影响;而10μM、20μM和40μM的丹参酮ⅡA磺酸钠在各个给药时间均表现出对PC12细胞的保护作用,且依赖给药时间和药物浓度呈梯度增强,差异具有统计学意义（p<0.05）。RT-qPCR显示,与对照组相比,OGD/R模型组HIF1α、Beclin1、LC3的mRNA相对表达量显着增多（p<0.01）,而mTOR的mRNA相对表达量显着减少（p<0.01）;与OGD/R组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠干预后HIF1α、Beclin1、LC3的mRNA相对表达量显着减少（p<0.01）,而mTOR的mRNA相对表达量显着增加（p<0.01）。结论:根据网状Meta分析结果,丹参酮ⅡA磺酸钠注射液在改善患者NIHSS评分方面有优势;网络药理学筛选出丹参酮ⅡA可能是丹参主要活性化合物,并且经蛋白组学预测其磺化后可能作用于mTOR等核心靶点,参与调节PI3K/AKT、HIF-1等信号通路,发挥抑制细胞凋亡、抗炎、调节自噬等作用;体内研究发现丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过HIF-1信号通路,作用于mTOR等靶点,抑制细胞自噬,改善MCAO/R模型大鼠神经功能缺损,减小脑梗死面积,减轻脑组织损伤;体外研究显示丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过HIF-1途径上调mTOR表达,抑制细胞自噬,发挥神经细胞的保护作用。
马岱朝[2]（2021）在《丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究》文中进行了进一步梳理目的:大量研究表明丹参多酚酸可以改善缺血性脑卒中的预后结局,并通过多种药理作用及机制发挥神经保护作用,但其潜在的作用机制有待进一步阐明。小胶质细胞参与脑梗死后的炎症反应,而小胶质细胞中由NLRP3炎症小体及其上游的P2X7受体和下游的GSDMD分子构成的P2X7/NLRP3/GSDMD通路介导脑梗死后的炎症级联反应。本研究建立大鼠大脑中动脉闭塞/再通（MCAO/R）模型和大鼠原代神经元与原代小胶质细胞共培养缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）模型,通过观察丹参多酚酸的注射剂型注射用丹参多酚酸盐（SAFI）对MCAO/R模型神经功能评分、梗死体积、神经元凋亡、炎症因子表达及OGD/R模型中神经元细胞活力与凋亡的影响,并且观察SAFI对MCAO/R模型脑皮质及OGD/R模型中小胶质细胞中P2X7/NLRP3/GSDMD通路中相关分子的表达的影响,旨在探讨SAFI通过抑制小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路对实验性脑缺血再灌注（I/R）损伤的神经保护作用及分子机制。材料与方法:1.SAFI对MCAO/R模型大鼠神经保护作用（1）将58只SD大鼠随机分为2部分,第一部分大鼠随机分2组:I/R组（MCAO/R+生理盐水）,I/R+SAFI组（MCAO/R+SAFI）,于术后第1至第7天每天进行一次神经功能评分,于术后第7天获取脑组织测量梗死体积。实验第二部分动物随机分为四组:Control组（假手术+生理盐水）,SAFI组（假手术+SAFI）,I/R组（MCAO/R+生理盐水）,I/R+SAFI组（MCAO/R+SAFI）,该部分大鼠3天后取脑用于组织学（HE、免疫组化、TUNEL、荧光染色）检测及RT-PCR及western blot检测。（2）使用尼龙线由颈外动脉插入至大脑中动脉（MCA）阻断MCA血供引起供血区域缺血损伤,封堵120分钟后拔出尼龙线恢复血流,建立MCAO/R模型。通过观察MCAO/R模型大鼠梗死体积、神经功能评分、HE染色组织病理,免疫组织化学检测炎症因子表达、TUNEL检测神经细胞凋亡情况,评估SAFI对大鼠缺血再灌注损伤的神经保护作用。2.SAFI对经OGD/R处理的神经元细胞活力与凋亡影响的研究（1）取新生SD乳鼠分离提取原代神经元细胞及原代小胶质细胞,免疫荧光检测神经元标记物MAP2的表达鉴定神经元,免疫荧光检测小胶质细胞标记物CD11-b的表达鉴定小胶质细胞。MTT法检测不同浓度SAFI对OGD处理的大鼠原代神经元细胞和原代小胶质细胞的细胞活性筛选SAFI最佳药物浓度。（2）根据细胞类型,分为单纯神经元培养组与小胶质细胞+神经元共培养组。单纯神经元培养组分为三个亚组:Neuron组（神经元正常条件下培养）,Neuron+OGD/R组（神经元行OGD/R处理）,Neuron+OGD/R+SAFI组(神经元行OGD/R及SAFI处理。处理方法:在Neuron+OGD/R+SAFI组,将原代神经元接种于培养板中,给予SAFI预处理24 h,将培养换至无葡萄糖的DMEM于95%N2+5%CO2环境中（培养液含同浓度SAFI）培养3h,接着将细胞于正常培养条件下继续培养24h后收集细胞用于检测;Neuron+OGD/R组不加SAFI,培养条件同前;Neuron组不加SAFI于正常培养条件下培养。小胶质细胞+神经元共培养组分为三个亚组:Neuron+Microglia组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养）,Neuron+Microglia+OGD/R组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理）,Neuron+Microglia+OGD/R+SAFI组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R及SAFI处理）。处理方法:在Neuron+Microglia+OGD/R+SAFI组,将原代小胶质细胞和原代神经元细胞利用Transwell共培养体系培养。神经元细胞接种于下室,小胶质细胞接种于上室,用SAFI于正常培养条件下预处理24 h后,将细胞换至无葡萄糖的DMEM（含相同浓度的SAFI）于95%N2及5%CO2环境中,37℃培养3 h构建OGD模型,于正常培养条件下继续培养24 h后,收集神经元细胞及培养基用于检测;Neuron+Microglia+OGD/R组不加SAFI,培养条件同前;Neuron+Microglia组不加SAFI于正常培养条件下培养。（3）经OGD/R处理细胞,通过检测培养基中LDH水平反映细胞受损程度,通过CCK-8法检测各组神经元细胞的活力,采用流式细胞术检测神经元细胞的凋亡等方法,来观察SAFI对单纯培养及与小胶质细胞共培养的神经元的保护作用。3.SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型小胶质细胞NLRP3炎症小体激活与焦亡相关蛋白GSDMD影响的研究（1）动物造模及分组同上。将共培养细胞分为4组:分别为Control组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养）,SAFI组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养并加入SAFI）,OGD/R组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理）,OGD/R+SAFI组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理且加入SAFI干预）。（2）将体外培养的原代小胶质细胞和体外培养的大鼠原代神经元细胞利用Transwell共培养体系培养,神经元细胞种于下室,小胶质细胞接种于上室,用50ug/ml浓度的SAFI于正常培养条件下预处理24 h,后将细胞换至无葡萄糖的DMEM（含相同浓度的SAFI）于95%N2+5%CO2环境中,37℃培养3 h构建OGD模型,于正常培养条件下继续培养24 h后收集神小胶质细胞。OGD/R组不加SAFI,培养条件同前。SAFI组加SAFI于正常培养条件下培养。Control组不加SAFI于正常培养条件下培养。（3）构建MCAO/R模型及小胶质细胞OGD/R模型后,采用免疫荧光法观察皮质小胶质细胞NLRP3的表达情况,采用western blot法检测脑组织中及培养的小胶质细胞中NLRP3炎症小体激活与焦亡相关蛋白GSDMD表达及裂解的水平,采用RT-PCR检测脑组织中及培养的小胶质细胞中NLRP3炎症小体相关的m RNA表达和GSDMD的m RNA表达水平。（4）采用尼日利亚菌素和尿酸单钠作NLRP3炎症小体激活剂,在培养小胶质细胞后加入脂多糖激惹细胞,用PBS洗脱脂多糖后以SAFI处理细胞,然后以尼日利亚菌素或尿酸单钠在无血清培养基中处理细胞,然后裂解细胞后进行western blot检测。4.SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型NLRP3炎症小体激活上游的膜离子通道P2X7表达的影响及SAFI组分与P2X7的分子对接（1）MCAO/R造模及OGD/R模型制备及分组同上。（2）采用RT-PCR、Western blot及免疫荧光方法,观察SAFI对大鼠MCAO/R脑皮质及OGD/R模型中与神经元共培养的小胶质细胞中P2X7表达的影响。（3）采用计算机分子对接方法,从RCSB数据库下载大鼠P2X7的X-ray晶体三维结构文件,通过文献报道获取该蛋白与ATP通过氢键与离子相互作用结合口袋的主要氨基酸残基,运用Discovery Studio4.2软件对蛋白质删除配体处理,利用Auto Dock 4.2.6软件进行加氢、计算电荷、转化格式等处理。从TCMSP数据库、ZINC数据库、Pub Chem数据库获取SAFI主要成分的分子结构。利用Auto Dock软件进行半柔性对接。采用Discovery Studio4.2软件对对接结果进行可视化分析,观察SAFI的主要成分丹酚酸B、丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸及迷迭香酸与P2X7结合的能力。结果:1.SAFI可改善大鼠脑MCAO/R模型神经功能缺损并减小脑梗死体积,并可减轻MCAO/R模型脑组织病理损伤。2.SAFI可减少大鼠脑MCAO/R模型脑皮质炎症因子ICAM-1、IL-1β、IL-18、TNF-α的表达水平,并减少MCAO/R模型皮质神经细胞凋亡。3.SAFI对OGD/R处理的单纯培养及与小胶质细胞共培养神经元的细胞损伤有减轻作用,并可改善细胞活力,且能降低凋亡率。4.在共培养条件下经OGD/R处理,小胶质细胞对神经元有细胞毒性作用,而SAFI可能具有减轻小胶质细胞对神经元的细胞毒性的作用。5.SAFI可以降低大鼠脑I/R损伤后小胶质细胞中NLRP3表达,并可抑制脑I/R损伤后IL-1β及IL-18等促炎性因子的表达。6.SAFI可抑制脑I/R损伤后皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活。7.SAFI可以抑制脑I/R损伤后脑皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞的焦亡相关蛋白GSDMD的裂解。8.SAFI可以降低脑I/R损伤后皮质及OGD/R处理后的小胶质细胞中NLRP3、ASC、caspase1、IL-1βm RNA的表达水平。9.SAFI可降低MCAO/R模型大鼠脑皮质Iba1及P2X7双标阳性的小胶质细胞的数量,并可降低MCAO/R模型大鼠脑皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞中P2X7蛋白及m RNA表达。10.SAFI中的丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸等活性成分可能与P2X7受体具有较好的结合能力。结论:1.抑制炎症反应及减轻神经元凋亡是SAFI治疗缺血性脑卒中发挥神经保护作用的部分药理学基础,抑制炎症反应可能是体现SAFI活血化瘀功效的一个方面。2.SAFI对OGD/R处理的神经元具有直接的和可能通过拮抗小胶质细胞对神经细胞毒性而产生间接的神经保护作用。3.SAFI中的丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸等活性成分可能有拮抗P2X7受体激活的作用。4.SFAI对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,部分原因可能是SAFI可抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡。5.SAFI可能通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路抑制NLRP3炎症的激活及细胞焦亡,缓解下游炎症级联瀑布扩大,从而对实验性脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。
颜思阳[3]（2021）在《基于PINK1/Parkin信号通路探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤保护的作用机制》文中提出脑血管病是全球第一大死亡原因,也是致残的常见原因,具有高死亡率、致残率和复发率的特点。急性脑梗死的目标均为使缺血的脑组织恢复血液供应。然而,快速再灌注对脑功能可产生有害作用。已有研究表明,脑缺血再灌注损伤激活线粒体自噬,而适度的线粒体自噬活化能减轻脑缺血再灌注损伤,故线粒体自噬是脑缺血再灌注损伤干预治疗的重要潜在靶点。本研究着眼于“荣气理论”,从脑梗死荣气虚滞病机探讨脑梗死后线粒体自噬的中医认识。并对基于荣气虚滞理论立方的活血荣络方进行体内、体外实验研究,聚焦于PINK1编码磷酸酶和张力蛋白同源物诱导的假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1）/E3泛素连接酶Parkin（Parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase）信号通路,探讨活血荣络方抗脑缺血再灌注损伤的可能机制。第一部分理论探讨本部分旨在通过结合中西医理论,从荣气虚滞角度探讨荣气气化与线粒体功能的相关性。荣气包含了气、血、津、液等一切精微物质,为精微之源。荣气与脑的生成及生理功能密切相关,其以气化流通为用,内化脑髓神机,外显为各种生理现象。脑梗死荣气虚滞病机以肝肾阴虚、虚风内动、兼夹内生邪气为特征,以脑络阻滞、神不导气、脑髓失充、神机受损为临床表现。作为机体最基本的生命活动,荣气气化功能障碍贯穿了脑梗死发病的始终。从线粒体功能认识荣气虚滞理论,阐述线粒体与荣气在生理、病理方面的一致性,并辨证的从气化失衡角度看待线粒体自噬的调控作用。结合临床典型医案,为脑梗死的治疗提供新的方向。第二部分体外实验目的:采用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞株）,建立氧糖剥夺/复氧糖（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型。探讨活血荣络方含药血清对OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用及可能的机制。方法:采用低氧联合无糖培养基造成PC12细胞缺氧缺糖,然后更换正常培养基复氧复糖的方法构建OGD/R损伤模型。筛选最佳浓度活血荣络方含药血清（HHYXQ）后,以雷帕霉素（Rapamycin,RAP）为阳性对照药,采用线粒体膜电位检测（JC-1）、免疫荧光染色及蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测PINK1/Parkin通路及线粒体自噬相关蛋白的表达。结果:1.Cell Counting Kit-8细胞计数试剂（CCK8）检测及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）测试盒检测结果表明:OGD/R损伤可显着降低PC12细胞存活率、增加LDH漏出率。浓度为10%、15%时,活血荣络方含药血清可显着提高OGD/R诱导损伤的PC12细胞模型存活率（P<0.05或P<0.01）;而5%、10%浓度的含药血清可降低PC12细胞LDH漏出率（P<0.05或P<0.01）,其中含药血清浓度为10%时降低LDH漏出率较KBXQ组明显（P<0.05）,而5%含药血清组LDH漏出率较KBXQ组无明显差异（P>0.05）。2.线粒体膜电位（JC-1）检测:与正常对照组比较,模型组绿色荧光与红色荧光比值明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,提示模型组细胞线粒体膜电位下降;与模型组比较,KBXQ组、H-HYXQ组、RAP组绿色荧光与红色荧光比值显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与KBXQ组比较,HHYXQ组、RAP组线粒体膜电位上调更为显着（P<0.05）;而RAP组线粒体膜电位上调较H-HYXQ组更为明显（P<0.05）。3.线粒体（mitochondrion,Mito）与微管蛋白1轻链3β（LC3B）蛋白免疫荧光共定位分析结果表明,H-HYXQ组及RAP组中皮尔逊相关系数（Rr）及重叠系数（R）较模型组明显增大,提示LC3B-Mito共定位增强。4.线粒体自噬相关蛋白的表达:与正常对照相比,模型组细胞LC3B蛋白表达升高,选择性自噬接头蛋白（p62/sequestosome-1,p62/SQSTM1）、线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOMM20）蛋白表达降低（P<0.01）。与模型组相比,KBXQ组细胞LC3B、p62蛋白表达无明显差异（P>0.05）,但TOMM20蛋白表达降低（P<0.05）;H-HYXQ组、RAP组细胞较模型组LC3B蛋白表达升高（P<0.01）,p62、TOMM20蛋白表达降低（P<0.05或P<0.01）。与KBXQ组相比,H-HYXQ组、RAP组细胞LC3B蛋白表达升高,p62、TOMM20蛋白表达降低（P<0.05）,但RAP组下调TOMM20较H-HYXQ组更为显着（P<0.05）。5.Mito-PINK1-Parkin荧光共定位分析结果表明,H-HYXQ组及RAP组中Rr、R系数均明显增高,提示Mito-PINK1-Parkin共定位增强。6.PINK1/Parkin通路蛋白的表达:与正常对照组比较,模型组PINK1、Parkin蛋白较正常对照组表达上调（P<0.05或P<0.01）,而KBXQ组与模型组相比,PINK1、Parkin蛋白表达无明显差异（P>0.05）;H-HYXQ组及RAP组PINK1、Parkin蛋白表达较模型组、KBXQ组表达上调（P<0.05）;但HHYXQ组与RAP组之间PINK1、Parkin蛋白表达未见明显差异（P>0.05）。结论:活血荣络方含药血清可减轻OGD/R诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与调控PINK1/Parkin通路,增加Parkin蛋白的线粒体转位,上调LC3B,下调p62、TOMM20的蛋白表达,激活线粒体自噬相关。第三部分体内实验目的:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注（Middle Cerebral Artery Occlusion Reperfusion,MCAO/R）模型,探讨活血荣络方对MCAO/R模型大鼠的保护作用及可能的机制。方法:无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方（HXRLF）组和自噬激活剂（RAP）组。模型组、HXRLF组、RAP组采用线栓法建立MCAO/R模型,假手术组仅剥离颈动脉但不插入栓线。HXRLF组于造模前36h开始灌胃给药（11.7g/kg/d）3次,24h/次,假手术组、模型组、RAP组给予等量蒸馏水灌胃;RAP组于再灌注同时腹腔注射给药（1.5mg/kg）,余3组给予等量生理盐水腹腔注射。缺血2h,再灌注24h后,行神经功能缺损评分;2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色、尼氏（Nissl）染色检测各组大鼠脑梗死体积、脑缺血皮质区完整神经元数目;透射电镜观察自噬小体的数目;免疫组织化学技术（Immunocytochemistry,IHC）及WB法检测各组大鼠线粒体自噬相关蛋白p62、LC3B、TOMM20的表达水平,以及WB法检测PINK1/Parkin通路蛋白表达。结果:1.活血荣络方的神经保护作用:与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高,神经功能缺损严重（P<0.01）,而活血荣络方及RAP可显着减轻神经功能缺损（P<0.01）;TTC染色结果表明,活血荣络方及RAP可明显减少MCAO/R模型大鼠脑梗死体积（P<0.01）;同时Nissl染色显示活血荣络方及RAP可显着减少神经元缺血损伤（P<0.01）。2.活血荣络方对MCAO/R模型大鼠线粒体自噬及相关蛋白的调控:电镜下观察,HXRLF组和RAP组双层膜结构自噬小体数量增多;IHC及WB结果表明活血荣络方及RAP可上调LC3B蛋白表达,下调p62、TOMM20蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;但HXRLF组和RAP组相比,观察指标差异不显着（P>0.05）。3.活血荣络方对MCAO/R模型大鼠PINK1/Parkin通路蛋白的调控:WB结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠缺血皮质区组织的PINK1、Parkin蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,HXRLF组、RAP组缺血皮质区组织的PINK1、Parkin蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）;而HXRLF组与RAP组相比,上述蛋白表达无统计学差异（P>0.05）。结论:活血荣络方可能激活脑缺血再灌注损伤模型大鼠PINK1/Parkin信号通路,上调线粒体自噬,减轻神经功能损害,从而发挥神经保护作用。
任婧[4]（2020）在《mmu-miR-124-3p抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡和轴突损伤》文中认为研究背景缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点,严重危害人类健康。目前,临床上治疗缺血性脑卒中的最有效的手段是通过血管内介入取栓或药物溶栓,使梗塞血管再通,恢复脑组织的血氧供给。然而,血流再通引起的缺血再灌注会对脑缺血区造成二次损伤,称之为脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion,CIR）。CIR的机制非常复杂,最新的研究发现,极化为M2型的小胶质细胞能够回输至缺血性脑卒中小鼠脑内能够减少梗死面积,并发现外泌体（exosomes）可能参与了起保护作用,近年来研究发现microRNA（miRNA）在其中发挥了重要的作用。miRNA是长度为20-24个核苷酸的单链结构,与其靶基因mRNA的3’非编码区结合,通过抑制翻译和促进mRNA的降解而抑制靶基因的表达。由于目前对于外泌体来源的miRNA在脑缺血损伤中的作用,尤其小胶质细胞来源的miRNA还知之甚少,我们考虑M2型小胶质细胞释放的exosomes中miRNA是否对CIR诱导的神经元凋亡具有保护作用,是否保护神经元轴突并修复损伤,其作用机制是什么,本论文就这些问题展开研究。目的和意义本研究基于M2型小胶质细胞在CIR中具有的神经保护作用,通过生物信息学分析发现潜在的靶向miRNA-mmu-miR-124-3p,进而验证mmu-miR-124-3p通过抑制ROCK2影响ROCK/pMLC/Caspase3通路从而抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡,同时通过抑制RNF38,抑制神经轴突损伤,为CIR的机制提供新的认识,为CIR的防治提供新的靶点和策略。方法我们利用生物信息学方法,深入分析脑缺血再灌注组与对照组鼠脑组织样本中的差异基因表达,利用脂多糖（LPS）和白介素-4（IL-4）分别构建M1型和M2型小胶质细胞模型,提取和鉴定exosomes,进而提取exosomes中RNA进行大通量实时荧光定量PCR（qPCR array）方法分析,从而筛选出M1型与M2型小胶质细胞BV-2外泌体内含物中差异表达的miRNA。我们使用HT-22细胞构建OGD模型,分析miRNA表达差异,我们选择HT-22细胞构建的OGD模型加入差异表达的miRNA mimics,利用CCK-8试剂盒、LDH试剂盒、流式细胞术,检测细胞生存率、LDH活力和细胞凋亡率的改变。我们利用生物信息学方法和双荧光素酶实验确定ROCK2为mmu-miR-124-3p的靶标,使用Western Blotting方法检测,干预mmu-miR-124-3p后,观察预测通路中相关蛋白的改变,利用生物信息学方法和双荧光素酶实验确定RNF38为mmu-miR-124-3p的靶标,利用PC12细胞构建OGD模型,干预mmu-miR-124-3p后,使用免疫荧光和Western Blotting方法,观察神经轴突再生相关蛋白的改变。结果（1）动物造模后,我们进行皮层组织测序分析发现,在TC RNA-seq测序与AGO结合测序中呈现出200个差异性表达的miRNA与mRNA,筛选结果可知ROCK2 mRNA翻录水平处于离散边缘,通过TC RNA-seq测序,我们发现ROCK2 mRNA在模型组中高表达而在对照组中低表达;通过AGO测序,我们发现ROCK2 mRNA翻录水平在模型组中非结合模式多于结合模式,而对照组相反,提示AGO测序结果与TC RNA-seq结果相符合。测序中我们发现在TC RNA-seq测序中,mmu-miR-124-3p在模型组高表达而在对照组低表达;而在A GO结合能力测序中,我们发现mmu-miR-124-3p在模型组中多数未被结合而低表达,而在对照组中因被结合减少则高表达,mmu-miR-124-3p含量增加抑制能力增强。（2）我们使用流式细胞术检测得M1型小胶质细胞达到86.7%的分型率,M 2型小胶质细胞达到90.3%的分型率。我们提取外泌体后,通过透射电镜鉴定外泌体形态,观察到所得颗粒大小均一,粒径范围集中在100 nm,符合外泌体特征;Western Blotting检测外泌体特征标志物CD63、Tsg101、CD81与Hsp70特异性表达,细胞标志物GAPDH则不表达,提示所得物质为外泌体。（3）我们发现mmu-miR-124-3p在M2型小胶质细胞分泌的外泌体（M2-EXO）中高表达,而在M1型小胶质细胞分泌的外泌体（M1-EXO）中相对低表达;比较非造模和OGD造模情况下HT-22细胞中miRNA的表达,我们发现mmu-miR-124-3p变化不明显,说明在造模条件下自身神经元细胞HT-22的mmu-miR-124-3p不参与或者相对低表达不起保护作用。我们给予100 nM浓度的mmu-miR-124-3p刺激,发现提高了 OGD造模下HT-22神经细胞的生存率,降低了细胞凋亡率。（4）本研究确定了 ROCK2 为 mmu-miR-124-3p 的靶基因。mmu-miR-124-3p通过抑制ROCK2蛋白的表达,从而抑制下游蛋白MMP2、MMP9、pMLC、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3、Cleaved PARP的表达,发挥抑制神经元细胞凋亡的作用。（5）我们验证了 mmu-miR-124-3p mimic可通过抑制RNF38蛋白的表达,促进NREP的释放,影响神经轴突再生相关蛋白β-tubulin-Ⅲ、NF200、GAP43,发挥抑制神经元轴突损伤的作用。结论本研究我们发现M2-EXO可能是通过释放mmu-miR-124-3p发挥逆转OGD后的神经元凋亡作用的,同时证实mmu-miR-124-3p可通过抑制ROCK2蛋白的表达,影响ROCK/pMLC/Caspase3通路而发挥抑制神经元细胞凋亡的作用,并通过抑制RNF38蛋白的表达,促进NREP的释放,影响神经轴突再生相关蛋白β-tubulin-Ⅲ、NF200、GAP43,抑制氧糖剥夺造成的神经元轴突损伤。
邢小卫[5]（2020）在《miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究》文中研究说明研究背景心血管疾病是世界上无论是发展中国家还是发达国家中最常见的死亡原因之一,而这其中急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）首当其冲成为最为凶险、致死致残率最高的一类。虽然我国心血管疾病的预防和救治工作有了很大的改善,但急性心肌梗死的发病率及死亡率仍然在不断上升。再灌注治疗是STEMI患者最有效的治疗措施,可以向缺血区域提供及时有效的能量,从而减少梗死范围、维持心脏收缩功能。但是越来越多的基础和临床研究表明,缺血心肌在恢复血液再次灌注后会导致额外的心肌损伤,如心肌顿抑、心律失常、无复流、心肌坏死等的发生,这种现象称之为心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI）,MIRI 已成为影响再灌注治疗效果和STEMI患者预后的主要因素。既往研究MIRI的机制包括氧自由基学说、钙超载学说、心肌能量代谢障碍学说、细胞凋亡学说等;治疗策略包括非药物干预的方法如缺血预适应、缺血后适应和远程缺血预适应,药物干预方法包括腺苷、心房钠肽、环孢素A、极化液、胰高血糖素样肽-1等。虽然许多细胞实验、动物实验证实上述治疗措施有效,但转化成临床试验的结局确是令人失望的。单一的心脏保护策略对改善缺血再灌注损伤效果不佳,联合多种保护策略或者协同多靶点治疗却很有希望治疗缺血再灌注损伤,因此我们非常有必要进一步深入研究MIRI的分子机制,为我们探索新的诊断、治疗靶点提供依据。越来越多的证据表明缺血再灌注损伤的一种重要病理生理机制是细胞凋亡,细胞调亡是一个需要能量的过程,虽然冉灌注过程给缺血心肌提供赖以生存的氧气和能量,但同时也为细胞凋亡提供了能量。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase家族）在凋亡的执行阶段起主要作用,凋亡是多种Caspase共同完成的,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子促进凋亡过程中的终末剪切酶,有研究表明Caspsase-3在缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的内源性非编码单链小分子RNA,通过结合靶mRNA的3’ UTR区从而降解靶mRNA或抑制其翻译,达到调控基因表达的目的。miRNA在各种细胞功能调控中具有重要作用,例如胚胎发育、细胞凋亡、细胞生长和分化以及肿瘤发生等。研究表明在心血管系统方面,miRNA与心肌梗死、心脏肥大、心肌重塑、心力衰竭和心律不齐等各种心脏病的发病机制有密切关系。miRNA具有细胞和组织特异性,有快速释放的动力学特点,在血清当中相对稳定存在,因此循环miRNA有望用于心血管疾病的早期诊断、危险分层、判断预后甚至治疗。目前miRNA研究颇多,一些研究表明miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用,但在心肌缺血再灌注损伤中的研究仍不成熟。miR-26a-5p作为新近发现的一种miRNA,在多种心血管疾病中存在差异表达。如有研究显示经过miR-26a-5p抑制剂转染的冠心病小鼠模型,分离出的内皮细胞生存力明显下降而凋亡率明显升高。另一项研究表明miR-26a-5p的过表达可以减轻冠状动脉微循环栓塞引起的无复流和心肌坏死。鉴于心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡、冠脉微循环栓塞有着密切的关系,我们推测miR-26a-5p可能通过调节细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。目前,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。我们通过心肌细胞缺氧/复氧模型、小鼠缺血再灌注模型分别在体外、体内模拟了心肌缺血再灌注损伤模型。然后,利用生物实验结合生物信息学方法来探索miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的表达和调控作用,并进一步探讨miR-26a-5p影响缺血再灌注损伤可能的通路和机制,从而为更好的解释心肌缺血再灌注损伤的机制和提供可能的治疗策略奠定实验基础。第一章miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用目的关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制仍未明确阐明,而关于miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤当中的作用尚不清楚。第一章研究的目的是明确miR-26a-5p在细胞缺氧/复氧损伤中的表达水平,分析miR-26a-5p的过表达或抑制对缺血再灌注损伤程度的影响。方法1.生物信息学分析:从GEO数据库中搜索与心肌缺血再灌注相关的miRNAs的大数据,比较分析差异表达的miRNA。2.原代心肌细胞的分离和培养:取2日龄的C57BL/6乳鼠,消毒后开胸取心脏,分离出左心室后剪碎并胰酶消化,应用差速贴壁离心方法纯化心肌细胞,加入DMEM培养基,在37℃培养箱中培养。3.细胞转染:miR-26a-5p模拟物、miR-26a-5p抑制剂及相应对照物利用Lipofectamine█ RNAiMAX Reagent转染至原代心肌细胞中。4.建立心肌细胞缺氧/复氧模型:心肌细胞培养液置换为不含血清、不含糖的DMEM培养基,放置在37℃含5%C02、95%N2的低氧培养箱中缺氧培养4小时,之后置换上含糖、FBS的DMEM培养基并放置在37℃含95%空气和5%C02的培养箱中继续培养心肌细胞2小时,自此,缺氧/复氧（H/R）模型成功建立。5.细胞实验分组5.1实验一分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。5.2 实验二分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。6.MTT法检测心肌细胞活力:各组心肌细胞培养孔中加入MTT、二甲基亚砜后测定心肌细胞存活率。7.流式细胞学技术测定细胞实验中心肌细胞凋亡率。8.实时萤光定量PCR检测各组心肌细胞中miR-26a-5p含量。9.Western Blot实验检测促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达。结果1.GEO网站为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,识别出心肌缺血再灌注相关的miRNAs生物芯片数据,与正常组织对比,做差异分析。发现miR-26a-5p在心肌缺血再灌注组织中表达下调,差异明显（P=0.0004）。2.流式细胞学技术来检测H/R心肌细胞的凋亡率是12.65%,对照组心肌细胞凋亡率为0.71%,差异明显。Western Blot技术检测结果显示H/R心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达量明显高于对照组（P=0.0003）。3.qRT-PCR检测结果显示H/R心肌细胞中miR-26a-5p的含量明显低于对照组（P=0.0003）。4.转染miR-26a-5pmimic后心肌细胞中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染 miR-26a-5pinhibitor 后心肌细胞中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.0001）。MTT检测结果显示与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着增加了心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力;miR-26a-5p表达受抑制后显着降低心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力（P<0.01）。5.流式细胞学技术检测结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着低于对照组,miR-26a-5p mimic组的细胞凋亡率为7.54%,mimic control组的细胞凋亡率为20.86%,差异明显;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着高于对照组,miR-26a-5p inhibitor组的细胞凋亡率为35.89%,inhibitor control组的细胞凋亡率为23.25%,差异明显。Western Blot结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着低于对照组;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着高于对照组（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照组相比,miR-26a-5p在缺氧/复氧细胞中的表达明显下降;心肌细胞凋亡率明显升高。2.在缺氧/复氧心肌细胞模型中,miR-26a-5p的过表达可以通过降低心肌细胞凋亡率来减轻心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以通过增加心肌细胞凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。3.我们的研究结果可能有助于发现心肌缺血再灌注损伤中发生、进展的新机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段。第二章miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区,降解靶基因或抑制其翻译。miRNA具有功能多样性的特点,研究miRNA的靶基因功能较为复杂,近些年随着TargetScan、miRBase等大型miRNA分析数据库的发展,方便了科学家进行miRNA靶基因预测。我们在第一章的研究结果表明,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注细胞中表达下调,且过表达miR-26a-5p可以减轻心肌缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确。本章目的是对miR-26a-5p的靶基因进行预测,研究miR-26a-5p调控心肌缺血再灌注损伤可能的通路机制并进一步验证。方法1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-26a-5p的靶基因进行预测（http://www.targetscan.org/vert72）。2.利用双萤光素酶报告基因检测验证miR-26a-5p与PTEN的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PTEN野生型和突变型的双萤光报告载体pMIR-REPORTTM-PTEN-WT和pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut,分别与 miR-26a-5p 模拟物（miR-26a-5pmimcs）以及阴性对照共同转染心肌细胞,观察各组萤光素酶活性的变化,从而验证PTEN是否是miR-26a-5p的靶基因。3.细胞培养、转染miRNA以及模拟缺氧/复氧模型（H/R）:同第一章。4.细胞实验分组:4.1实验一分组:萤光素酶报告基因检测1.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miR-26a-5p mimics 组。2.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miRNA control 组。3.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miR-26a-5p mimics 组。4.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miRNA control 组4.2实验二分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。4.3 实验三分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。5.qRT-PCR技术检测PTEN基因含量;Western Blot技术检测PTEN/PI3K/AKT蛋白表达量,方法类同第一章。结果1.Targetscan 预测 PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因。2.双萤光素酶报告实验显示与对照组相比,转染了野生型PTEN-3’UTR和miR-26a-5pmimics的萤光素酶活性显着降低（P=0.0003）;而共转染突变型PTEN-3’ UTR和miR-26a-5p mimics组与对照组相比萤光素酶活性无显着性差异（P>0.9999）。结果表明miR-26a-5p可直接与PTEN的3’ UTR作用。3.qRT-PCR检测H/R心肌细胞中PTEN基因含量,结果显示H/R组PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0038）。Western Blot检测H/R心肌细胞中PTEN蛋白表达含量,结果显示H/R组PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P=0.0001）。4.通过心肌细胞转染,分别构建过表达miR-26a-5p组、敲低miR-26a-5p组以及相应对照组,Western Blot检测显示过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的表达水平;相反的,敲低miR-26a-5p显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的表达水平（P<0.001）。结论及意义1.在心肌缺血再灌注过程中,PTEN是miR-26a-5p的靶基因。2.过表达miR-26a-5p可以通过与PTEN的3’UTR结合而负性调控PTEN蛋白表达,PTEN受抑制后反向激活PI3K/AKT通路,达到抗心肌细胞凋亡目的,从而改善心肌缺血再灌注损伤。3.通过研究miR-26a-5p具体调控机制有助于我们更深入的理解缺血再灌注损伤的机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的药物或非药物治疗手段。第三章miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制目的在之前的研究中,我们通过体外实验建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,发现H/R组心肌细胞凋亡率增高,miR-26a-5p在H/R组心肌细胞中表达下降,过表达miR-26a-5p减轻了心肌细胞缺血再灌注损伤。同时发现PTEN是miR-26a-5p的靶基因,miR-26a-5p通过PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤。在这一章中,在小鼠体内心脏实验中,我们进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤是否会有相同的影响。方法1.缺血再灌注损伤小鼠模型的建立:C57BL/6小鼠麻醉后取仰卧位,气管插管后连接动物呼吸机,小鼠四肢通过电极连接到心电图仪。碘伏消毒胸前区后,第三和第四肋间行开胸手术。在左冠状动脉前降支距离左心耳下缘1-2mm处对冠状动脉左前降支进行结扎,发现明显的ST段抬高时表示结扎成功,阻断血流后30分钟,缝合线被释放,冠状动脉重新恢复血流,小鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。在假手术组中,缝线只穿过小鼠的心脏,不进行结扎。2.小鼠心肌转染:构建腺相关病毒AAV9-miRNA载体,8周龄C57BL/6小鼠随机分组后,通过尾静脉注射AAV9-miRNA-26a-5p或AAV9-control构建转染模型。3.动物实验分组3.1实验一分组:1.假手术组（Shamgroup）;2.缺血再灌注损伤组（I/R group）。3.2 实验二分组:1.miRNA control+I/R 组;2.miR-26a-5pmimic+I/R组;3.inhibitor control+I/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+I/R 组。4.TTC-Evans blue双染法检测各组小鼠心肌梗死面积。5.流式细胞学技术测定动物实验中各组小鼠心肌细胞凋亡率。6.实时萤光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-26a-5p、PTEN含量。7.Western Blot 实验检测 cleaved caspase-3、PTEN、PI3K、AKT 的表达。结果1.Evans blue/TTC染色观察I/R组小鼠的心肌梗死面积大于对照组（P=0.0058）。流式细胞学技术显示I/R组小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡率明显高于对照组,I/R组小鼠心肌细胞的凋亡率是40.24%,对照组心肌细胞凋亡率为8.83%,差异明显。Wesetern Blot检测显示I/R组小鼠心肌cleaved caspase-3蛋白含量明显高于对照组（P=0.0015）。2.qRT-PCR方法检测结果显示I/R组小鼠心肌细胞中miR-26a-5p的表达量显着低于正常对照组（P<0.0001）。3.qRT-PCR的方法检测各组转染小鼠心肌中miR-26a-5p的表达,结果显示转染miR-26a-5p mimic小鼠心肌中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染miR-26a-5p inhibitor 小鼠心肌中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.01）。Evans blue/TTC染色观察发现过表达miR-26a-5p显着减少了小鼠心肌I/R后梗死面积,受抑制miR-26a-5p组小鼠心肌I/R后梗死面积显着大于对照组（P<0.05）。4.qRT-PCR检测发现I/R组小鼠心肌PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0080）。Western Blot检测结果显示I/R组心肌组织中PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P<0.0001）。5.Western Blot检测显示在小鼠I/R损伤模型中,与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的蛋白表达水平;相反的,抑制miR-26a-5p组显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的蛋白表达水平,组间差异具有统计学意义（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照相比,缺血再灌注小鼠模型中,心肌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达量升高,缺血再灌注组织中miR-26a-5p的表达明显下降;miR-26a-5p的过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以增加心肌凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。2.体内实验进一步验证了缺血再灌注组织中PTEN基因及蛋白表达量明显升高,PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因;miR-26a-5p 可以通过 PTEN/PI3K/AKT 通路调控心肌缺血再灌注损伤。3.我们体内实验的研究结果进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤的调控作用和机制,为开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段提供实验基础。
张华朋[6]（2020）在《PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究》文中提出研究背景脑卒中（cerebral stroke）是各种诱发因素导致脑内动脉闭塞、破裂而造成脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病,分为缺血性、出血性两种。脑卒中作为世界上致死率最高的疾病之一,全球每年新发病例高达1030万,且近来有年轻化的趋势,给社会、家庭和患者带来极大的负担。更严重的是,许多其他疾病会直接或间接导致脑卒中的发生。例如糖尿病就是引起脑血管疾病的独立危险因素,据国外资料显示,有糖尿病史患者同时患脑血管疾病的概率达到了 30～40%,而且糖尿病合并脑卒中的患者已经达到非糖尿病患者的2倍以上。临床上糖尿病合并脑卒中的患者中缺血性脑卒中占到了 80%,糖尿病并发卒中的发病率快速上升。因此如何设计和开发安全有效的脑卒中治疗药物,尤其是糖尿病脑卒中是一个亟待解决的问题。众多研究资料表明,吸入性麻醉药预处理或后处理可以保护神经系统减轻缺血性损伤。有学者发现七氟烷预处理能够减少动脉阻塞导致的脑梗死体积和凋亡细胞。许多脑缺血再灌注损伤动物模型实验证明,七氟烷预处理可以有效减少神经细胞的凋亡、一定程度改善脑梗死体积、神经功能评分、炎性反应等方面从而保护脑神经。但我们并不清楚糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用,且七氟烷发挥作用的机制也有待研究。有学者发现糖尿病大鼠通过恢复海马突触功能和Na+,K+-ATP酶的活性提高学习和记忆能力,机制可能与PI3K/Akt信号通道有关;Yang和同事发现利拉鲁肽可以激活糖尿病大鼠PI3K/Akt信号通道,促进自噬,最终对慢性2型糖尿病相关的学习记忆障碍提供保护;另有研究已经证实糖尿病大鼠大脑皮层细胞中PI3K/Akt信号通道相关蛋白的表达量明显下降。因此,有必要进行七氟烷对糖尿病大鼠脑缺血后神经损伤影响的研究,以期发现七氟烷后处理对脑缺血再灌注糖尿病大鼠神经功能损害是否有效,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制,为后期降低糖尿病人群脑缺血后神经功能损害及促进脑卒中后神经功能恢复提供理论依据。研究目的本文通过构建脑缺血合并糖尿病大鼠模型,评估七氟烷后处理对合并糖尿病的大鼠在脑缺血再灌注后,脑组织损伤程度及氧化应激和细胞凋亡的影响,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制做初步探究。研究方法1.研究对象及分组:健康Wistar大鼠288只,体重（260±30）g。大鼠饲养于室温20±2℃,相对湿度50%～70%的清洁环境中,自由摄食、摄水,适应性饲养一周后,进行实验分组和脑缺血糖尿病模型制备。首先取其中240只大鼠随机分为6组（每组40只）,正常组（Control）:不做处理;糖尿病组（DM）:选取糖尿病造模成功后大鼠;脑缺血模型组（CI）:采用线栓法将健康大鼠大脑中动脉血流阻断2h后恢复灌注;糖尿病脑缺血模型组（DMCI）:阻断糖尿病大鼠大脑中动脉血流2h后恢复灌注;七氟烷后处理组（SCI）:健康大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min;糖尿病七氟烷后处理组（SDMCI）:糖尿病大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min。Control、DM、CI和DMCI组大鼠均在再灌注开始时给予100%氧气,持续30 min,大鼠再灌注24h后进行相应指标检测。2.建立糖尿病和脑缺血大鼠模型:大鼠高脂高糖饮食,喂养5周后,腹腔注射STZ（链脲佐菌素,Streptozotocin,溶解于柠檬酸缓冲液中,25mg/kg）每天一次,连续2d。72h后尾静脉采血测空腹血糖,以血糖≥16.7mmol/L,并出现多食、多尿、多饮为大鼠糖尿病模型成立。脑缺血大鼠模型构建方法:大鼠术前12h禁食。腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,仰卧位固定,手术暴露右颈总动脉,在分叉处分离颈内动脉和颈外动脉,用4/0尼龙线阻断大脑中动脉,2h后抽出尼龙线,开放大脑中动脉,恢复缺血区灌注。模型成功建立的标志是:大鼠手术后清醒,左侧肢体出现偏瘫,以左上肢较为明显;提尾悬挂时左上肢呈现蜷缩屈曲;下地行走时向左侧转圈跌倒,不能正常直行。3.LY294002脑室内注射给药:为了研究七氟烷治疗脑缺血再灌注中PI3K/Akt通道的作用,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预处理七氟烷治疗组大鼠。取其余48只大鼠,将大鼠分为6组（每组8只）,分别构建正常脑缺血加生理盐水组（NS-CI）、糖尿病合并脑缺血加生理盐水组（NS-DMCI）,七氟烷后处理脑缺血加生理盐水组（NS-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加生理盐水组（NS-SDMCI）、七氟烷后处理脑缺血加抑制剂组（LY-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加抑制剂组（LY-SDMCI）大鼠模型。术前将LY294002溶于二甲基亚砜（DMSO）和乙醇中,终浓度为10mM。将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg,腹腔给药）麻醉。LY-SCI组和LY-SDMCI组在建立缺血模型术前30min,在缺血侧脑室注射10μl LY294002溶液,其他组大鼠麻醉后侧脑室注射10μl生理盐水作为对照。NS-SCI组、NS-SDMCI组、LY-SCI组、LY-SDMCI组缺血2h后恢复灌注时给予给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min:NS-CI组、NS-DMCI组再灌注开始时给予100%氧气,持续30min。4.指标检测:对于神经功能评估,采用Longa的5级4分法,在动物麻醉清醒后24h进行评分并记录神经功能缺失症状;对于脑梗塞体积评估,采用TTC染色法并利用ImageJ软件进行计算;通过计算脑组织干/湿重比值评估大鼠脑水肿程度;对于大鼠大脑组织形态学变化,采用HE染色在光学显微镜下进行观察;对于大鼠神经学习能力的检测,采用Morris水迷宫实验进行测定;对于大鼠血清中的 S100B、Bcl-2、Bax、GSH-PX、Caspase-3 和 SOD 的含量,采用 ELISA试剂盒进行检测;对于大鼠血清中NOS活性和NO含量,采用比色法进行检测;western blot检测脑组织中PI3K/Akt通道相关蛋白的磷酸化水平。5.统计学方法分析:应用SPSS19.0统计学软件对各项检测数据进行数据分析,所有分析数据结果均以均数±标准差（mean±SD）表示,两组间数据分析采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）,事后分析采用LSD-t检验,两组间数据采用双变量Pearson进行相关性分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.七氟烷后处理可以减弱大鼠缺血性脑损伤。各脑缺血组大鼠与Control组相比脑梗死体积、Longa神经缺陷评分和脑含水量均增加（P<0.05）,且DMCI组大鼠的上述指标较CI和DM组大鼠有进一步增加（P<0.05）。七氟烷治疗降低了 SCI和SDMCI组的脑梗死体积、Longa分值和脑含水量（P<0.05）。结果表明七氟烷后处理减弱了 SCI和SDMCI组大鼠的缺血性脑损伤,对神经系统有保护作用。2.七氟烷后处理能改善脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。利用Morris水迷宫来评估大鼠的空间学习和记忆功能,结果显示与Control组相比,其他脑缺血组别的大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数显着降低（P<0.05）。而相比于CI和DMCI组,再灌注开始时吸入七氟烷的大鼠（SCI组和SDMCI组）逃避潜伏期时间明显减少,穿越平台次数显着增加（P<0.05）,并且可以在更短的时间内在导航测试中找到平台（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷后处理改善了脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。3.七氟烷后处理减轻了脑缺血糖尿病大鼠的脑组织形态学损伤。HE染色结果显示,对照组的大鼠脑组织由健康神经细胞组成,没有细胞肿胀、膜起泡、核浓缩、破碎溶解。与Control组和DM组相比,CI组的大鼠脑组织切片显示出坏死,神经元丢失,核固缩,神经元收缩和星形细胞肿胀。此外,与CI组相比,DMCI组显示出更严重的损伤。经过七氟烷后处理后,SCI组和SDMCI组的大鼠的组织损伤有明显的改善。4.七氟烷后处理减少脑缺血糖尿病大鼠的氧化应激反应。为了探究七氟烷的神经保护作用是否与其抗氧化特性有关,我们检测了内源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,以及NOS和NO的水平。与Control组相比,CI组的SOD和GSH-PX水平降低（P<0.05）,而DMCI组中二者表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组中SOD和GSH-PX含量明显增加（P<0.05）。七氟烷可以显着增加SCI和SDMCI组的大鼠的SOD和GSH-PX的表达。另一方面,NOS和NO的表达水平在CI组中有所增加（P<0.05）,并在DMCI组中进一步增加（P<0.05）,但经七氟烷后处理二者的表达水平显着降低（P<0.05）,这些结果表明七氟烷可以防御SCI和SDMCI组中大鼠的氧化损伤。5.七氟烷后处理可减弱脑缺血糖尿病大鼠脑组织的细胞凋亡。缺血再灌注后,血清中促凋亡因子Bax和Caspase-3在CI和DMCI组中的表达上调（P<0.05）,但在七氟烷治疗组中表达下调（P<0.05）。另一方面,抗凋亡因子Bcl-2的表达水平在CI组相比于Control组有所降低（P<0.05）,在DMCI组中Bcl-2的表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,七氟烷可以显着提高Bcl-2的表达（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷通过在脑缺血大鼠脑组织中抑制细胞凋亡来减轻缺血性脑损伤。6.七氟烷后处理组大鼠的S100B蛋白水平显着降低。相比与对照组,各脑缺血组大鼠血清中S100B的浓度显着升高（P<0.05）,且DMCI组S100B的含量高于CI组和DM两组（P<0.05）,表明合并糖尿病可以加重大鼠缺血后再灌注造成的脑损伤。经七氟烷吸入治疗后,与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组的S100B水平明显降低（P<0.05）。7.S100B蛋白水平与氧化损伤指标的相关性分析显示:S100B蛋白表达量与Longa神经功能缺陷评分、脑梗死体积、含水量、NOS、NO、Bax和Caspase-3呈正相关（P<0.01）,与SOD、GSH-PX和Bcl-2呈负相关（P<0.01）。说明血清S100B可以作为评价大鼠脑缺血损伤的可靠指标,提示七氟烷后处理可以减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤程度。8.七氟烷后处理显着增加PI3K/Akt通道活性。Western blot实验结果显示脑缺血大鼠中PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平与Control组相比明显降低（P<0.05）,DMCI组大鼠p-PI3K、p-Akt的含量低于CI组和DM组（P<0.05）。而与CI和DMCI组相比,用七氟烷后处理后,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比例明显增加（P<0.05）。表明七氟烷可能通过PI3K/Akt信号通道的激活来发挥作用。9.阻断PI3K/Akt信号通道可以减弱七氟烷对氧化应激和凋亡的保护作用。用PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射大鼠,检测血清中氧化应激和细胞凋亡相关因子水平的变化。七氟烷可以使脑缺血和糖尿病合并脑缺血的大鼠血清促凋亡因子Bax、Caspase-3水平降低（P<0.05）,并可以使凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白含量升高（P<0.05）;当同时用LY294002处理大鼠后,七氟烷的作用变得不明显,血清Bax、Caspase-3、Bcl-2的含量与处理前变化不大（P<0.05）。类似地,脑缺血与糖尿病合并脑缺血的大鼠再灌注开始时吸入七氟烷可以改善缺血引起的抗氧化因子SOD和GSH-PX水平下降（P<0.05）,使它们的表达量大幅度升高;且代表氧化程度的NOS和NO水平与未经七氟烷处理的大鼠相比较也有所下降（P<0.05）。而LY294002的引入减弱了七氟烷的这种治疗效果,使血清SOD、GSH-PX、NOS和NO的含量均接近未吸入七氟烷治疗的缺血再灌注大鼠（P<0.05）。说明阻断PI3K/Akt信号通道可以抑制七氟烷的治疗效果,进一步验证了七氟烷是通过激活PI3K/Akt通道发挥保护作用。结论七氟烷后处理可显着改善糖尿病大鼠缺血再灌注时造成的脑损伤并很可能通过激活PI3K/Akt信号通道,抑制脑神经元细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡从而发挥对大鼠脑缺血性神经损伤的保护作用。
李嘉惠[7]（2020）在《TAOK1通过降低细胞凋亡和促炎症因子介导MCAO引起的大鼠缺血性脑梗死》文中进行了进一步梳理研究背景:脑梗死是威胁人类身心健康的主要疾病之一。随着神经影像诊断技术在新生儿领域的广泛应用,新生儿脑梗死（Neonatal cerebral infarction,NCI）的发病率和诊断率逐渐增高。据统计,新生儿缺血性脑梗死的发病率约为1/2300～4000。多种新生儿疾病均可引起脑梗死,如新生儿缺氧缺血性脑病、中枢神经系统感染、红细胞增多症、脑血管发育畸形等。脑梗后可遗留脑瘫、癫痫、认知障碍、视听功能障碍等,严重影响远期预后,给家庭和社会造成巨大负担。治疗方面,由于新生儿神经系统独特的生理病理特点,许多成熟应用于成人或儿童的治疗方法,如组织纤溶酶原激活剂（t-PA）溶栓治疗,在新生儿中应用的安全性和有效性尚不明确。迄今为止,新生儿脑梗死仍以对症治疗为主,缺乏有效的对因治疗手段。大量研究证实,神经干细胞移植具有巨大的治疗潜力。多年来,尽管在了解缺血性脑梗死的潜在机制方面付出了巨大努力,但这在很大程度上仍是未知的。在过去的四十年里,各种各样的动物脑梗模型已经被开发出来,目的是明确发生脑缺血的机制和开发新的治疗药物。在哺乳动物中,神经干细胞主要分布在腹侧区（VZ）、室下区（SVZ）、纹状体、齿状回、脊髓等部位。其中,SVZ是产生新神经元的主要区域。大量的研究采用腔内缝合MCAO（middle cerebral artery occlusion）模型的SVZ来探讨缺血性脑梗死的潜在机制和治疗方法。大脑中动脉（middle cerebral artery,MCA）及其分支是缺血性脑梗死最常见的脑血管,约占梗死体积的70%。闭塞该动脉最接近人类缺血性脑梗死的表现。MCAO模型有几个优点:首先,创伤小,不需要开颅手术,因此相对容易执行,且不耗时;并且具有梗死体积大、重复性高的特点;此外,再灌注和缺血时间是可以精确控制的。MCAO模型被认为适合于复制缺血性脑梗死及随后的神经元死亡、脑炎症和血脑屏障（BBB）损伤,并在行为测试中产生良好的结果。因此,我们选择利用MCAO方法制作大鼠缺血性脑梗死模型,并检测各项生理指标,以确定建模是否成功,进而利用该模型探讨缺血性脑梗死的分子机制。TAOKs（Thousand and one kinases）是重要的生发中心激酶（Ste20p）类亚家族成员之一,由TAOK1、TAOK2和TAOK3组成。Ste20p家族含有多种蛋白质激酶,其中一些己经被证明作用于MAPKs的上游。TAOKs激活MAPK信号通路。TAOK1和TAOK2也通过激活JNK-MAPK和caspases诱导凋亡形态学改变。其他研究表明TAOK1通过激活微管亲和调节激酶（MAR/PAR-1）和微管相关蛋白tau的磷酸化诱导微管不稳定性,TAOKs在有丝分裂过程中被磷酸化和特异性激活。此外,TAOK1参与P38和c-Jun NH2末端激酶（JNK）对DNA损伤和应激刺激的激活。TAOK1还可通过直接磷酸化T195来抑制细胞增殖,从而调节Hippo信号通路在发育中的作用。另有研究发现TAOK1在IL-17介导的信号和炎症中起负调节作用。TAOK1抑制IL-17诱导的炎性细胞因子和趋化因子的表达。TAOK1抑制HeLa细胞中IL-17激活的p38、JNK、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p65。TAOK1与IL-17RA相互作用,以激酶活性无关的方式抑制IL-17RA-Actl复合物的形成,导致IL-17介导的炎症反应的负调控。然而,TAOK1是否在缺血性脑梗死的神经细胞凋亡和炎症反应中起作用还尚不清楚。研究方法:采用大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）建立缺血性脑梗死动物模型;用氧葡萄糖联合剥夺技术（OGD）处理大鼠皮层神经干细胞建立缺血性脑梗死细胞模型;采用Bederson和Zea-Longa神经功能缺损评分及转轮试验对模型动物进行验证;用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测TAOK1在体内外模型中的表达;通过过表达TAOK1或shRNA干扰TAOK1的表达检测TAOK1在缺血性脑梗死体内和体外模型中对细胞增殖（CCK-8）,凋亡（TUNEL染色,AnnexinV及Hoechst33342染色）及炎症因子（IL-lβ,IL-6和IL-8）表达的作用;检测PI3K/AKT和MAPK信号通路在TAOK1介导的神经干细胞增殖,凋亡和炎症因子表达中的作用。研究结果:我们利用SD大鼠制作了 MCAO模型以模拟缺血性脑梗死。在造模后的24小时进行Bederson/Longa评分对MCAO模型组及假手术组大鼠分别进行评估。MCAO模型组Bederson评分为3分,与假手术组有显着性差异（P<O.001）;Longa评分为3.5分,同样与假手术组有显着性差异（P<0.001）。TTC染色结果显示,MCAO大鼠同侧大脑半球有很大比例的广泛梗死区。在转轮实验中,与假手术组相比,大鼠在平均速度、掉落时间、步行距离和旋转速度方面均表现出明显的运动行为学缺陷（P<0.001）。这些结果提示,我们成功地建立了大鼠缺血性脑梗死模型,并使其出现运动功能障碍。采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测TAOK1在SVZ中的表达。qRT-PCR结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的mRNA表达显着降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的蛋白表达显着下调。免疫荧光染色结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的染色强度明显减弱。此外,我们还通过免疫荧光染色确定了 TAOK1和神经干细胞在脑切片中的分布。我们发现TAOK1和Nestin在MCAO大鼠全脑切片和SVZ中均广泛分布。采用TUNEL法检测MCAO组和假手术组大鼠SVZ脑片的神经干细胞凋亡。结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ脑片的凋亡率显着增加。此外,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8的表达,结果表明,与假手术组大鼠相比,MCAO组大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平显着升高（P<0.01）。采用胎鼠18日龄皮层神经干细胞建立缺血性脑梗死细胞模型。用免疫荧光法检测Nestin、GFAP和Tuj1的染色情况,以证实神经干细胞的纯度,结果显示明显的Nestin阳性信号和GFAP/Tuj1阴性信号,表明培养物中大多数细胞是神经干细胞。然后,我们检测了经OGD处理后神经干细胞中TAOK1的表达。结果表明,与正常神经干细胞相比,经OGD处理的神经干细胞中TAOK1的mRNA和蛋白表达显着降低（与正常组相比,P<0.001）。此外,免疫荧光显示与正常组相比,经OGD处理的神经干细胞中TAOK1的免疫荧光染色显示出明显的减弱信号。为探讨TAOK1对OGD诱导的体外缺血性脑梗死细胞模型的影响,采用shRNA或TAOK1重组质粒在OGD诱导的神经干细胞中敲除或过度表达TAOK1。与正常组相比,OGD组细胞增殖明显受到抑制（P<0.001）;与OGD+NC组相比,TAOK1的敲除（OGD+shRNA）加重了 OGD诱导的细胞增殖抑制作用,而TAOK1的过表达（OGD+TAOK1重组质粒）部分逆转了 OGD诱导的细胞增殖抑制作用（P<0.001）。在细胞周期分析中,与正常组相比,OGD组的细胞数在G0/G1期显着上调,在S期显着下调。OGD+shRNA组细胞数在G0/G1期显着上调,S期显着下调,而OGD+TAOK1组与OGD+shRNA组相比呈相反趋势。TUNEL分析显示,OGD组的细胞凋亡率明显高于正常组,与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组细胞凋亡明显加重,而OGD+TAOK1重组质粒组细胞凋亡率明显减轻。此外,Western blot检测凋亡相关蛋白和细胞周期相关蛋白,结果显示与正常组相比,OGD组Bax、剪切型caspase-3和p-21表达显着上调,而Bcl-2和CyclinD1表达显着下调。与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组Bax、裂解caspase-3和p-21的表达较高,而OGD+TAOK1重组质粒组表达较低;OGD+shRNA组和OGD+TAOK1重组质粒组Bcl-2和CyclinD1的表达与Bax、裂解caspase-3和p-21的表达呈相反趋势。进一步研究发现TAOK1的内源性激酶活性决定了 TAOK1对OGD诱导的细胞凋亡的影响。Western blot结果显示,在OGD诱导的皮层神经干细胞中,TAOK1的过表达介导了 Bcl-2的显着上调、Bax和剪切型caspase-3的显着下调,而在内源性激酶失活后这种作用明显减弱。此外,TUNEL结果显示,内源性激酶失活可阻碍TAOK1过表达介导的凋亡减少。ELISA检测IL-1β、IL-6和IL-8的产生。与正常组相比,OGD处理显着增加了 IL-1β、IL-6 和 IL-8 的产生（P<0.01）。与 OGD+NC 组相比,OGD+shRNA组的IL-1β、IL-6和IL-8表达显着增加,而OGD+TAOK1组的IL-1β、IL-6和IL-8表达显着降低（P<0.05）。OGD组p-AKT和PI3K表达较正常组明显降低。而OGD组p-ERK和p-P38的表达与p-AKT和PI3K呈相反的表达趋势。与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组p-AKT和PI3K表达较低,而OGD+TAOK1组表达较高。然而,p-ERK和p-P38的表达在OGD+shRNA组较高,而在OGD+TAOK1组较低,说明PI3K/AKT和MAPK信号通路参与TAOK1在缺血性脑梗死中的调节作用。结论:我们的研究结果显示在体内外脑缺血缺氧模型中,TAOK1表达明显下调,而细胞凋亡及IL-1β、IL-6和IL-8的表达均上调。在体外细胞模型中,TAOK1部分逆转了 OGD诱导的细胞凋亡和IL-1β、IL-6和IL-8表达的上调。在机制上,PI3K/AKT和MAPK信号通路参与了 TAOK1对缺血缺氧后细胞凋亡及炎症反应的影响。
胡玲[8]（2020）在《探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用》文中研究指明背景:缺血性脑卒中是最常见的死亡和致残原因之一,作为严重威胁人们生命安全和生活质量的疾病,该疾病不仅给家庭带来沉重的负担,社会医疗资源也面临严峻的考验。流行病学的调查研究发现该疾病不仅发病率越来越高,而且呈现越来越低龄化的趋势。临床上对于错过溶栓治疗时间窗的该类疾病患者尚无有效精准的治疗策略。因此,深入研究脑卒中发生发展的机制解决临床问题已经成为神经学科亟待解决的重要课题。近年来,随着对该疾病研究的不断深入,miRNA与脑卒中疾病的相关性逐渐被人们认识。在人类基因中,三分之一的基因表达均受到各物种间具有高度保守性miRNA的调控而参与人体重要的生物调节过程如增殖分化,自噬凋亡等。并且,miRNA在脊椎动物中有一半与其他物种还具有同源性。这些特点为挖掘miRNA与疾病之间的关联性提供了基础,而且快速发展的高通量芯片技术为我们在基因组水平研究与疾病相关的分子机制提供了可能性。鉴于此,我们推断（1）鉴于miRNA在细胞内具有广泛的生物学功能,建模的多条miRNAs共同作用在脑卒中损伤级联中必有重要作用,通过研究缺血性脑卒中多条miRNAs的联合功能,开启了研究脑卒中损伤机制的新方式;（2）筛选小鼠脑缺血模型组中半影区与对照组大脑相同部位miRNA的表达谱,借助生物信息学技术进行数据建模并挖掘出脑缺血相关的特异性表达的miRNAs具有可行性;（3）通过构建miRNAs/mRNA共表达网络、基因位点GO分析和KEGG通路分析及双荧光素酶报告实验系统探讨脑组织缺血区差异表达的基因在脑卒中的机制为发现新的治疗靶点奠定理论基础。目的:本研究利用芯片大数据和先进的数据处理分析方法来建立可靠的脑卒中相关的miRNAs（miR-124/miR-216）关联模型,在此基础上利用生物信息学技术进行系统分析并探讨miRNAs联合体和靶基因的功能定位及与脑卒中发生发展的关联意义;同时运用分子生物学、细胞生物学等技术手段在分子水平、细胞水平、动物水平上揭示mi R-216、miR-124与CADM2之间的相互作用及分子机制,并探索两者之间的相互关系在脑卒中发生发展中的调控作用,进一步完善脑卒中发生发展的分子机制,为临床上脑卒中的防治提供新的治疗靶标。方法:1.第一部分下载GEO数据库中脑缺血再灌注损伤小鼠的miRNAs的芯片数据并对数据进行分析整理;运用Weka软件筛选获得的差异表达基因并构建意义miRNAs协同调控脑卒中进展相关的数据模型;应用生物信息软件挖掘miRNAs的靶基因并采用荧光素酶报告实验验证miRNAs与靶基因的关系。2.第二部分体外构建OGD模型;转染miRNAs的激动剂和抑制剂至各实验组并用CCK-8实验、流式细胞分析技术、基质胶成管实验、PCR法及Western blot检测并分析生物学效应。3.第三部分构建小鼠的MCAO模型获取最佳造模时间;构建慢病毒;利用miRNAs的慢病毒处理各实验组同时进行神经功能评分,TTC,Tunel法,PCR法及Western blot法分别检测及分析细胞凋亡率及基因和蛋白表达等相关生物学效应。结果:1.通过基因芯片数据分析处理获得包括miR-216和miR-124在内的30条与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs;通过体外建模挖掘与脑卒中疾病相关的目标miRNAs（miR-124/miR-216）及潜在作用的共同靶基因CADM2,并且进行了潜在的作用通路和功能分析发现目标miRNAs（miR-124/miR-216）调控靶基因CADM2可能影响脑卒中的进展过程。2.采用小鼠N2a细胞行氧糖剥夺（OGD）处理,在此基础上分别转染和共转染外源性miR-216与miR-124的激动剂和抑制剂予各组检测细胞存活率、细胞凋亡率、成管能力以及相关凋亡通路蛋白表达的表达情况。我们发现mi R-216与miR-124的高表达能增加细胞的存活率,抑制细胞凋亡的发生;当共转染miR-216与miR-124的激动剂后能更显着抑制与脑卒中模型细胞关系密切细胞的凋亡。3.成功构建慢病毒后,基于MCAO模型并转染过表达miR-216/miR-124的慢病毒载体,我们发现转染过表达病毒的小鼠神经功能评分较好,凋亡较少,过表达miR-216/124的小鼠靶基因CADM2降低明显,差异有统计学意义。结论:通过公共数据库的数据挖掘和分析获知30条miRNAs与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs。在此基础上用生物软件建模获悉到意义模型miR-124/miR-216协同调控脑卒中的进展过程,其调控的机制可能与共同靶基因CADM2启动凋亡信号通路相关。从细胞实验和动物实验我们进一步论证发现miR-216/miR-124联合体协同参与调控缺血再灌注小鼠的神经细胞功能,其机制为miR-216/miR-124协同负性调控CADM2使其激活PI3K-Akt信号通路,启动了内源性保护机制改善神经细胞的凋亡,从而达到保护神经细胞的作用。在这里,我们首次利用大数据挖掘和建模发现miRNA-216与miRNA-124能作为脑卒中进展相关的分子标志物模型协同调控其病理过程,并揭示了miRNA-216与miRNA-124以及CADM2之间构成的新的调控脑卒中的分子网络。通过三者的相互作用激活PI3K-Akt信号通路进而启动内源性的脑保护作用,miR-216/miR-124/CADM2/PI3K-Akt信号通路的揭示均是本研究的创新。
彭科[9]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中提出第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
阴雪妍[10]（2020）在《腺苷预处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤后脑内TNF-α和NF-κB表达的影响》文中研究说明背景脑卒中已成为当前我国首位致残致死类疾病,其中缺血性脑血管病更是严重影响国民健康、生活。尽早恢复脑的血供、氧供对降低致残致死率意义非凡,然而,在血供、氧供恢复后可能出现更严重的损伤,即脑缺血-再灌注损伤,它的发生主要包括钙超载、炎症反应等损伤机制,其中炎症反应机制广受关注,作为调节炎症因子转录并引起靶基因表达增加的NF-κB成为研究热点。脑缺血药物预处理是指在脑再灌注损伤之前预先用药物诱导机体形成神经保护,以避免或减轻不可逆性损伤。腺苷作为机体重要的内源性活性物质,其信号传导是通过调节炎症反应、缺血性组织损伤和组织重构实现的。大量实验证实腺苷预处理能有效减轻大鼠脑血-再灌注损伤引起的神经功能缺损症状,完善其脑保护作用的分子机制研究对腺苷早日安全有效应用于临床预防脑缺血-再灌注损伤具有重要意义。目的通过观察腺苷预处理对脑缺血-再灌注损伤后大鼠脑内TNF-α和NF-κB的影响,探讨腺苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤的分子保护机制。方法Sprague-Dawley大鼠60只随机分为假手术组（即用F组表示）、经腺苷预处理的大鼠脑缺血-再灌注组（即用AP组表示）和大鼠脑缺血-再灌注组（即用IR组表示）共3组,每组按照缺血-再灌注后2h、6h、24h、48h四个时间点随机分5只。采用MCAO法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型。通过对以上3组脑缺血-再灌注48h后的大鼠脑组织行头颅MRI、HE染色以及对以上60只大鼠进行神经功能缺损评分,应用积分光密度软件系统通过免疫组织化学方法观察大鼠脑组织中TNF-α和NF-κB的平均积分光密度值来进一步验证腺苷预处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤的脑保护作用,探讨腺苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤的分子保护机制。结果1.F组大鼠术后无神经功能缺损体征,AP组和IR组大鼠术后均出现明显神经功能缺损体征。AP组和IR组大鼠神经功能缺损评分显着高于F组,AP组大鼠经神经功能缺损评分结果提示分数明显比IR组低,且以上实验结果P<0.05,提示差异都具有统计学意义。2.F组大鼠术后MRI中T1WI、T2WI均未见明显异常,AP组和IR组大鼠脑梗死体积显着高于F组,AP组大鼠脑梗死体积显着低于IR组,IR组测量的脑梗死体积为（168.80±17.584）mm3,AP组测量的脑梗死体积为（66.80±7.694）mm3,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.光镜下48h F组大鼠海马区神经细胞排列整齐,神经元结构完整,核染色较淡,尼氏体丰富,神经基质无水肿;IR组神经元呈现坏死改变,结构模糊,胞体肿胀,细胞核和细胞浆界限不清,其周围出现宽大透亮区。在缺血梗死区域旁边的脑组织发生肿胀,神经胶质细胞显着增多,部分神经细胞出现细胞裂解、凋亡。AP组的HE染色改变与IR组相似,但比IR组较轻,细胞结构及组织层次相对完整。4.AP组和IR组术后大鼠脑组织中TNF-α和NF-κB的表达显着高于F组,AP组术后大鼠脑组织中TNF-α和NF-κB的表达显着低于IR组,统计学结果P<0.05,说明差异具有统计学意义。结论腺苷预处理可通过减少大鼠缺血-再灌注损伤后脑内TNF-α和NF-κB的表达来减轻神经细胞损伤,达到其脑保护作用。
二、短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究(英文)（论文提纲范文）
（1）丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 缺血性脑卒中和自噬的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 丹参脂溶性成分及其干预缺血性脑卒中的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床文献研究 |
| 研究一 丹参类中药注射液治疗急性缺血性脑卒中的网状Meta分析 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 研究二 基于网络药理学探讨丹参治疗缺血性脑卒中的作用机制 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗脑缺血再灌注的药效研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 基于DIA和PRM技术丹参酮ⅡA磺酸钠干预MCAO/R模型大鼠缺血半影区蛋白组学分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究五 丹参酮ⅡA磺酸钠对PC12细胞氧糖剥夺/复氧模型的效应及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 注射用丹参多酚酸盐(SAFI)对MCAO/R模型大鼠神经保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 SAFI对经OGD/R处理的神经元细胞活力与凋亡影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型小胶质细胞NLRP3炎症小体激活与GSDMD影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型NLRP3炎症小体激活上游的膜通道P2X7表达的影响及SAFI组分与P2X7的分子对接 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述一 脑梗死后的免疫反应 |
| 参考文献 |
| 综述二 注射用丹参多酚酸盐治疗脑梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）基于PINK1/Parkin信号通路探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤保护的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 基于荣气虚滞理论探讨脑梗死后线粒体自噬的认识 |
| 1 从线粒体功能认识荣气理论 |
| 2 荣气气化异常与线粒体自噬 |
| 2.1 荣气虚与线粒体自噬异常 |
| 2.2 荣气滞与线粒体自噬异常 |
| 2.3 荣气虚脱与生物能量危机 |
| 3 调理气化是缺血性中风的重要治疗方法 |
| 3.1 补益荣气 |
| 3.2 疏导荣气 |
| 3.3 调和荣气 |
| 4 医案举例 |
| 4.1 腔隙性脑梗死案 |
| 4.2 急性脑梗死案 |
| 4.3 短暂性脑缺血发作案 |
| 5 小结 |
| 第二部分 活血荣络方含药血清对氧糖剥夺/复氧糖诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体自噬的影响及作用机制研究 |
| 第一节 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 主要药物 |
| 1.4 主要试剂及耗材 |
| 1.5 主要仪器及设备 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12 细胞株的培养 |
| 2.2 OGD/R模型的建立 |
| 2.3 活血荣络方含药血清的制备 |
| 2.4 大鼠空白血清对PC12 细胞的毒性作用 |
| 2.5 H-HYXQ对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤的存活率的影响 |
| 2.6 H-HYXQ对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤后LDH漏出率的影响 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠空白血清对PC12 细胞的毒性作用 |
| 3.2 H-HYXQ对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型细胞存活率的影响 |
| 3.3 H-HYXQ对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型LDH释放率的影响 |
| 4 小结 |
| 第二节 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体自噬的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 主要药物 |
| 1.4 主要试剂及耗材 |
| 1.5 主要实验仪器及设备 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12 细胞株的培养 |
| 2.2 RAP、Mdivi-1对PC12 细胞的毒性作用 |
| 2.3 RAP、Mdivi-1对OGD/R损伤模型存活率的影响 |
| 2.4 H-HYXQ及RAP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型线粒体膜电位的影响 |
| 2.5 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体-LC3B共定位的影响 |
| 2.6 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型Mito-PINK1-Parkin共定位的影响 |
| 2.7 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体自噬相关蛋白及 PINK1/Parkin通路蛋白表达的影响 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RAP、Mdivi-1对PC12 细胞的毒性作用 |
| 3.2 RAP、Mdivi-1对OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型细胞形态的影响 |
| 3.3 RAP、Mdivi-1对OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型细胞存活率的影响 |
| 3.4 H-HYXQ及RAP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型线粒体膜电位的影响 |
| 3.5 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体-LC3B共定位的影响 |
| 3.6 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型线粒体自噬相关蛋白的影响 |
| 3.7 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型Mito-PINK1-Parkin共定位的影响 |
| 3.8 H-HYXQ及 RAP对 OGD/R诱导的PC12 细胞损伤模型PINK1/Parkin蛋白表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 活血荣络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠线粒体自噬的影响及作用机制研究 |
| 第一节 活血荣络方和自噬激动剂雷帕霉素对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型的神经保护作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药物和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 实验分组及给药 |
| 2.3 神经功能缺损评分 |
| 2.4 脑梗死体积测定 |
| 2.5 脑组织尼氏(Nissl)染色病理形态观察 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 活血荣络方对MCAO/R模型大鼠神经功能缺损评分的影响 |
| 3.2 活血荣络方对MCAO/R模型大鼠脑梗死体积的影响 |
| 3.3 活血荣络方对MCAO/R模型大鼠脑缺血皮质区神经元数量的影响 |
| 4 小结 |
| 第二节 活血荣络方与自噬激活剂雷帕霉素对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型线粒体自噬的影响比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药物和试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 实验分组及给药 |
| 2.3 电镜检测线粒体自噬超微结构 |
| 2.4 Western blot免疫印迹检测 |
| 2.5 免疫组化法检测 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 活血荣络方对MCAO/R模型大鼠脑组织线粒体自噬超微结构的影响 |
| 3.2 再灌注24h各组大鼠脑组织线粒体自噬相关蛋白的表达 |
| 3.3 再灌注24h各组大鼠脑组织PINK1/Parkin通路蛋白的表达 |
| 4 小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 1 活血荣络方的立方思想及组方分析 |
| 1.1 立方思想 |
| 1.2 组方分析 |
| 2 活血荣络方的现代药理学研究 |
| 3 基于PINK1/Parkin信号通路探讨活血荣络方的神经保护作用 |
| 第五部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体自噬在脑缺血/再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）mmu-miR-124-3p抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡和轴突损伤（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 生物信息学分析脑缺血再灌注组与对照组的鼠脑组织样本中的差异基因表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 M2型小胶质细胞来源外泌体的提取和鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 mmu-miR-124-3p抑制神经细胞凋亡 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 mmu-miR-124-3p通过ROCK/pMLC/Caspase3信号通路抑制氧糖剥夺诱导的神经细胞凋亡 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 mmu-miR-124-3p通过RNF38抑制脑缺血后的神经元轴突损伤 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二章 miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三章 miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 创新性与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文全文 |
（6）PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English Paper One |
| English Paper Two |
（7）TAOK1通过降低细胞凋亡和促炎症因子介导MCAO引起的大鼠缺血性脑梗死（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 缺血性脑梗死动物模型的建立 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器,材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCAO大鼠模型的建立及验证 |
| 3.2 MCAO模型出现运动功能障碍 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 在大鼠缺血性脑梗死模型中TAOK1表达降低 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器,材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 主要实验材料及主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCAO大鼠室下区(SVZ) TAOK1表达降低 |
| 3.2 MCAO后细胞凋亡和炎症反应增强 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 TAOK1调节体外缺血性脑梗死模型中神经干细胞的增殖、凋亡和炎症反应 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器,材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料和主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经干细胞氧葡萄糖联合剥夺(OGD)后TAOK1表达显着降低 |
| 3.2 TAOK1的过表达部分抑制OGD诱导的细胞凋亡 |
| 3.3 TAOK1的激酶活性参与OGD诱导的细胞凋亡 |
| 3.4 过表达TAOK1部分逆转OGD诱导的IL-19、IL-6和IL-8的上调 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 PI3K/AKT信号通路参与TAOK1对缺血性脑梗死的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器,材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PI3K/AKT信号通路参与TAOK1对缺血性脑梗死的调节作用 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 结论与不足 |
| 综述 新生儿缺血性脑梗死研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（8）探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非编码RNA与脑卒中的关系及研究进展 |
| 1.3 本课题的研究内容 |
| 技术路线图 |
| 第2章 大脑中动脉闭塞小鼠的MIRNAS芯片数据挖掘建模及数据验证 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 选用数据库下载脑卒中相关的mi RNAs芯片数据 |
| 2.2.2 mi RNAs数据分析及建模软件 |
| 2.2.3 筛选mi RNAs的靶基因及富集分析软件 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告验证实验的材料 |
| 2.3 研究方法与内容 |
| 2.3.1 下载缺血性脑卒中基因芯片数据及预处理 |
| 2.3.2 脑卒中进展相关的意义mi RNAs数据建模 |
| 2.3.3 脑卒中差异表达mi RNAs的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 2.3.4 双荧光素酶实验验证建模的意义mi RNAs与靶标基因的关系 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 标准化处理脑卒中进展相关的mi RNAs芯片数据 |
| 2.4.2 脑卒中进展相关的意义miRNA数据筛选及建模 |
| 2.4.3 预测脑卒中差异表达mi RNAs模型的靶基因及生物信息学分析 |
| 2.4.4 双荧光素酶报告实验验证意义mi RNAs与靶基因的关系 |
| 2.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 MIR-216/124对小鼠氧糖剥夺再灌注损伤N2A细胞的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 小鼠神经母瘤细胞(N2a细胞)的培养 |
| 3.3.2 细胞的转染及OGD模型建立、实验分组 |
| 3.3.3 CCK-8法检测细胞存活率 |
| 3.3.4 细胞成管能力的检测 |
| 3.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡状态 |
| 3.4 数据处理及统计分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 N2a细胞转染mi R-216/124 mimics/inhibitor后的有效性检测 |
| 3.5.2 转染miR-216/124模拟物或抑制物对N2a细胞活力的影响 |
| 3.5.3 mi R-216、mi R-124 对细胞成管能力的检测 |
| 3.5.4 流式细胞术检测mi R-216、mi R-124对N2a细胞凋亡的影响 |
| 3.5.5 mi R-216与mi R-124 对靶基因CADM2 及细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影响 |
| 3.5.6 mi R-216、mi R-124 抑制氧糖剥夺诱导的N2a细胞凋亡与PI3K/AKT信号通路相关 |
| 3.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 MIR-216/124对小鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用及其机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 研究方法 |
| 4.3.1 构建小鼠脑缺血的适宜再灌注时间 |
| 4.3.2 制备miR-216/124过表达慢病毒 |
| 4.3.3 小鼠正式实验及Zea Longa神经功能评分 |
| 4.3.4 脑片TTC染色评价脑梗死体积的变化 |
| 4.3.5 TUNEL法检测缺血脑组织中细胞凋亡情况 |
| 4.3.6 实时定量PCR检测缺血脑组织中mi RNA/靶基因的表达 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 选择小鼠脑缺血的适宜再灌注时间 |
| 4.5.2 评估miR-216/124慢病毒 |
| 4.5.3 小鼠Zea Longa神经行为学评分 |
| 4.5.4 脑片TTC染色评价脑梗死体积的变化 |
| 4.5.5 TUNEL法检测缺血脑组织中细胞凋亡情况 |
| 4.5.6 实时定量PCR检测缺血脑组织中mi RNA及 CADM2 的表达 |
| 4.5.7 Western Blot检测缺血脑组织中CADM2 的表达量 |
| 4.6 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（9）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论和展望 |
| 综述 (第一部分)心肌缺血再灌注损伤和右美托咪定心肌保护作用的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 (第二部分)A systematic Review: Effects of Perioperative Dexmedetomidine Use on Postoperative Mortality and Major Morbidity in Adult Patients Who undergo Cardiac and Non-cardiac Surgery |
| References |
| 附录 |
| 个人简历及博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）腺苷预处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤后脑内TNF-α和NF-κB表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述:腺苷预处理治疗脑缺血再灌注损伤炎症因素相关研究综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究(英文)（论文参考文献）
- [1]丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究[D]. 王哲义. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究[D]. 马岱朝. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]基于PINK1/Parkin信号通路探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤保护的作用机制[D]. 颜思阳. 湖南中医药大学, 2021(02)
- [4]mmu-miR-124-3p抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡和轴突损伤[D]. 任婧. 南方医科大学, 2020(06)
- [5]miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究[D]. 邢小卫. 山东大学, 2020(08)
- [6]PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究[D]. 张华朋. 山东大学, 2020(10)
- [7]TAOK1通过降低细胞凋亡和促炎症因子介导MCAO引起的大鼠缺血性脑梗死[D]. 李嘉惠. 山东大学, 2020(12)
- [8]探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用[D]. 胡玲. 武汉科技大学, 2020(01)
- [9]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
- [10]腺苷预处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤后脑内TNF-α和NF-κB表达的影响[D]. 阴雪妍. 新乡医学院, 2020(12)