一、Effect of HDL and apo AI on PGE_2 Production by Monocyte-Derived Macrophages（论文文献综述）
李特[1]（2021）在《Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展》文中研究指明背景:目前部分研究提示磷酸酶肌动蛋白调控因子1（Phactr1）的遗传变异与动脉粥样硬化性心血管疾病相关,然而Phactr1是如何影响动脉粥样硬化的进展以及其相关机制尚未明确,需要进行深入研究及探讨。因此,明确Phactr1的作用机制及其影响将促进我们对动脉粥样硬化的进一步理解,根据相关研究结果,可能会发现治疗动脉粥样硬化疾病的新靶点。基于上述原因,深入研究其作用机制是一项具有重要临床意义的课题。目的:深入了解Phactr1在斑块稳定性中的作用,探讨Phactr1在动脉粥样硬化中潜在的作用机制,在Phactr1缺陷小鼠中对ox-LDL诱导的巨噬细胞极化,炎症反应和泡沫细胞形成进行研究。方法:应用Apoe基因敲除小鼠(Apoe-/-)、Phactr1全基因敲除小鼠(Phactr1-/-)、Apoe和Phactr1双基因敲除小鼠(Phactr1-/-Apoe-/-,DKO)及KLF4δMC过表达、Apoe、Phactr1基因敲除小鼠(KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-)建立动脉硬化模型,给予八周大雄性DKO和Apoe-/-小鼠高脂饮食（16%的脂肪和1.3%的胆固醇）,持续16周,对总甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）进行测定。对小鼠血管组织进行染色后评估细胞内脂质含量、斑块的形态、斑块的负荷、坏死面积以及纤维帽厚度。通过定量RT-PCR检测小鼠巨噬细胞中Phactr1 m RNA的表达。通过定量RT-PCR及ELISA分析对小鼠炎症反应程度（TNF-α和IL-6）进行评估。通过BM移植策略评估造血Phactr1缺乏对动脉硬化的影响。通过定量RT-PCR对TNF-α、IL-6、Arg1、CD206及KLF4的表达进行检测。同时,我们应用免疫印迹和定量分析检测LOX-1,SR-A,CD36,ABCA1、ABCG1及KLF4的蛋白质表达情况。用免疫印迹分析p38MAPK和CREB的磷酸化情况。通过双重荧光素酶报告基因测定系统对CREB反应元件的荧光素酶活性进行检测。结果:（1）Phactr1荧光强度在晚期动脉粥样硬化斑块中较强,并且主要在Mac2阳性细胞中表达,晚期病变的Apoe-/-小鼠Phactr1表达增加,而正常饮食的Apoe-/-小鼠Phactr1的表达实际上较低。（P<0.05）（2）高脂饮食16周后,Phactr1+/+和Phactr1-/-小鼠的体重和食物摄入量没有差异。高脂饮食的Apoe-/-小鼠血浆中TC,TG和LDL-C含量较高,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的血脂水平与Apoe-/-小鼠相当。（P<0.05）（3）主动脉窦横截面上的油红O染色显示,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块比Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块更显着。Phactr1-/-Apoe-/-小鼠坏死核区域更大,纤维帽更薄,巨噬细胞堆积更多。Phactr1缺乏导致Apoe-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块中胶原蛋白的积累明显减少。（P<0.05）（4）Phactr1-/-Apoe-/-小鼠主动脉中TNF-α和IL-6含量更高,血浆中TNF-α和IL-6水平也升高。（P<0.05）（5）与移植了Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠相比,移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠的斑块更显着。富含脂质的坏死核的面积显着增加,纤维帽厚度相应减少,巨噬细胞负荷增加。（P<0.05）（6）移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠,主动脉中TNF-α和IL-6的表达显着增加,血浆TNF-α和IL-6的水平升高。（P<0.05）（7）在存在ox-LDL的情况下,Phactr1的表达上调并在12小时达到峰值。ox-LDL至少部分通过Lox-1/NF-κB途径诱导巨噬细胞中Phactr1表达。（8）Phactr1的缺失显着促进BMDMs中M1巨噬细胞标志物如TNF-α和IL-6的表达,而M2表型标记物如Arg1和CD206的表达则显着降低。Phactr1-/-BMDMs中,M1巨噬细胞比例增加,而M2巨噬细胞比例则受到抑制。（P<0.05）（9）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1-/-BMDMs中的致动脉粥样硬化细胞因子水平更高,包括TNF-α,IL-6,RANTES,CCL2,IL-1β,IFN-γ以及M-CSF。Phactr1的沉默增强了ox-LDL诱导的这些细胞因子的表达。（P<0.05）（10）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1的缺失导致细胞内脂质含量显着增加。Phactr1-/-BMDMs中细胞内胆固醇含量明显高于Phactr1+/+BMDMs中的胆固醇水平。（P<0.05）（11）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1基因敲除导致BMDMs中LOX-1,SR-A和CD36的水平升高,而Phactr1基因敲除对ABCA1和ABCG1的表达没有明显影响。（P<0.05）（12）Phactr1和CREB在BMDM中直接相互作用。Phactr1和CREB之间的直接相互作用通过Flag-Phactr1和HA-CREB共转染的HEK293T细胞免疫共沉淀进一步证实。Phactr1过表达可增强CREB反应元件的活性。（P<0.05）（13）Phactr1-/-BMDMs中KLF4的表达降低。使用CREB抗体在KLF4启动子上进行的Ch IP-q PCR表明Phactr1敲除降低了CREB对BMDMs中KLF4启动子（片段1内的CREB结合基序）的结合。Phactr1过表达后HEK293T细胞中KLF4的转录活性显着增强。（P<0.05）（14）通过转导KLF4腺病毒（Ad-KLF4）来过表达KLF4可减少因Phactr1缺失诱导的M1表型标志物的表达,恢复M2表型标志物的表达。（P<0.05）（15）在Phactr1缺陷的BMDM中,KLF4过表达减轻了清道夫受体Lox-1,CD36和SR-A的增加趋势。（P<0.05）（16）KLF4上调显着降低了Phactr1-/-BMDM中细胞内胆固醇的含量。Ad-KLF4上调可减少因Phactr1缺乏所致的泡沫细胞的形成。油红色O染色区域的测量结果显示,与接受Phactr1-/-Apoe-/-BM的DKO(Phactr1-/-Apoe-/-)小鼠相比,接受KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的DKO小鼠斑块面积明显减少。（P<0.05）结论:（1）在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加。（2）Phactr1可抑制M1促炎表型,其减少可促进向易损斑块表型发展的速度,Phactr1可延缓动脉粥样硬化的进展。（3）Phactr1是巨噬细胞介导炎症、巨噬细胞极化以及泡沫细胞形成的关键因素。（4）KLF4过表达能够部分抵消因Phactr1缺乏对动脉粥样硬化斑块的加剧作用。
李安然[2]（2021）在《炎症消退因子LXA4和RvD1与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究》文中认为背景:大动脉粥样硬化（Large artery artherosclerosis,LAA）型脑梗死是最常见的缺血性卒中类型,动脉粥样硬化（Artherosclerosis,AS）的有效控制是防治LAA型脑梗死的关键。从本质上看,AS是一种由于脂类代谢失衡和炎症反应失控导致的动脉壁慢性炎症性疾病,针对AS病灶中慢性炎症这一核心因素,绝大多数研究集中在基于“抑炎”的防治策略,近年来,越来越多的观点认为尽管AS病变是由促炎因子诱导的慢性炎症反应引起的,但抗炎因子介导的炎症消退过程受阻,才是斑块进展和不稳定的根本原因。所以,若不改善炎症消退这一关键环节,仅仅抑制炎症诱导和发生,并不足以延缓或停止斑块的进展和恶化,从而无法稳定AS病变。炎症消退过程由促炎消退因子调控,包括脂氧素（Lipoxins,LXs）、消退素（Resolvins,Rvs）、保护素（Protections,PDs）和马林蛋白（Maresins,Ma R）等。动物实验发现,脂氧素A4（Lipoxin A4,LXA4）和消退素D1（Resolvin D1,RvD1）可以减轻模型小鼠的动脉粥样硬化程度,在临床研究方面,炎症消退因子与AS的相关性研究较少,炎症消退因子与LAA型脑梗死之间的关系也有待进一步探索。目的:通过比较健康体检者、AS患者和LAA型脑梗死患者外周血炎症消退因子（LXA4、RvD1）水平,结合患者临床特征、影像学及实验室检查结果,探讨炎症消退因子LXA4和RvD1与AS及LAA型脑梗死发生进展的相关性,以期为动脉粥样硬化和缺血性卒中的防治提供新的思路。方法:纳入2019年12月至2021年1月,吉林大学第二医院神经内科诊断为急性大动脉粥样硬化型脑梗死的患者48例（LAA组）,无新发脑梗死的脑动脉粥样硬化患者41例（AS组）,两组患者均符合入组标准,并接受脑血管检查（头颈部血管彩超或头颈部CTA）,根据动脉粥样硬化斑块性质分为稳定性斑块亚组和不稳定性斑块亚组;根据血管狭窄程度分为:轻度狭窄亚组、中度狭窄亚组和重度狭窄亚组。根据美国国立卫生院神经功能缺损评分表（National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS）对LAA组患者入院24h内病情进行评估,分为轻度功能缺损亚组和中重度功能缺损亚组。对照组来自同期吉林大学第二医院体检中心健康体检者18例,均经头颈部血管彩超证实无脑动脉粥样硬化。AS组和LAA组患者在入院24h内采集空腹肘静脉血液,LAA组部分患者（29例患者同意复查采血）在发病7d再次采血,所有标本离心分离血清,应用酶联免疫吸附试验法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组患者外周血LXA4和RvD1水平。统计分析对照组、AS组和LAA组患者入院前后外周血LXA4和RvD1的水平,并结合脑动脉血管情况、NIHSS评分及其他临床数据,探讨炎症消退因子LXA4和RvD1与AS及LAA型脑梗死发生发展的相关性。结果:1.对照组、AS组、LAA组患者在体重指数（Body Mass Index,BMI）、性别、卒中史、冠心病史、血清低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）等方面比较均无统计学差异（P>0.05）。AS组患者平均年龄、高血压病史比例高于对照组（P<0.05）,糖尿病史/吸烟史/饮酒史比例、HDL、空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）与对照组比较无显着差异（P>0.05）。LAA组患者平均年龄、高血压病史/糖尿病史/吸烟史比例、FBG高于对照组,HDL水平低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）;LAA组患者饮酒史比例与对照组比较无显着差异（P>0.05）。LAA组患者吸烟史/饮酒史比例、FBG高于AS组患者（P<0.05）,而平均年龄、高血压病史/糖尿病史比例、HDL与AS组无显着差异（P>0.05）。2.AS组和LAA组患者外周血LXA4水平明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.001）,AS组与LAA组患者外周血LXA4水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。对照组、AS组和LAA组患者外周血RvD1水平比较均无显着差异（P>0.05）。3.LAA组部分患者发病7d采血复查外周血LXA4和RvD1水平,结果显示LXA4和RvD1水平均较发病24h内降低,差异有统计学意义（P<0.05）。4.斑块稳定性亚组分析:AS组患者稳定性斑块和不稳定性斑块所占比例分别为79.5%和20.5%,LAA组患者分别为54.2%和45.8%。AS组患者动脉粥样硬化稳定斑块所占比例明显高于LAA组患者（79.5%>54.2%,P<0.05）,不稳定斑块所占比例明显低于LAA组患者（20.5%<45.8%,P<0.05）。不稳定性斑块亚组患者外周血LXA4水平明显低于稳定性斑块亚组患者,差异有统计学意义（P<0.05）;不稳定性斑块亚组和稳定性斑块亚组患者外周血RvD1水平比较无显着差异（P>0.05）。5.血管狭窄程度亚组分析:AS组患者脑血管以轻度狭窄为主（占比51.2%）,LAA组患者脑血管以中重度狭窄为主（占比93.8%）,两组比较差异有统计学意义（P<0.001）。不同血管狭窄程度亚组患者外周血LXA4和RvD1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。6.神经功能缺损程度亚组分析:LAA型脑梗死患者轻度神经功能缺损亚组和中重度神经功能缺损亚组患者外周血LXA4和RvD1表达水平均无显着差异（P>0.05）。结论:1.AS患者和LAA型脑梗死患者外周血中炎症消退因子LXA4水平降低,且不稳定性斑块亚组患者外周血LXA4水平下降更为明显,提示炎症消退因子LXA4与AS和LAA型脑梗死密切相关,外周血LXA4水平有可能成为AS和卒中风险预测的生物学标记物。2.AS患者和LAA型脑梗死患者外周血中炎症消退因子RvD1水平无明显变化。然而,LAA型脑梗死患者发病7d外周血RvD1水平降低,提示炎症消退因子RvD1水平可能与脑梗死病程有一定的相关性,但需要进一步研究证实。
贾林·阿布扎力汗[3]（2021）在《APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究》文中指出目的:本研究旨在寻找淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）调控相关基因及新的变异位点,从基因/蛋白/环境多层次水平上研究其参与调控胆固醇代谢的机制与功能,为以他汀类药物为基础的高脂血症的治疗、降低心脑血管疾病的患病率和死亡率提供理论依据及新的治疗策略。1)采用极端表型策略结合二代测序技术在新疆地区人群中检测APLP2基因非同义突变位点,使用Methyltarget高通量测序法检测APLP2基因甲基化水平。2)探讨淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）新的变异体参与胆固醇代谢过程中的分子机制。3)探讨APLP2基因单核苷酸多态性（SNP）与新疆人群中血脂异常发生率间的关联性。方法:1)采用极端表型策略,选取新疆地区维吾尔族和哈萨克族共60例研究对象,分析APLP2基因与血脂谱的关联性。采用病例对照的研究方法,分析APLP2基因在冠心病组和对照组中的甲基化水平。2)在细胞水平上,构建APLP2基因新变异体的真核过表达质粒,采用蛋白质免疫印迹、实时定量PCR、免疫沉淀、免疫共沉淀等实验手段研究APLP2蛋白表达、稳定性、降解等本身特点及对靶蛋白Apo E/LRP1、PCSK9/LDLR的影响,探究APLP2参与调控胆固醇代谢的机制和功能。3)选择新疆地区汉族、维吾尔族及哈萨克族年龄≥35岁的人群1738例,利用Taqman技术对APLP2基因标签SNPs进行扩大样本量验证,阐述与血脂代谢的相关性。结果:1)本研究中入选的60例血脂极高和极低人群进行APLP2基因全外显子组测序,共发现11个新的未曾报道的非同义变异体（Q194E、G42E、G295S、M323I、D329N、S447N、R468C、H534Q、V535M、D573Y及P601A）,其中Q194E、G42E、M323I、S447N、R468C、及P601A非同义变异体出现在LDL-C极高组人群中,其余的均出现在LDL-C极低组人群中。冠心病患者中APLP2基因甲基化水平明显高于健康对照组研究对象。2)在细胞水平上进行机制研究结果显示:与野生型APLP2相比,APLP2 G42E变异体的蛋白表达水平明显减少,APLP2 Q194E变异体的蛋白表达水平明显增加,然而在mRNA水平上的表达与野生型无明显差异。APLP2 G42E突变体的半衰期相对较短,降解速度较快,APLP2 Q194E突变体的半衰期相对较长,降解相对缓慢。野生型APLP2能够与ApoE相互作用,与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2 Q194E与ApoE的结合没有显着区别。APLP2野生型与LDLR有相互作用,并且是剂量依赖性增加。与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2Q194E与PCSK9介导LDLR的降解实验无明显结果差异。3)APLP2基因rs2054247多态性位点与血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平相关（P<0.05）。APLP2基因rs2054247位点多态性与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）相关（P<0.05）。然而,rs2054247位多态性与血清甘油三酯（TG）水平无关（P>0.05）。APLP2基因rs3740881多态性位点与血清TC、LDL-C、HDL-C和TG水平均无关（P>0.05）。APLP2 rs747180多态性位点只与TC、LDL-C水平相关（P<0.05）。结论:1)本研中在新疆地区哈萨克族和维吾尔族人群中共筛选出APLP2基因11个非同义突变位点,新疆地区人群冠心病患者中APLP2基因甲基化水平较健康对照组高。2)对APLP2基因新变异体G42E和Q194E在细胞水平上进行机制研究后发现G42E和Q194E变异体不影响胆固醇水平。同时,该两个变异体不影响与ApoE/LRP1结合,也不影响PCSK9介导LDLR的降解。3)APLP2基因rs2054247和rs747180位点多态性在新疆人群中可能与高TC和高LDL-C水平相关。ApoE基因rs429358多态性位点在新疆维吾尔族人群中可能与冠心病的发病相关。
徐磊[4]（2020）在《白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究》文中进行了进一步梳理缺血性脑血管病主要病理基础为动脉粥样硬化,在动脉粥样硬化形成过程中,炎性反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的全过程,Smads信号通路可以抑制脂代谢、抑制炎症反应和氧化应激发挥抗动脉粥样硬化作用,白藜芦醇主要通过抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修饰、抑制泡沫细胞生成、抑制斑块内新生血管、抗氧化等发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而白藜芦醇、Smads信号通路、脂代谢、炎性反应和动脉粥样硬化之间具有何种关系,目前仍不确切。本研究为明确白藜芦醇的抗动脉粥样硬化作用及其是否通过Smads信号通路的抗炎、抗动脉粥样硬化作用机制,在成功复制兔动脉粥样硬化模型基础上,采用不同影像技术对颈动脉粥样硬化的影像学特点进行比较分析,同时观察白藜芦醇对影像学变化的影响,采用免疫组化和Western-blot技术对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路以及巨噬细胞标志物RAM11、平滑肌标志物Actin、血管内皮细胞标志物CD31的表达进行研究,对兔主动脉弓动脉粥样硬化和血脂、Lp-PLA2水平对比分析。本文研究包括以下内容:1.兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型建立与评价目的:建立兔颈动脉以及主动脉弓动脉粥样硬化模型。方法:健康普通级新西兰兔8只,雄性,体重2.7-3.3kg,兔龄3个月,颈动脉粥样硬化组4只,主动脉弓动脉粥样硬化组4只;颈动脉粥样硬化组中对照组2只,进食普通饲料,高脂饮食联合兔部分颈动脉结扎手术2只。结扎后,饲养3个月后进行颈部血管超声检查,并且进行解剖颈手术操作如下:耳缘静脉留置套管针,耳缘静脉缓慢推注5%苯巴比妥钠注射液100 mg/kg,进行麻醉,手术在无菌条件下进行,颈正中切口,显露并分离左侧颈动脉,在LJZ-4D手术显微镜下用缝针穿过颈动脉血管中间位置,10-0丝线结扎部分动脉阻断部分血管,造成约50%狭窄,逐层缝合创口。颈动脉动脉,进行HE染色;主动脉弓动脉粥样硬化组4只,正常饮食组2只,高脂饮食组2只。饲养3个月。随后进行麻醉,解剖主动脉弓,进行HE染色。结果:超声检查发现对照组显示兔颈动脉光滑,未见斑块,实验组,兔颈动脉可见血管腔存在部分狭窄,狭窄处可见斑块形成;局部大体解剖见对照组颈部血管表面光滑、平整,无斑块形成,实验组可见结扎线处形成局部斑块。HE染色发现对照组管壁光滑,内膜无增生,平滑肌层形态正常,未见斑块形成,实验组见颈动脉内膜增厚,平滑肌层形态不规则,管腔变窄,斑块形成明显。NDG内膜光滑,FDG见内膜增厚,内膜下巨噬细胞浸润。结论:经超声和病理学证实,成功制备兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型。2.利用不同影像技术观察白藜芦醇对兔动脉粥样硬化影响的研究目的:观察不同影像技术兔颈动脉粥样硬化改变及白藜芦醇对其的影响。方法:将30只健康普通级新西兰兔,随机分配为对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组。手术操作同前。喂养3个月后,进行超声（GE,美国）检测颈动脉血流速度、狭窄程度、斑块质地;HRMRI（西门子,Skyra 3.0T,德国）检测斑块质地、狭窄程度;PET/CT（联影u MI510）检测斑块核素摄取量。结果:超声结果显示对照组管腔光滑,未见斑块形成;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组比较,颈动脉血流速度、狭窄程度减低（P>0.05）;斑块厚度、软斑块及混合斑块比例均较低（P<0.05）,斑块质地更趋于稳定斑块。HRMRI显示对照组颈总动脉形态正常,管腔内未见斑块;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组颈动脉狭窄减轻,血管内斑块减小,导致狭窄程度减低。PET-CT显示与高脂饮食+SPL组比较,高脂饮食+白藜芦醇+SPL组斑块（狭窄）部位核素核素摄取（SUV）减少（P<0.05）。结论:超声、HRMRI、PET/CT影像学检查评估兔颈动脉粥样硬化模型存在不同的优势,验证兔颈动脉粥样硬化斑块存在的同时,提示可发现易损斑块存在,白藜芦醇具有抗动脉粥样硬化作用,具有降低斑块内代谢、促进斑块稳定的作用。3.白藜芦醇介导Smads信号通路抗动脉粥样硬作用的研究目的:探讨白藜芦醇对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路的影响及其通过抗炎等实现抗动脉硬化作用。方法:对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组,影像学检查后解剖取材颈动脉,采用HE染色进行病理学检查,采用Western-blot、免疫组化技术观察Smad2、Smad3、Smad7表达,采用免疫组化技术观察RAM11、Actin、CD31表达,定量分析Western-blot结果,应用IPP软件对免疫组化结果测量Area、IOD值,用SPSS19.0软件数据统计,进行t检验。结果:HE染色显示对照组管壁光滑,未见斑块形成,白藜芦醇+高脂饮食+SPL组对比高脂饮食+SPL组斑块厚度减低（P<0.05）。免疫组化和Western-blot技术发现高脂饮食+SPL组与对照组对比Smad2、Smad3表达增高,Smad7表现增高;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组对比Smad2、Smad3表达减低,Smad7表达增高结果一致。高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析明显减低（P<0.05）,并且高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析都高于对照组（P<0.05）。结论:高脂饮食可激活Smads信号通路,白藜芦醇可能通过抑制Smad2、Smad3表达,提高Smad7表达,抑制巨噬细胞浸润、平滑肌增生、新生血管生成实现抗动脉粥样硬化作用。4.白藜芦醇对动脉粥样硬化兔血脂、Lp-PLA2影响的研究目的:探讨白藜芦醇对兔动脉粥样硬化模型血脂、Lp-PLA2的影响。方法:将普通级新西兰兔随机分为NDG、FDG、RFG三组。实验前进行心脏采血,进食3个月后,再次进行心脏采血,采用化学发光法检测血脂、采用干式荧光免疫分析检测Lp-PLA2水平,采血后麻醉进行主动脉弓取材,行HE染色观察病理变化,观察主动脉弓内膜厚度、平滑肌层厚度、内膜/平滑肌层比值,数据统计分析均采用SPSS19.0软件,进行t检验。结果:实验后三组TC、HDL-C、LDL-C、Lp-PLA2具有统计学差异（P<0.05）,并且RFG比FDG组TC、LDL-C、Lp-PLA2数值减低,具有统计学差异（P<0.05）。结论:白藜芦醇通过调节血脂、抑制Lp-PLA2实现抗动脉粥样硬化。
张刘洋[5]（2020）在《心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究》文中指出研究目的急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是冠心病分属中最为严重的类型,该病被认知为危害人类健康的头号杀手之一。对于ST段抬高心肌梗死（STsegment elevation myocardial infarction,STEMI）需紧急恢复血流供应,挽救缺血心肌。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary intervention,PCI）是针对STEMI患者的首选策略,能改善急性STEMI患者的远期生存率。然而,目前仍存在诸多与PCI相关的临床问题需要被解决,其中心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemiareperfusion injury,MIRI）是最重要的临床问题之一。类二十烷酸代谢产物是由花生四烯酸等多不饱和脂肪酸在环氧酶、脂氧酶和细胞色素P450三大代谢通路的作用下生成的几百种活性脂质分子的总称。这类代谢产物中的很多分子与心血管疾病中涉及到的生物学过程有关,在诸如炎症、血栓形成、动脉粥样硬化、心肌肥厚、心律失常、心力衰竭等过程中发挥危害或保护性作用。然而,目前大部分类二十烷酸代谢产物在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥的作用与分子机制尚不清楚,对于PCI手术前后病人的类二十烷酸的整体代谢模式改变情况也尚未阐明。本工作的目的是利用类二十烷酸代谢组学在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型与STEMI患者血浆样本中阐述心肌缺血再灌注过程中类二十烷酸代谢谱的整体变化规律;发现与心肌缺血再灌注损伤相关的关键代谢产物;并在细胞模型中研究关键代谢产物的功能与机制。研究方法利用小鼠经冠脉结扎/再通手术建立的心肌缺血再灌注损伤模型,超声心动、Evans blue-TTC双染色检测验证动物模型成功建立;收取STEMI患者PCI手术前后7个时间点（手术前30分钟、手术后6小时、手术后12小时、手术后24小时、手术后72小时、出院前1天、出院后28天）的血浆样本,并充分记录患者的临床信息（包括人口学特征、生命特征、既往疾病史、院前用药、心脏超声、心梗面积、CKMB、c Tn I等心脏损伤标志物水平等）。利用基于液相色谱-三重四极杆质谱联用技术的靶向代谢组学方法分析小鼠MIRI模型心脏组织及STEMI患者血浆的类二十烷酸代谢谱（包括环氧酶、脂氧酶、细胞色素P450氧化酶通路下的84种代谢产物）。通过由Mann-Whitney U检验、ANOVA方差分析、偏最小二乘判别分析等统计学方法所组成的筛选原则,筛选与心肌缺血再灌注损伤相关的关键代谢产物。建立缺氧复氧过程诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞I/R模型（缺氧12小时,常氧条件6小时）,在此模型中研究关键代谢产物对心肌细胞凋亡的影响。研究结果在小鼠心脏组织中共检测到类二十烷酸代谢产物68种。偏最小二乘-判别分析显示小鼠经冠脉结扎/再通手术建立的IR模型与对照组相比,类二十烷酸代谢谱发生明显的改变,其中15-羟基二十碳四烯酸（15-HETE,I/R组升高）对代谢组的整体差异贡献最大;经Mann-Whitney U检验筛选到7种具有显着性变化的代谢产物,其中16-羟基二十碳四烯酸（16-HETE）在I/R组降低至低于检测限),12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）在I/R组升高约2.08倍（p=0.011）,15-HETE在I/R组升高约2.11倍（p=0.014）,18-羟基二十碳四烯酸（18-HETE）降低约70%（p=0.001）,血栓烷素B2（TXB2）升高约1.46倍（p=0.048）。对20位STEMI患者在7个时间点收集到的共计140个血浆样本进行类二十烷酸代谢组学分析,共检测到类二十烷酸代谢产物68种。偏最小二乘-判别分析显示STEMI患者接受PCI手术前后类二十烷酸代谢谱发生明显变化,其中6-k-前列腺素F1α（6-k-PGF1α）对代谢组的整体差异贡献最大;通过对代谢产物时程曲线的聚类分析发现,不同代谢产物的时程曲线展现出不同的变化特征;其中缺血再灌注早期阶段（6小时）造成16-HETE水平的升高（ANOVA p=0.006）;中期阶段（1272小时）造成二羟基二十碳三烯酸（DHET）类代谢产物的升高（ANOVA p<0.05）以及TXB2、脂氧素A4（LXA4）的降低（ANOVA p=0.005）;后期阶段（72小时之后）造成6-kPGF1α（ANOVA p=2.71E-08）和白三烯B4（LTB4）（ANOVA p=0.0004）的升高;此外前列腺素D2和E2（PGD2、PGE2）在整个过程中持续性降低。研究结论经Mann–Whitney U检验和PLS-DA多元统计所得数据的综合考量,结合类二十烷酸代谢产物的已知功能,我们认为包括12-HETE、15-HETE、16-HETE、18-HETE、TXB2在内的5种花生四烯酸代谢产物在小鼠的心肌缺血再灌注损伤过程中具有重要的病理生理学意义;经过对ANOVA分析、Mann-Whitney U检验、以及PLA-DA多元统计所得数据的综合考量,并结合类二十烷酸代谢产物的已知功能,我们认为包括6-k-PGF1α、TXB2、PGD2、PGE2、LXA4、LTB4、16-HETE、20-HETE、5,6-DHET在内的9种类二十烷酸代谢产物在STMEI患者的缺血再灌注损伤过程中具有重要的病理生理学意义。对小鼠心肌缺血再灌注损伤模型与STEMI患者关键类二十烷酸代谢产物的比较显示:TXB2和16-HETE可能在动物模型与STEMI患者中均发挥重要作用。本研究利用代谢组学系统性地研究类二十烷酸代谢谱在心肌缺血再灌注损伤中的整体变化规律,全面理解心肌缺血再灌注损伤过程中类二十烷酸系统的整体特点,完整勾勒出多种类二十烷酸分子之间在心肌缺血再灌注损伤过程中水平变化的总体脉络,针对类二十烷酸在心肌缺血再灌注损伤过程中的改变提出了对类二十烷酸具有针对性的干预策略。
耿嘉男[6]（2020）在《基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究》文中认为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”（编号:20150101200JC）,探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE-/-小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL（200μg/mL）诱导的内皮细胞（HUVECs）损伤模型,Rg3（15、30μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显着对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显着增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662（PPARγ特异性抑制剂）对HUVECs进行预处理,可显着抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀（0.01、0.1及1μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显着增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显着降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显着抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显着降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料（含40%脂肪,1.25%胆固醇）饲养ApoE-/-小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组（Rg3）、瑞舒伐他汀组（RSV）和Rg3与瑞舒伐他汀联用组（Rg3+RSV）,以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显着升高,HDL-C水平显着降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显着增多,动脉壁胶原纤维含量显着减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显着增多,平滑肌细胞显着减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显着升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显着降低小鼠血清LDL-C水平,显着抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显着差异,同时Rg3+RSV组显着降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显着下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显着降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显着差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显着增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显着,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显着,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显着。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显着抑制ApoE-/-小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显着,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。
刘斌[7]（2020）在《炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究》文中进行了进一步梳理1研究背景急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）是由于冠状动脉粥样硬化斑块糜烂或破裂,从而引起斑块表面血栓形成和/或远端血栓栓塞,造成完全或者不完全的心肌缺血为特征的一组临床疾病。2016年流行病学的报告显示:我国有2.9亿心血管疾病患者,2015年心血管病死亡是城乡居民总死亡首位原因,城市为42.61%,农村为45.01%,其中ACS占比近50%,并且ACS的发病年龄逐步有年轻化的趋势。根据心肌梗死全球通用定义（第三版）,ACS分为ST抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction STE-ACS）和非ST段抬高型 ACS（non-ST segment elevation ACS,NSTE-ACS）。冠状动脉内血栓形成和/或血栓栓塞是ACS最主要的致病因素,易损斑块的破裂是ACS发作的基础。因此,深入研究易损斑块的分子细胞生物学机制,探讨预测动脉粥样硬化斑块易损性的新生物标志物,对降低急性冠脉综合征的发生,最大程度地减少严重心血管事件的发生具有重要的临床意义。巨噬细胞、单核细胞及其炎症反应在斑块进展中发挥了重要的作用。巨噬细胞和单核细胞能吞噬胆固醇微粒,在泡沫细胞的形成、死亡以及坏死核心的形成中起到了重要的作用,并参与炎症反应和斑块破裂,从而加快了斑块破裂的进展。近期的研究表明,巨噬细胞和单核细胞在斑块中聚集的机制可能是局部细胞增生（而非浸润）。此外,中性粒细胞来源的cathelicidins可诱导循环单核细胞的粘附,从而表明中性粒细胞可能先于单核细胞参与血管炎症反应。与白细胞活化相关的炎症介质分子也可能与动脉粥样硬化性疾病的进展有关。白介素6（interleukin-6,IL-6）能促使血管损伤部位中活化的白细胞和平滑肌细胞分泌C反应蛋白。研究表明,IL-6受体的Asp358Ala等位基因变异是冠心病的危险因素,提示IL-6信号通路在动脉粥样硬化的进程中发挥了重要的作用。白介素等相关炎症因子信号通路与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关,但是,目前确切的分子机制仍然不明确。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,参与了 DNA代谢、转录调控,翻译,RNA稳定以及microRNA的加工和定位。最近的研究表明其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、发炎和血脂异常。但是人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少,同时血清中的ILF3作为普通人群预测ACS危险的生物标志物的临床价值和潜在的病理机制仍不清楚。在本研究中,我们在人的血清样品以及冠脉狭窄患者斑块组织中探讨了ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的作用,同时通过血清ILF3预测急性冠脉综合征,为临床早期检测和诊断ACS提供了新的靶点。2目的（1）明确人血清ILF3含量的变化是否与ACS的发生相关（2）明确ILF3在血管及心肌组织的表达变化,探讨血清ILF3含量的变化是否与血管损伤或心肌损伤的发生相关,探讨其可能的分泌部位（3）探讨ILF3能否作为新的AS斑块破裂的预测标志物3方法3.1研究人群该研究包括回顾性研究和前瞻性验证队列。从山东省的四家医院的急诊科选择了因胸痛就诊的526名ACS患者（包括221例AMI和305例UA）。此外,本研究还纳入了 210名健康对照者。其中,在300例ACS患者（包括150例AMI患者和150例UA患者）和85名健康对照者（发现队列）确定了准确的蛋白质定量分析临界值,对226名潜在入选受试者（包括71例AMI患者、155例UA患者）和125例健康对照者的临床表现进行了评估,其中病例组和对照组的年龄,性别和体重指数（body mass index,BMI）分布相似。该研究方案已经通过当地伦理委员会批准,批准号为（KYLL-2018（KS）-233）;所有纳入的参与者均提供了书面知情同意书。所有患者均接受了初步临床评估,包括临床病史,体格检查,12导联心电图,连续心电图监测,脉搏血氧饱和度,标准血液检查和胸部X光检查。只要有临床指征,在就诊时以及1至3小时后都检测hs-cTnI。患者的入选时机和治疗由主治医师决定下进行的。所有最终诊断均基于详实的医疗记录,包括患者病史,体格检查,实验室和放射学检查结果,ECG,超声心动图,心脏运动实验和冠状动脉造影。在监护人的许可下,通过医院急诊科分诊处使用的电子病历系统获得了患者信息和临床检查结果。所有的心肌梗死患者均按最新的指南进行诊断。通过hs-cTnI的上升和/或下降模式诊断出坏死,其中至少一个值高于第99个百分位数,hs-cTnI分析的不精确度为10%。对于hs-cTnI的分析,最低检测下限是0.01g/L。因此,为了表现肌钙蛋白升高的趋势,初始值正常的患者肌钙蛋白水平必须升高到0.04 g/L的才能满足AMI的诊断标准。肌钙蛋白T水平正常且典型的静息性心绞痛,或者先前稳定的心绞痛发作突然加重,或心脏运动试验阳性或心脏导管检查显示冠状动脉狭窄70%的情况下,诊断为UA。既往有过心脏方面的病史,但不包括冠状动脉症状（例如,心包心肌炎,快速性心律失常）和非心脏症状。如果急诊科排除了急性心肌梗死,但没有足够的临床证据来进一步明确诊断,则将此类归类为来源不明的胸痛患者。通过对纳入者问卷调查的方式收集有关健康的信息。对与吸烟有关的问题分类为当前,以前或从不吸烟。肌酐通过Jaffe法测定,每日变异系数为3.5%。在山东大学齐鲁医院的检验科,对所有纳入者进行了非禁食血清的检测,得到了总胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的数值。健康队列中的临床检查由训练有素的护士进行,包括血压,体重,身高以及腰围和臀围的标准化测量。健康的参与者（志愿献血者）均来自山东大学齐鲁医院济南院区。3.2血清ILF3和hs-cTnI的测定ELISA法测定人外周静脉血血清中ILF3和hs-cTnI的水平。3.3临床样本收集我们从山东省红十字捐赠的遗体标本中筛选患有动脉粥样硬化疾病和健康对照者的冠状动脉组织标本（每组三个以上样本）进行了评估。从在山东大学齐鲁医院因严重颈动脉狭窄行内膜切除术的患者中获得颈动脉斑块,总计15例患者（男9例,女6例）。在收集样本之前,每位患者均签署书面知情同意书,并获得了山东大学齐鲁医院伦理委员会的伦理学批准。利用颈动脉超声确定颈动脉粥样硬化损伤程度,颈动脉内膜切除术获得动脉粥样硬化病变的人颈动脉节段,固定在中性福尔马林溶液中,通过石蜡包埋后进行免疫组织化学分析。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精&伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,(将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片脱蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5统计分析在发现队列中,我们比较了至少一根主要的冠状动脉存在70%狭窄的患者和冠状动脉没有达到70%狭窄患者的基线特征。使用Fisher精确检验比较了 AMI,UA和健康对照组之间的二分变量（性别,糖尿病史等）。使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量（BMI,生物标志物等）。确定了 ILF3和hs-cTnI的预测概率的受试者工作特征（ROC）曲线,并使用逻辑回归模型评估疾病风险。为了评估ILF3和hs-cTnI的诊断价值,使用发现队列ROC曲线以至少85%的敏感性选择了临界点。使用验证队列确定相应的敏感性,特异性和准确性。为了消除数据的多重共线性,我们对生物标志物的值进行了对数转换,并删除了具有较大方差膨胀因子的变量。所有实验至少独立进行三次,所有的分析均使用带有pROC 23和ggplot2软件包的R版本3.5.0软件24（R统计学计算基金会,维也纳,奥地利）。所有测试均为双面测试,显着性差异性设置为0.05。4结果4.1研究流程入选的526名ACS病人和210名健康对照人群分为回顾性研究队列和前瞻性研究队列。回顾性研究队列包括150名UA病人,150名AMI病人,和85名健康对照人群。我们将通过回顾性研究队列构建ILF3变化对ACS的诊断系,筛选出最佳诊断阈值后,在前瞻性研究队列人群验证。前瞻性研究队列包括155名UA病人,75名AMI病人和125名健康对照人群。所有的入选招募的患者来自四个不同急诊科,并采集了血液样本。测量了生物标志物,并将其与最终诊断和随后的住院过程相关联。具体流程见相关流程见（图1）4.2 ILF3的水平的变化研究发现,与健康对照人群相比,ACS患者血清中的ILF3清浓度明显高于健康对照组,增加了 23倍以上,存在显着的差异。其中急性冠脉综合征患者中有155位不稳定型心绞痛（UA）和71位急性心肌梗塞（AMI）患者,尽管UA患者的ILF3水平略高于AMI患者,但差异无统计学意义。在四个诊断中心中,患者的ILF3水平在诊断组中的相对差异基本一致。没有不确定的结果,也没有限制异常值。4.3 ILF3预测ACS发生的准确性通过ROC曲线下面积（AUC）来量化血清ILF3的预测准确性,对于所有ACS患者、UA患者和AMI患者,ILF3的预测的准确性都很高。ILF3联合hs-cTnI（ILF3+hs-cTnI）预测ACS的准确度为0.99,明显高于单纯hs-cTnI的准确度（P<0.001）。ILF3+hs-cTnI联合诊断的曲线下面积（AUC）分析显示ILF3+hs-cTnI联合诊断的UA的准确性要显着高于单独应用hs-cTnI预测UA风险的AUC。ILF3、hs-cTnI和ILF3+hs-cTnI预测AMI的准确性相似。根据ROC曲线确定最佳临床决策限值。ACS的ILF3和hs-cTnI 阳性诊断值。然后将这些诊断值应用于对验证队列患者中ACS、UA和AMI的预测,在所有ACS病例中显示出高的敏感性（>84%）和100%的特异性;除敏感性外,ILF3对ACS的预测性能指标均不低于hs-cTnI。更重要的是,ILF3对ACS的阴性预测值也高于hs-cTnI。4.4 ACS患者血清ILF3水平的升高与心肌损伤无显着相关性。与血清hs-cTnI相比,ACS患者血清ILF3水平的变化没有随着胸痛发作时间的延长而进行性升高,说明ACS患者血清ILF3的升高与心肌细胞坏死的严重程度无关,表明ILF3不是心肌细胞坏死特异性的生物标志物。4.5 ACS患者血清ILF3含量与冠状动脉粥样硬化的严重程度无显着相关性我们评估了 ACS患者的血清ILF3水平升高是否与血管造影冠状动脉病变程度的相关性。在发现队列中,通过对300例ACS患者血管造影资料分析其血管狭窄的程度,及单支病变、双支病变和多支病变的程度发现:血清ILF3水平也与冠状动脉病变狭窄程度（通过Genisi评分）和病变血管支数无显着的相关性。这些数据表明,ACS患者血清ILF3水平的升高不能反映冠状动脉粥样硬化的严重程度,而可能反映冠状动脉粥样硬化斑块的炎症水平。4.6 ILF3含量与炎症因子显着相关为了确定血清ILF3和hs-cTnI升高的临床意义,我们采用logistic多元回归分析方法来评估其与动脉粥样硬化血管的危险因素如:年龄、性别、吸烟、血清总胆固醇和一些炎症细胞因子的相关性。结果显示:ACS患者血清hs-cTnT的升高与与冠心病和IL6密切相关,而ILF3的升高与性别、糖尿病、他汀类药物治疗、IL1β、IL6和TNFα密切相关。这些结果提示ACS患者血清hs-cTnT升高是心肌损伤的标志,而ILF3的升高更可能与AS斑块内的炎症程度相关。4.7 ILF3特异性在动脉粥样硬化斑块的M1巨噬细胞表达升高。人冠状动脉的免疫荧光和免疫组织化学染色显示,与非动脉粥样硬化的血管组织相比,ILF3在人动脉粥样硬化斑块中表达明显升高,并且在坏死核心区域大量表达。此外,我们在人颈动脉斑块中在巨噬细胞中观察到ILF3和iNOS（Ml巨噬细胞生物标志物）的共定位,表明ILF3是在斑块的炎性M1巨噬细胞中表达。5结论ILF3可能作为一种新的预测动脉粥样硬化斑块易破裂的生物标志物,对急性冠脉综合征的患者提供早期的诊断作用。1研究背景冠状动脉内的易损斑块,是指不稳定的、易形成血栓的,而突然导致急性心脏事件发生的斑块。易损斑块导致血栓形成是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）的重要发病机制。它可以表现为斑块破裂继发血栓形成,或是斑块侵蚀或钙化结节等病变诱发血栓形成等。斑块破裂在病理上为脂质斑块的纤维帽缺损并延伸到脂质核心,常有血小板及纤维蛋白构成的非闭塞性血栓。破裂的脂质斑块常伴有薄纤维帽及较大的脂质核心,纤维帽中有大量的巨噬细胞浸润,而脂质核心中富含胆固醇结晶。目前的研究表明,巨噬细胞是ACS发病的中心环节。巨噬细胞对纤维帽基质降解是斑块易损性的重要因素,测定纤维帽中巨噬细胞的含量,可以评估动脉粥样硬化斑块是否稳定。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,目前研究表明可调节细胞代谢的过程,包括转录调控以及mRNA加工和定位。最近的研究发现其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、炎症和血脂异常。然而,人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少。在前期研究中,我们发现ACS患者的血清ILF3水平明显升高,在动脉粥样硬化斑块中ILF3表达明显升高,并且定位于巨噬细胞中,我们通过巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠和小鼠原代巨噬细胞来阐明ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的潜在影响,进一步探讨动脉粥样斑块易损性的机制。2目的（1）建立巨噬细胞特异性过表达ILF3的ApoE-/-小鼠AS模型,观察ILF3对AS斑块的形成及易损性的作用;（2）阐明过表达ILF3的巨噬细胞在动脉粥样硬化发生及发展中的作用及相关机制。3方法3.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠的构建所有动物实验均根据山东大学实验动物使用和管理机构委员会批准的方案进行。载脂蛋白E（ApoE-/-）敲除的小鼠来自北京大学健康科学中心实验动物科学系。LyzMCre转基因小鼠由山东大学张文程教授惠赠。ILF3条件性过表达小鼠（ILF3 Tg）及ILF3条件性敲除小鼠（ILF3KO）由北京唯尚立德公司构建合成。ILF3条件性小鼠与ApoE-/-小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠,ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠继续与 LyzMCre小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-Tg）与巨噬细胞特异性敲除ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-KO）。野生型小鼠为对照小鼠,所有小鼠背景均为C57/B6背景。3.2动脉粥样硬化不稳定斑块模型的诱导与治疗8周龄的雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠高脂喂养（WD,Teklad调整卡路里 88137:21%（wt/wt）脂肪;0.15%（wt/wt）胆固醇;19.5%（wt/wt）酪蛋白;无胆酸钠）4周;在右颈动脉周围植入套管,继续高脂喂养12周。在处死前一周向小鼠腹膜内（i.p.）注射脂多糖（LPS;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国）或对照盐水（每只小鼠每天5ugLPS,每组N=15）。3.3巨噬细胞分离和油红O染色腹膜内注射100%石蜡油7天后,从WT和ILF3M-Tg小鼠的腹腔灌洗中收获腹膜巨噬细胞。将细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤,在Dulbecco改良的Eagle培养基（含10%胎牛血清）中培养过夜,并用氧化低密度脂蛋白（oxLDL;50 g/ml;北京联合生物有限公司）刺激24小时,以评估巨噬细胞上ILF3的表达是否受脂蛋白调节。4%多聚甲醛固定细胞,PBS洗涤,并在37℃下用Oil-red-O染色20分钟。各组间油红O含量通过Image-Pro plus软件进行定量。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精&伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片去石蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5免疫印迹分析首先用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,然后将其转移到硝酸纤维素膜上。用含0.1%Tween-20的5%脱脂牛奶封闭1小时,脱脂牛奶用PBS配置,然后一抗孵育1小时,再在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时。通过化学发光（Milipore,Billerica,MA,美国）检测结合的第一抗体,并通过Image J软件（NIH,Bethesda,MD,美国）定量。所有表达水平标准化于对照。3.6实时定量PCR使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA,然后反转录为cDNA。使用序列检测器系统（IQ5实时PCR循环仪,Bio-Rad实验室,加利福尼亚州,美国）进行基于SYBR Green的实时定量PCR。表达水平标准化于β-actin。3.7流式细胞术有研究表明oxLDL触发巨噬细胞的M1极化,从而诱导和促进动脉粥样硬化中的炎症反应。因此用50μg/ml oxLDL处理腹膜巨噬细胞,并通过流式细胞术评估M1和M2亚型的标志物。将腹膜巨噬细胞（2×105/孔）铺板,加入ox-LDL孵育24小时。为了分析ILF3过表达后激活的CD86和CD209阳性细胞,将小鼠单克隆的抗CD86抗体和抗CD209抗体（1:1000）（Abcam,剑桥,英国）在4℃避光情况下孵育30分钟。用PBS洗涤3次后,在4℃用二抗抗小鼠PerCP-Cy5-5-A和APC-A（Abcam,剑桥,英国）孵育30分钟。洗涤并收集标记的细胞,并使用FACS流式细胞仪系统进行分析。3.8精氨酸酶1启动子荧光报告表达载体的构建通过ensemble网站进行查询Arg-1启动子序列,选取-560 bp至-210 bp这一部分启动子序列进行分析,采用逐段删除法将Arg-1启动子片段合成后构建入报告基因载体 PGL3-basic 中,顺序分别为:-260 bp,-310 bp,-360 bp,-410 bp,-460 bp,-510 bp,-560 bp。3.9双荧光报告基因检测技术首先制备细胞裂解液,在冰上加入裂解液进行裂解细胞,然后离心,转移细胞裂解产物于新的离心管备用。然后按照荧光素酶试剂盒说明书进行处理细胞裂解液,并及时用光度计进行检测。结果分析:计算firely luciferase活性值与内参β-gal活性值的比值,利用T检验进行数据分析,P<0.05为具有统计学意义。3.10 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）（1）细胞准备根据试剂盒要求准备一定量的细胞用于CHIP实验（2）CHIP实验,按照MilliporeCHIP试剂盒的说明书逐步完成实验。3.11 ILF3干扰慢病毒载体的构建由 博尚 生物公 司 负责合 成构 建,干扰 序列 为GCCAATGGACTGAAGTCATGT,loop 采用 TTCAAGAGA。3.12统计分析所有数据均使用SPSS19.0软件包进行统计分析,所有的实验至少重复3次。计量资料用均数±标准差表示,计数资料用数值和百分比表示。两组之间比较采用采用独立样本的t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。4结果4.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠建立如图所示,将公司合成的ILF3全身loxp小鼠与巨噬细胞cre（Lyz2-cre）小鼠经过杂交而得到ILF3M-Tg小鼠,将该小鼠与ApoE-/-小鼠杂交而得到ApoE-/ILF3M-Tg 小鼠。4.2巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠鉴定经鉴定成功构建ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠,基因鉴定结果。4.3 ILF3促进泡沫细胞形成在野生型腹膜巨噬细胞中,ILF3的蛋白水平随oxLDL的剂量和处理时间的升高而升高。油红O染色显示ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的巨噬细胞较ApoE-/-对照小鼠的巨噬细胞对oxLDL的摄取能力明显增强。与野生型小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M--Tg小鼠的巨噬细胞脂质吞噬相关基因HMGCR,CD36及ABCA1的表达明显升高。4.4巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧小鼠动脉粥样硬化的形成与喂养12周的ApoE-/-小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠在主动脉窦和主动脉部位的动脉粥样硬化明显加重。4.5巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块的易损性斑块的形态分析结果表明:ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的动脉粥样硬化斑块包含较大的坏死核心,胶原蛋白含量和平滑肌细胞数量明显降低,在ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠的斑块中有更多的巨噬细胞浸润。4.6巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块中的血管生成与ApoE-/-小鼠泡沫细胞区域相比,ILF3过表达区域显示出VEGF的大量表达。然而,在ILF3高表达的区域内,每单位面积的微血管数量明显增加。4.7 ILF3上调增强了 oxLDL诱导的促炎性M1巨噬细胞极化流式结果表明,ILF3M-Tg巨噬细胞中CD86阳性细胞（M1）的百分比显着增加。oxLDL处理后未检测到CD209阳性细胞（M2）发生明显变化。4.8 ILF3过表达加剧动脉粥样硬化斑块中的炎症表达。免疫组化染色显示,与ApoE-/-小鼠相比,ILF3M-Tg动脉粥样硬化斑块的iNOS表达增加,但Argl表达下降,表明ILF3过表达的巨噬细胞,oxLDL促进其向促炎性M1巨噬细胞极化。4.9 ILF3过表达加剧巨噬细胞中炎症因子的表达。利用oxLDL刺激腹膜巨噬细胞24小时,随后对RNA进行实时定量PCR分析,结果表明,抗炎相关基因、促炎基因的转录均增加。与野生型对照相比,ILF3过表达的巨噬细胞中Argl和IL-10的mRNA水平显着降低（P<0.001或0.01）,而IL-6、TNF-α、iNOS和IL-1β表达显着增加。4.10 ILF3调控精氨酸酶1的转录表达结果显示,ILF3过表达成功,siILF3干扰效果明显,ILF3过表达或ILF3干扰时影响p65及statl活性的影响并影响ARG1的表达;ILF3过表达及ILF3干扰后对ARGI在mRNA水平的影响与蛋白水平一致;双荧光报告基因显示,ILF3调控ARG-1启动子-460～-410区域的活性;染色质免疫共沉淀（ChIP）结果显示,ILF-3可以直接与精氨酸酶1启动子结合。5结论（1）巨噬细胞特异性过表达ILF3促进了对oxLDL的摄取能力,并促进了泡沫细胞的形成与动脉粥样硬化。（2）巨噬细胞特异性过表达ILF3上调促炎细胞因子的表达,同时抑制抗炎细胞因子的表达,从而促进动脉粥样硬化的发生发展。（3）巨噬细胞中ILF3过表达的通过促进其自身滞留,而促进了动脉粥样硬化斑块的形成和斑块的易损性。（4）巨噬细胞中ILF3可以直接与精氨酸酶1的启动子区域结合,从而抑制ARG1的转录表达,而调控巨噬细胞Ml型的极化,促进AS斑块的易损性。1研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）作为一种慢性退行性血管疾病,其主要特征是血管壁进行性扩张和重塑,导致主动脉破裂引起致死,尤其是在老年人中[1-2]。然而,AAA的发病机制至今尚无定论。尽管AAA和动脉粥样硬化之间有一些共同的特征,但是治疗冠状动脉疾病的方法并不能降低人的AAA形成或扩张,目前的主要治疗手段仍然是外科手术干预[3]。最近的证据表明,慢性炎症在AAA发病过程中起到了关键作用,抑制炎症反应可能成为预防AAA的一种有效的治疗方法[4]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素（prostaglandin synthetase,PGs）合成的关键调节酶,可催化花生四烯酸向PGs的转化。COX-2调节促炎性趋化因子的表达,从而影响细胞的增殖和功能[5-7]。在大多数人体组织中通常无法检测到COX-2,但炎症刺激后可迅速诱导产生(例如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或血管紧张素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）[8-9]。在慢性炎性疾病（如动脉粥样硬化）中,COX-2表达明显升高[10]。基因敲除COX-2可显着减轻急性炎症,并降低前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）水平[11]。目前的研究证明免疫系统参与了许多心血管疾病的发病过程[12]。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）作为免疫系统的重要组成部分,在免疫稳态和耐受性中具有重要的保护作用,防止过度的免疫反应[13]。Tregs的功能受损或缺乏会导致免疫失调和自身免疫性疾病[13]。据报道,Tregs在许多心血管疾病中具有保护作用,包括动脉粥样硬化、高血压、心肌炎和扩张型心肌病等[14]。最近,Tregs被证明能够抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠AAA的发生发展[15-16]。然而目前,关于AAA中Treg和COX-2之间的相关性报道甚少。因此,利用AAA模型,我们尝试探索AAA潜在的机制,并寻找其可能的免疫治疗方法。2目的（1）研究Tregs能否抑制AAA的发病;（2）在体内体外实验中,阐明Tregs对COX-2表达的影响,以期明确Tregs发挥保护作用的具体机制;3方法3.1动物模型与干预所有动物实验经山东大学伦理委员会批准,并符合中国卫生部《动物管理规定》的指导原则。从北京大学动物研究中心（中国北京）购买10只C57BL/6J野生型小鼠（雄性,8周龄）,用作Tregs细胞的供体。根据试剂说明书要求,使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec,德国）从C57BL/6J小鼠的脾细胞中获得Treg细胞。将纯化的Treg细胞悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS,200ul）中以进一步注射。在无菌条件下饲养30只C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠（3个月大）,并保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。在整个实验期间,ApoE-/-小鼠均给予高脂饮食（0.25%的胆固醇和15%的可可脂）,并保证足够的食物和水。实验小鼠随机分为三组（每组10只）:对照组（未干预）,PBS组（尾静脉注射PBS）和Tregs组（尾静脉注射106 Treg）。注射一天后,通过皮下置入微量泵连续泵入Ang Ⅱ（1000ng/kg/min）28天,在实验开始2周时再次给予尾注射PBS和Treg[15.17]。实验结束后,对所有小鼠进行安乐死并收集其主动脉组织,储存于-80℃冰箱或用4%多聚甲醛固定以备用。3.2组织学分析小鼠安乐死后,用生理盐水经心脏灌注以清除血管腔中的血液,留取主动脉,用4%多聚甲醛固定。首先,通过测量腹主动脉的最大外径来评估AAA的形成,AAA定义为比正常值扩张至少50%[2]。然后,将腹主动脉包埋在OCT化合物中制作冰冻切片,每张5μm厚,通过苏木精和伊红（H&E）染色及免疫组化染色以评估COX-2的表达（1:500,Abcam,MA,USA）。最后,利用计算机自动辅助图像分析系统（Image Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,美国）计算COX-2的表达量。3.3免疫荧光首先将冰冻切片用BSA封闭30分钟,然后将AAA切片与兔抗COX-2（1:100,abcam,MA,USA）,小鼠抗CD68（1:100,abcam,MA,美国）或小鼠抗α-SM-actin（1:100,Sigma-Aldrich,MO,USA）在4℃孵育过夜。随后在室温条件下将切片与二抗孵育,最后使用含DAPI的抗淬灭封片剂（Vector Laboratories,CA,美国）封片。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM 710,Zeiss,德国）获得图像。3.4细胞共培养和处理在体外研究的第一部分中,在37℃下,用DMEM培养基（含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素）培养RAW264.7小鼠巨噬细胞（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。巨噬细胞分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T 细胞,5×105）和 Tregs 组（CD4+CD25+T 细胞,5×105）,先用抗CD3抗体刺激细胞48小时（50ng/ml）,然后用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收集巨噬细胞以进一步分析。在体外研究的第二部分中,培养的小鼠主动脉平滑肌细胞（SMC,ATCC,美国）,分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T细胞,5×105）,和Tregs组（5×105）。首先用抗CD3抗体（50ng/ml）刺激48小时,然后再用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收获SMC用于进一步分析。3.5 ELISA收集细胞培养基的上清液,并按照ELISA试剂盒（BlueGene Biotech,上海,中国）的说明书测定PGE2的浓度。3.6 MTT通过MTT测定法（Beyotime,北京,中国）确定SMC的活力。操作步骤如下,首先将SMC以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中,给予相应刺激后每孔加入10 μl MTT（5mg/ml）,并在37℃下孵育4小时。小心弃去上清液,再每孔加入75μl的二甲基亚砜（DMSO）。最后使用Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Scientific,Waltham,MO,美国）在 570 nm 处分析样品。3.7实时定量PCR根据试剂的说明书,首先使用Trizol试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA）从腹主动脉和收获的细胞中提取总RNA,然后使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad,Hercules,美国）用1μgRNA作为模板,逆转录合成cDNA,最后进行实时荧光定量PCR以确定CD68,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,精氨酸酶-1（Arg-1）,趋化因子配体9（CCL-9）,COX-2和β-actin mRNA的表达。其中,β-actin用作内参。该研究中使用的引物序列见表1。3.8蛋白质印迹分析首先从腹部主动脉或细胞中提取总蛋白。将各组等量的蛋白质加样,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,然后将目的蛋白电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在5%脱脂牛奶中室温下孵育2小时后,将膜与COX-2（1:500,Abcam,MA,USA）和β-actin（1:1000,CST,美国）的一抗在4℃下孵育过夜。随后,用TBST洗涤3次,将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下孵育2小时。最后,使用增强的化学发光检测系统（美国皮尔斯）拍摄图像。其中,β-actin表达量作为内参。3.9统计分析使用SPSS15.0（SPSS Inc,美国伊利诺伊州芝加哥）软件进行统计分析。数值以平均值±标准差表示,并采用LSD事后分析的单向ANOVA检验进行多次比较。P<0.05被认为具有统计学意义。4结果4.1体内注射Tregs降低了 Ang Ⅱ诱导小鼠AAA的发病率利用AngⅡ持续微量泵入ApoE-/-小鼠以诱导AAA的实验动物模型[17-18],目前已被广泛应用。与既往的研究结果一致,我们的实验发现,在ApoE-/-小鼠中持续泵入AngⅡ可以成功诱导AAA。如图1所示,对照组和PBS组的AAA发生率分别为80%（8/10）和80%（8/10）,而体内注射Tregs（106个细胞）后AAA的发生率只有30%（3/10）,提示Tregs可以明显降低AAA的发生率（P<0.05,图1A和1C）。此外,H&E染色显示,持续泵入Ang Ⅱ显着增加了腹主动脉直径并引起内出血,而注射Treg改善了此现象（P<0.05,图1B和1D）。这些结果证实了以往的研究,即Tregs可以防止AAA的发生和发展。4.2体内注射Tregs降低了小鼠的COX-2表达现有的研究发现,与正常对照小鼠相比,AAA小鼠中COX-2mRNA的表达显着增加[19]。在体内实验中,为了阐明Treg对腹主动脉组织中COX-2表达的潜在影响,我们进行了免疫组织化学染色。与对照组和PBS组相比,Tregs组的COX-2表达明显减弱（P<0.05,图2A和2B）。此外,RT-PCR和蛋白印迹分析还显示,Tregs可显着降低腹主动脉组织中COX-2的mRNA和蛋白质表达（P<0.05,图2C至2E）。4.3 Tregs治疗可降低小鼠SMC和巨噬细胞中COX-2的表达为了观察COX-2在SMC或巨噬细胞中的表达,我们进行了免疫荧光染色。如图3A所示,SMC与COX-2表达共定位,而在AngⅡ+Treg组中,SMC中COX-2的表达明显减少（图3A）。同时,图3B显示在AngⅡ组和AngⅡ+PBS组的巨噬细胞中有COX-2表达,而Treg能够显着降低巨噬细胞中COX-2的表达（图3B）。4.4 Tregs刺激巨噬细胞和SMC后,减少了细胞中COX-2和PGE2的表达已有研究显示在炎性刺激（例如AngⅡ）诱导下COX-2表达明显升高[9]。在内皮细胞中,Ang Ⅱ刺激后,COX-2表达显着增加[20-21]。由巨噬细胞和SMC合成的前列腺素E2（PGE2）可以增加基质金属蛋白酶（MMP）的产生并导致血管壁的降解[22]。先前的研究表明巨噬细胞和SMCs可能是Tregs靶向治疗AAA的主要细胞[15]。因此,在我们的实验中,相继用Tregs和AngⅡ处理巨噬细胞和SMCs,结果发现与对照组相比,Tregs处理可显着降低巨噬细胞中COX-2和PGE2的表达,而CD4+CD25-T细胞对COX-2和PGE2的表达影响不大（P<0.05,图4A至4C）。此外,与对照组相比,Tregs治疗还显着降低了 SMCs中COX-2和PGE2的表达（P<0.05,图4D至4F）。以上结果表明,Tregs治疗可降低Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞和SMC中COX-2和PGE2的表达。4.5 Tregs治疗增加SMCs的活力并诱导巨噬细胞表型的转变随后我们研究了 Treg对SMCs活力和巨噬细胞表型的影响。如图5AMTT结果所示,与AngⅡ组相比,Treg治疗增加了 SMC的活性,而CD4+CD25-T细胞没有改变SMC的活性。此外,RT-PCR显示,Tregs刺激后诱导了巨噬细胞表型的转变,表现为M1相关基因（CD86和iNOS）表达下调和M2相关基因（Arg-1和CCL-9）表达上调（P<0.05,图5B至5E）。这些结果表明,Tregs增加了 SMCs的活性并诱导巨噬细胞表型从M1型转变为M2型。5结论在AAA的体内和体外实验中,Tregs治疗均可显着降低AngⅡ诱导的COX-2的表达,这表明Tregs可能通过抑制COX-2的表达对AAA发挥保护作用,该研究可能为AAA的免疫治疗提供启示。
穆怀玉[8]（2020）在《基于“血-脉-心-神”一体观的“益肾健脾”法对冠心病免疫损伤的干预研究》文中提出目的探讨张军平教授“血-脉-心-神”一体观指导下的“益肾健脾”法治疗冠心病稳定型心绞痛的临床疗效及起效机制。并通过益肾健脾方干预动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）Apo E-/-小鼠,观察益肾健脾方对Apo E-/-小鼠AS形成和发展过程中的作用,从免疫炎症角度探索其可能的作用机制,以阐明“益肾健脾”法改善AS的作用机制,以期对临床起指导作用。方法临床研究共纳入90例稳定型心绞痛属脾肾亏虚证患者,其中治疗组与对照组各45例,对照组予以常规西药治疗,治疗组在常规西药治疗的基础上加益肾健脾方,观察0周、4周时间点,记录患者临床相关资料,并取治疗组静脉血备用。从中医证候疗效、心绞痛疗效和心绞痛相关生活质量疗效三方面评价“血-脉-心-神”一体观指导下的“益肾健脾”法治疗稳定型心绞痛的临床疗效,并从免疫炎症角度探讨其可能的起效机制。实验研究选取C57BL/6J野生型小鼠8只作为空白对照组,Apo E-/-小鼠（C57BL/6J背景）32只,分为模型组、补肾抗衰片组和阿托伐他汀组,每组8只,适应性喂养1周后通过高脂饮食喂养建立AS模型,于12周末取材,通过油红O染色观察主动脉的病理形态学改变,测定血脂相关生化指标TC、TG、HDL-C、LDL-C和炎症指标M-CSF、IFN-γ水平,选取小鼠新鲜骨髓、外周血、脾脏进行流式细胞术检测单核-巨噬细胞含量,免疫荧光法检测小鼠主动脉Foxp1蛋白表达情况。结果1治疗组与对照组患者在治疗前基线资料无显着性差异,具有可比性。2治疗组与对照组0、4周在中医证候疗效、心绞痛疗效及心绞痛相关生活质量疗效方面比较差异具有统计学意义（P<0.05）;治疗4周后两组中医总症积分、中医主症积分、中医次症积分、心绞痛积分及西雅图量表中躯体活动受限积分、心绞痛稳定程度积分、心绞痛发作情况积分、治疗满意度积分和疾病认知度积分均较治疗前降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;治疗4周时,治疗组中医总症积分、中医主症积分和心绞痛积分改善程度较对照组相比有统计学意义（P<0.05）。3益肾健脾方降低4周时血清IFN-γ、MCP-1和M-CSF水平,与0周时相比均有统计学意义（P<0.05）,血清s ST2值4周时略有下降,较治疗前无统计学差异（P>0.05）。4实验动物给药12周时,与对照组比较,模型组TC、TG和LDL-C水平均升高（P<0.01）,HDL-C水平降低（P<0.01）;补肾抗衰片组和阿托伐他汀组HDL-C数值明显高于模型组,具有统计学意义（P<0.01）;阿托伐他汀组LDL-C数值低于模型组,具有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较,模型组M-CSF、IFN-γ水平显着升高,具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组均明显降低,具有统计学意义（P<0.01）。5与对照组比较,模型组在骨髓、外周血、脾脏中Ly6Chigh单核细胞百分比均显着升高（P<0.01）;在骨髓和脾脏中,与模型组相比,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组Ly6Chigh单核细胞百分比均显着降低（P<0.01）;在外周血中,与模型组相比,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组Ly6Chigh单核细胞百分比均有降低趋势;与对照组比较,模型组在骨髓、外周血、脾脏中Ly6Clow单核细胞百分比均降低（P<0.05,P<0.01）;在骨髓中,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组Ly6Clow单核细胞百分比均有升高趋势;在外周血中,与模型组相比,补肾抗衰片组Ly6Clow单核细胞百分比有升高趋势,阿托伐他汀组Ly6Clow单核细胞百分比升高（P<0.05）;在脾脏中,与模型组相比,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组Ly6Clow单核细胞百分比均升高（P<0.05,P<0.01）。6与对照组比较,模型组在脾脏中巨噬细胞百分比显着升高（P<0.01）,在骨髓中巨噬细胞百分比有升高趋势;在骨髓、外周血和脾脏中,与模型组相比,补肾抗衰片组巨噬细胞百分比均有降低趋势;在外周血中,与模型组相比,阿托伐他汀组巨噬细胞百分比有降低趋势;在脾脏中,与模型组相比,阿托伐他汀组巨噬细胞百分比明显降低（P<0.01）。7对照组可见主动脉Foxp1蛋白表达呈散在分布,与对照组相比,模型组Foxp1蛋白表达明显减少（P<0.01）,补肾抗衰片组和阿托伐他汀组与模型组比较,Foxp1蛋白表达明显增多（P<0.01）。结论1“血-脉-心-神”一体观指导下的“益肾健脾”法可以明显缓解稳定型心绞痛患者的中医临床症状以及心绞痛症状,能够提高患者生活质量。2“血-脉-心-神”一体观指导下的“益肾健脾”法治疗稳定型心绞痛患者能够降低血清IFN-γ、MCP-1和M-CSF水平,可能通过抑制炎症反应、调节免疫损伤起效。3益肾健脾方可以降低骨髓、脾脏Ly6Chigh单核细胞百分比,升高脾脏Ly6Clow单核细胞百分比,影响巨噬细胞百分比,改善单核-巨噬细胞分化。4益肾健脾方可以有效促进主动脉Foxp1蛋白表达,提示可能通过Foxp1调节免疫炎症,从而改善动脉粥样硬化。
甘晓文[9]（2020）在《人胎盘合成的血清淀粉样蛋白A1（SAA1）在分娩中的作用》文中研究表明研究目的早产是导致新生儿死亡的主要原因,防治早产仍是产科面临的严峻考验。早产的原因复杂,其高危因素包括全身或局部感染、患有妊娠合并症及并发症、双胎妊娠、前次早产史、宫颈子宫手术史等,但仍有30%左右的早产病因尚未明确,其主要原因之一是人类分娩启动机制尚未完全阐明,因此阐明人类分娩启动的具体机制可以为预测及治疗早产提供新的思路。研究发现妊娠组织的无菌性炎症不仅存在于无明显诱因和无感染证据的早产,同时还是正常分娩启动机制中的重要一环。血清淀粉样蛋白A1（SAA1）是一种急性期反应蛋白,主要由肝脏合成,参与调节炎症反应。近年来发现许多肝外组织也具有合成分泌SAA1的能力,我们既往的研究发现,胎膜合成的SAA1可以在胎膜局部引起炎症反应从而参与分娩,但胎盘是否能够表达和分泌SAA1并参与分娩过程目前尚不清楚。本研究主要目的为明确孕晚期胎盘是否表达和分泌SAA1及其在早产及正常分娩启动的作用及其机制。研究方法本课题采用人胎盘组织和原代培养人胎盘滋养细胞作为研究模型,利用RNA测序、原位杂交、免疫组化、免疫荧光、实时荧光定量PCR、蛋白印迹杂交、ELISA、受体及信号通路抑制剂和小鼠腹腔注射等技术,研究了人胎盘和原代人胎盘滋养细胞SAA1的表达、分泌及调控;研究了SAA1对胎盘滋养细胞促炎性细胞因子和前列腺素合成关键酶环氧合酶-2（COX-2）表达的调控及机制;研究了主要促分娩因子对胎盘滋养细胞SAA1的表达和分泌的影响,并利用小鼠模型,研究了小鼠胎盘SAA1表达及注射SAA1是否能引起早产。研究结果1.体内存在四种SAA基因,分别为SAA1、SAA2、SAA3、SAA4,其中SAA1和2表达蛋白为急性期反应蛋白,SAA3为假基因,而SAA4为细胞固有型表达基因。足月胎盘滋养细胞转录组测序结果表明,SAA4在胎盘滋养滋养细胞表达量极低,SAA1和SAA2在胎盘合体滋养层细胞均有表达,但以SAA1表达量最高。原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光染色结果显示,足月胎盘绒毛组织可以检测到SAA1 mRNA及蛋白,并主要分布于合体滋养细胞层。实时荧光定量PCR、ELISA测定发现,体外培养的人原代胎盘滋养细胞可以表达SAA1 m RNA和分泌SAA1,并随滋养细胞的合体化而显着增加;2.SAA1可以诱导人胎盘合体滋养细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α和前列腺素合成关键酶COX-2的表达,并促进IL-8、TNF-α、PGF2α的分泌,但不影响人胎盘滋养细胞CRH及芳香化酶的表达;3.TLR4受体阻断剂（CLI095）、NFκB阻断剂（JSH-23）、p38阻断剂（SB203580）、ERK1/2阻断剂（PD98059）和JNK阻断剂（SP600125）均可不同程度地阻断SAA1对IL-8、TNF-α和COX-2表达的诱导作用。4.皮质醇、脂多糖（LPS）及TNF-α均可以诱导人胎盘合体滋养细胞SAA1表达和分泌;5.经过产程的胎盘组织SAA1 m RNA及蛋白水平明显高于未经过产程的胎盘组织,并伴有血清SAA1水平的升高;绒毛膜羊膜炎导致的早产血清SAA1水平进一步升高。6.免疫组织化学染色表明,孕晚期小鼠胎盘及卵黄囊膜组织均可表达SAA1;腹腔注射LPS可以引起早产,并伴有胎盘及胎膜SAA水平升高;腹腔注射SAA1也可以引起早产,并增加胎盘组织的IL-1β、TNF-α和COX-2蛋白的表达。结论本课题首次证明足月人胎盘组织可以表达和分泌SAA1,而且其表达随着滋养细胞的合体化而显着增加,促分娩因子如皮质醇、LPS和促炎性细胞因子均可以诱导人胎盘滋养细胞SAA1的表达,分娩时胎盘组织和母体血浆SAA1水平显着增加。SAA1可以通过结合TLR4受体并激活NFκB及MAPK信号通路诱导胎盘合体滋养细胞促炎性因子IL-8、TNF-α和COX-2的表达,提示SAA1可能通过诱导胎盘促炎性因子的表达和前列腺素的合成参与分娩。小鼠腹腔注射SAA1可以促进胎盘促炎性因子的表达并诱导早产发生,动物实验为SAA1参与分娩过程提供了进一步证据。
王刚[10]（2020）在《Kallistatin通过miR-29c-3p/BACH2途径促进ABCA1表达抗动脉粥样硬化》文中认为人组织激肽释放酶结合蛋白（Kallistatin,KAL）是丝氨酸蛋白酶抑制剂中的一种,近年来发现血清中KAL浓度与高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平有相关性,并降低心血管疾病风险,与动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）密切相关,但机制不明。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）是一种膜转运蛋白,在高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）生成过程中发挥关键作用。本论文通过一系列临床、细胞及动物实验探讨了KAL对ABCA1表达与As的影响及机制,发现Kallistatin通过mi R-29c-3p/淋巴细胞转录抑制剂BTB和CNC同源类似物2（B lymphoid transcription repressor BTB and CNC homology 2,BACH2）途径促进ABCA1表达抗As,可为As防治提供新策略。第一章冠心病患者血清中KAL水平的变化目的:观察KAL在CHD患者与对照组血清中含量的变化,同时检测HDL-C水平,探讨KAL与As及HDL-C的相关性。方法:选择研究对象为南华大学附属第一医院心血管内科行冠状动脉造影（coronary angiography,CAG）以及冠状动脉血管内超声（intravenous ultrasound,IVUS）检査的401例患者。采用Gensini积分系统,对每段冠状动脉血管的病变狭窄程度进行定量积分评定,无病变时为0分,最高积分为160分。Gensini积分越高,提示冠状动脉狭窄越严重,As病变也越严重。将研究对象分为共分为四组,分组如下:1、对照组（Control）:Gensini积分0分,冠状动脉无狭窄病变;2、Low Gensini Score（LGS）组:Gensini积分120分,冠状动脉轻度狭窄病变;3、Middle Gensini Score（MGS）组:Gensini积分2040分,冠状动脉中度狭窄病变;4、High Gensini Score（HGS）组:Gensini积分40160分,冠状动脉重度狭窄病变。收集各组血液标本,离心取得血清,使用ELISA法测定纳入对象血清KAL浓度,并检测血清HDL-C水平。确认KAL与As病变及HDL-C的相关性。结果:结果表明,各组患者之间年龄、性别、吸烟史、高血压、BMI等一般情况无明显差异,白细胞（white blood cell,WBC）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、肌酐（creatinine,Cr）、血尿素（Blood urea,BUN）等检查结果也无明显差异。分析各组KAL浓度结果显示对照组为（45.69±9.69）μg/ml,而三组CHD患者血清中KAL浓度均明显下降,LGS组:（34.91±7.72）μg/ml;MGS组:（25.36±7.06）μg/ml;HGS组:（17.90±4.35）μg/ml,可见三组CHD患者血清KAL浓度与对照组比较都有显着差异,并随着Gensini评分的升高而呈现下降的趋势。说明KAL与冠状动脉的As病变严重程度成反比,提示患者体内的KAL含量越少其As越严重。进一步行KAL浓度与HDL-C的相关性后发现,KAL浓度与HDL-C在统计学上有正相关性（R2=0.4981,P<0.05）。提示体内KAL含量越高的患者其HDL-C水平也越高。小结:KAL在CHD患者血清中含量显着下降;KAL浓度与HDL-C水平呈正相关关系。第二章KAL通过mi R-29c-3p/BACH2途径调控巨噬细胞ABCA1表达及脂质蓄积目的:观察KAL对THP-1巨噬细胞ABCA1表达和脂质蓄积的影响,阐明mi R-29c-3p/BACH2途径在KAL对ABCA1表达过程中的调控作用。方法:佛波酯（phorbol myristate acetate,PMA）处理THP-1单核细胞48小时,诱导分化成为THP-1巨噬细胞,继续用50μg/ml浓度的ox-LDL孵育24小时,荷脂后形成THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞。分别以不同浓度（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6μmol/L）的KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24小时,或者用0.8μmol/L的KAL分别处理不同时间（0、6、12、24、48小时）,收集细胞,通过荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR,,q RT-PCR）及Western blot检测ABCA1表达,利用油红O染色法检测细胞内的脂质蓄积,使用液体闪烁计数仪检测胆固醇流出,利用高效液相色谱检测泡沫细胞内的胆固醇含量。确认KAL可上调巨噬细胞ABCA1表达,促进细胞胆固醇流出。利用JASPAR在线网站预测ABCA1启动子序列与BACH2的结合位点。采用PCR方法从THP-1基因组DNA中扩增ABCA1基因启动子片段,插入荧光素酶报告载体p GL3（p GL3-ABCA1–promoter）,将荧光素酶报告基因p GL3-ABCA1-promoter与转录因子BACH2表达质粒共转染293T细胞,使用荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,确认ABCA1启动子区域是否存在BACH2结合位点。将BACH2转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,采用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,CHIP）技术进一步分析BACH2与ABCA1启动子的相互作用。随后将BACH2或BACH2 si RNA转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,通过q RT-PCR及Western Blot检测ABCA1的表达,并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出,证实BACH2是否直接上调ABCA1表达,促进胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,通过荧光定量PCR及Western Blot检测BACH2的表达,明确KAL对BACH2的影响。沉默BACH2的表达后,再使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,通过q RT-PCR及Western Blot检测ABCA1的表达,并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出,明确KAL是否通过BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。利用RNAhybrid、Target Scan等生物信息学在线网站预测mi R-29c-3p与BACH2 3’UTR的结合位点和自由能。从THP-1巨噬细胞DNA中用PCR法扩增BACH2基因3’UTR序列,在其中插入荧光素酶报告载体p GL3（p GL3-BACH2-3’UTR）,并突变BACH2形成突变BACH2荧光素酶报告载体p GL3（p GL3-BACH2-3’UTR-m）,将p GL-3-BACH2-3’UTR或p GL3-BACH2-3’UTR-m与mi R-29c-3p mimic共转染至293T细胞,使用荧光素酶检测试剂盒测定其荧光素酶活性,证实mi R-29c-3p可否直接作用于BACH2。分别用mi R-29c-3p mimic或anti-mi R-29c-3p处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,利用Western Blot及q RT-PCR技术检测细胞内BACH2与ABCA1的表达,并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出,了解过表达或沉默mi R-29c-3p对BACH2、ABCA1表达以及细胞内胆固醇流出的影响。最后使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,采用q RT-PCR检测mi R-29c-3p的表达,明确KAL对mi R-29c-3p水平的影响,使用mi R-29c-3p mimic和KAL共孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,通过q RT-PCR及Western Blot检测BACH2和ABCA1的表达,并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出。明确KAL是否通过mi R-29c-3p靶向沉默BACH2,促进ABCA1表达BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。结果:KAL显着上调巨噬细胞ABCA1表达,并呈浓度和时间依赖性。KAL增加ABCA1介导的胆固醇流出,并减少细胞内总胆固醇、胆固醇酯（cholesteryl ester,CE）和游离胆固醇（free cholesterol,FC）含量,抑制脂质蓄积。生物信息学预测发现,BACH2与ABCA1启动子存在结合位点。进一步通过荧光素酶报告基因和CHIP实验证实BACH2与ABCA1启动子具有结合位点,而过表达BACH2促进ABCA1表达,增加巨噬细胞的胆固醇流出,提示BACH2可与ABCA1结合并促进其转录。KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后,BACH2及ABCA1的m RNA与蛋白水平明显增加,提示KAL可促进BACH2及ABCA1的表达与结合能力。而在si BACH2预处理后,KAL对促进ABCA1表达的作用被逆转,同样细胞内胆固醇流出的促进作用也被逆转。上述结果表明,KAL通过增加BACH2,使ABCA1表达上调,细胞内胆固醇流出增加。多个生物信息学在线网站预测发现mi R-29c-3p与BACH2 3’UTR存在结合位点,且结合自由能低（-23.6kcal/mol）,荧光素酶报告基因等实验进一步发现mi R-29c-3p可直接作用于BACH2,抑制其表达,并显着减少ABCA1。而抑制mi R-29c-3p后可增加BACH2及ABCA1的m RNA和蛋白水平,促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出增加。说明mi R-29c-3p可抑制BACH2及ABCA1的表达,减少胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后,发现KAL明显降低mi R-29c-3p的表达。而使用KAL和mi R-29c-3p mimic共孵育后,与mi R-29c-3p mimic组相比较,降低的BACH2及ABCA1的m RNA和蛋白水平得到一定程度的恢复,减少的胆固醇流出情况也有一定的恢复。这些结果表明,KAL通过抑制mi R-29c-3p增加BACH2、ABCA1的表达及胆固醇流出。小结:KAL上调ABCA1表达,促进胆固醇流出,抑制巨噬细胞内脂质蓄积;KAL通过mi R-29c-3p/BACH2途径增加巨噬细胞ABCA1表达。第三章KAL对apoE-/-小鼠ABCA1及As斑块面积的影响目的:观察KAL对apoE-/-小鼠mi R-29c-3p、BACH2和ABCA1表达,血脂水平,RCT效率和As斑块面积的影响,从而在整体水平揭示KAL的抗As作用及分子机制。方法:60只雄性apoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周后随机分为3组:1、对照组（n=20）:腹腔内注射200μl生理盐水,每周两次;2、低剂量KAL组（n=20）:腹腔内注射KAL,每次0.5mg/kg,加入200μl生理盐水中注入,每周两次;3、高剂量KAL组（n=20）:KAL剂量为每次2mg/kg,余同低剂量组。共连续处理4周。B超检查小鼠主动脉及颈动脉斑块。酶氧化法检测血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量以及肝肾功能。腹腔注射[3H]标记胆固醇的J774细胞,检测血浆、肝脏和粪便中的放射性活性,计算RCT效率。处死小鼠,分离主动脉弓,体视显微镜下观察斑块情况。取小鼠心脏和主动脉,油红O和HE染色检测小鼠主动脉窦及主动脉As斑块面积。q RT-PCR检测主动脉及腹腔巨噬细胞mi R-29c-3p及BACH2、ABCA1的m RNA表达,Western Blot和免疫组织化学检测主动脉及腹腔巨噬细胞BACH2、ABCA1蛋白表达。结果:无论是低剂量还是高剂量的KAL均减少apoE-/-小鼠主动脉弓及主动脉窦处斑块面积,抑制主动脉壁及斑块内脂质沉积,增加斑块胶原含量。证实KAL在动物体内能抑制As病变的进展。KAL降低apoE-/-小鼠主动脉组织中mi R-29c-3p水平,升高主动脉组织及腹腔巨噬细胞中BACH2、ABCA1水平,增加血浆HDL-C水平,促进RCT。提示KAL在体内同样通过抑制mi R-29c-3p表达,从而减少mi R-29c-3p对BACH2的抑制,促进ABCA1的表达,增加胆固醇流出至HDL,促进RCT,最终抑制apoE-/-小鼠As病变的进展。KAL对apoE-/-小鼠体重、肝肾功能及血浆TC、LDL-C、TG水平无明显影响。小结:KAL上调apoE-/-小鼠ABCA1表达,升高血浆HDL-C水平,促进RCT,减轻As病变;KAL在apoE-/-小鼠中通过mi R-29c-3p/BACH2途径增加ABCA1表达。结论1.KAL在CHD患者血清中含量显着下降,并与HDL-C水平呈正相关关系;2.KAL通过mi R-29c-3p/BACH2途径上调ABCA1表达,促进胆固醇流出,抑制巨噬细胞内脂质蓄积;3.KAL在apoE-/-小鼠中通过mi R-29c-3p/BACH2途径增加ABCA1表达,升高血浆HDL-C水平,促进RCT,减轻As病变。
二、Effect of HDL and apo AI on PGE_2 Production by Monocyte-Derived Macrophages（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effect of HDL and apo AI on PGE_2 Production by Monocyte-Derived Macrophages（论文提纲范文）
（1）Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 动脉粥样硬化的影响因素 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 动脉粥样硬化与泡沫细胞形成及巨噬细胞的脂质代谢的相关性 |
| 1.2.1 巨噬细胞胆固醇摄取 |
| 1.2.2 胆固醇酯化及水解 |
| 1.2.3 胆固醇排出 |
| 1.2.4 与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成有关的GWAS发现 |
| 1.3 动脉粥样硬化与巨噬细胞炎症反应 |
| 1.3.1 不同巨噬细胞表型分布 |
| 1.3.2 巨噬细胞功能的多样性 |
| 1.3.3 巨噬细胞极化与动脉硬化 |
| 1.3.4 巨噬细胞与炎性介质 |
| 1.4 动脉粥样硬化与KLF4 |
| 1.4.1 KLF4 与泡沫细胞 |
| 1.4.2 KLF4 与巨噬细胞极化 |
| 1.5 动脉粥样硬化与Phactr1 |
| 1.5.1 Phactr1基因与蛋白 |
| 1.5.2 Phactr1基因的心血管作用 |
| 1.5.3 Phactr1基因多态性及心血管疾病的影响 |
| 第2章 Phactr1缺乏通过促进M1 巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究材料、器材及方法 |
| 2.2.1 主要研究器材及试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加 |
| 2.3.2 Phactr1的消耗可加剧动脉粥样硬化进展 |
| 2.3.3 Phactr1在巨噬细胞中的消耗会加速M1 巨噬细胞极化,炎症和泡沫细胞形成 |
| 2.3.4 Phactr1促进CREB激活和KLF4 转录 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）炎症消退因子LXA4和RvD1与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 综述 炎症消退因子异常在动脉粥样硬化中的作用及机制研究进展 |
| 第3章 资料与方法 |
| 3.1 研究资料 |
| 3.1.1 研究对象分组 |
| 3.1.2 临床资料收集 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 样本采集 |
| 3.2.2 外周血LXA4和Rv D1 水平测定 |
| 3.3 统计方法 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 对照组、AS组及LAA组患者一般临床资料 |
| 4.2 对照组、AS组、LAA组患者外周血LXA4和RvD1水平比较 |
| 4.3 LAA组患者外周血LXA4和RvD1水平随病程的变化 |
| 4.4 亚组分析 |
| 4.4.1 斑块稳定性亚组分析 |
| 4.4.2 血管狭窄程度亚组分析 |
| 4.4.3 神经功能损害程度亚组分析 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 动脉粥样硬化和大动脉粥样硬化型脑梗死危险因素分析 |
| 5.2 脂氧素A4(LXA4)与大动脉粥样硬化型脑梗死相关性分析 |
| 5.3 消退素D1(RvD1)与大动脉粥样硬化型脑梗死相关性分析 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区人群胆固醇代谢相关基因APLP2 新突变位点的筛查及甲基化水平检测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂、耗材和仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 APLP2 基因新变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂耗材及仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 胆固醇代谢相关基因APLP2 与血脂异常的关联性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 APLP2在胆固醇代谢中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 白藜芦醇抗动脉粥样硬化机制研究 |
| 2.1.1 白藜芦醇概述 |
| 2.1.2 抗炎活性 |
| 2.1.3 抗氧化活性 |
| 2.1.4 抑制血小板聚集 |
| 2.1.5 抑制泡沫细胞生成 |
| 2.1.6 新生血管中的作用 |
| 2.1.7 调节血管收缩与扩张 |
| 2.1.8 抑制低密度脂蛋白氧化修饰 |
| 2.1.9 小结 |
| 2.2 SMADS信号通路与动脉粥样硬化 |
| 2.2.1 Smads信号通路概述 |
| 2.2.2 Smads信号通路与动脉粥样硬化 |
| 2.3 白藜芦醇与SMADS信号通路 |
| 第3章 兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型建立与评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 兔颈动脉模型建立可操作性评价 |
| 3.2.2 超声检查判定颈动脉粥样硬化 |
| 3.2.3 解剖颈动脉局部病理学改变 |
| 3.2.4 兔主动脉弓动脉粥样硬化模型评价 |
| 3.2.5 兔心脏采血操作性评价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 利用不同影像技术观察白藜芦醇对兔动脉粥样硬化影响的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 超声观察兔颈动脉粥样硬化 |
| 4.2.2 HRMRI检测兔颈动脉硬化斑块 |
| 4.2.3 PET-CT检测兔颈动脉硬化斑块 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 白藜芦醇介导SMADS信号通路抗动脉粥样硬作用的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 白藜芦醇对兔颈动脉硬化的影响 |
| 5.2.2 兔颈动脉硬化Smads表达及白藜芦醇对其的影响 |
| 5.2.3 兔颈动脉硬化CD31、RAM11、Actin表达及白藜芦醇对其的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 白藜芦醇对动脉粥样硬化兔血脂、LP-PLA2影响的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 动脉粥样硬化兔血脂、Lp-PLA2水平变化 |
| 6.2.2 HE染色病理学观察 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 课题设计 |
| 实验路线 |
| 实验内容 |
| 一、动物实验 |
| 二、临床实验 |
| 三、细胞实验 |
| 四、数据分析方法 |
| 实验结果 |
| 一、小鼠心肌缺血再灌注损伤模型类二十烷酸组学研究 |
| 二、STEMI患者接受PCI手术前后类二十烷酸代谢组学研究 |
| 三、小鼠与人类二十烷酸代谢组学的比较 |
| 分析与讨论 |
| 一、利用类二十烷酸代谢组学方法研究MIRI的意义及研究思路 |
| 二、关于小鼠IR模型中的类二十烷酸组学研究的讨论 |
| 三、关于STMEI患者MIRI过程中类二十烷酸代谢组学研究的讨论 |
| 四、MIRI过程中类二十烷酸代谢的系统性分析 |
| 五、以类二十烷酸代谢通路为靶点对MIRI过程进行系统性干预的策略 |
| 六、本工作的不足之处 |
| 结论 |
| 研究意义 |
| 文献综述 类二十烷酸与心血管病之间的关系 |
| 参考文献 |
| 相关研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化 |
| 1.1 氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白对血管内皮细胞的影响 |
| 1.2.1 氧化型低密度脂蛋白与内皮功能异常 |
| 1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促内质网应激与内皮细胞凋亡 |
| 1.3 氧化型低密度脂蛋白对血管炎症细胞的影响 |
| 1.4 氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞的影响 |
| 2.抗动脉粥样硬化药物研究进展 |
| 2.1 他汀类药物在抗动脉粥样硬化治疗中的应用 |
| 2.2 人参皂苷Rg3抗动脉粥样硬化作用研究进展 |
| 2.3 药物联合应用治疗动脉粥样硬化 |
| 第二章 人参皂苷Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HUVECs的培养、传代和冻存 |
| 2.2 THP-1的培养、传代和冻存 |
| 2.3 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度的确定 |
| 2.4 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 2.5 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.6 划痕实验 |
| 2.7 THP-1细胞黏附实验 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.9 免疫荧光检测 |
| 2.10 qPCR检测炎症因子表达的影响 |
| 2.11 Western Blot |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度 |
| 3.2 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 3.3 Rg3对ox-LDL降低HUVECs细胞生存率的作用 |
| 3.4 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs愈合能力的改善作用 |
| 3.5 Rg3对ox-LDL诱导THP-1对HUVECs黏附的抑制作用 |
| 3.6 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响 |
| 3.7 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs FAK磷酸化的影响 |
| 3.8 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs内MMP-2及MMP-9表达的影响 |
| 3.9 Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的影响 |
| 3.10 GW9662抑制PPARγ表达的浓度确定 |
| 3.11 GW9662和Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的作用 |
| 3.12 GW9662和Rg3对ox-LDL导致HUVECs迁移抑制、THP-1黏附及相关信号通路的作用 |
| 4.小结 |
| 第三章 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 2.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.3 试剂盒检测NO和氧化应激水平 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡 |
| 2.5 DAPI染色 |
| 2.6 qPCR检测 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 3.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL导致HUVECs损伤的改善作用 |
| 3.3 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影响 |
| 3.4 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs氧化应激的影响 |
| 3.5 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影响 |
| 3.6 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影响 |
| 3.7 瑞舒伐他汀对各组细胞Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.8 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响 |
| 3.9 瑞舒伐他汀对各组HUVECs内CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影响 |
| 3.10 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物的饲养 |
| 2.3 动脉粥样硬化模型复制及给药 |
| 2.4 血脂四项指标检测 |
| 2.5 Elisa试剂盒检测小鼠血清CRP水平 |
| 2.6 小鼠主动脉分离及主动脉大体油红O染色 |
| 2.7 HE及MASSON染色 |
| 2.8 免疫组织化学及免疫荧光染色 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 药物对AS小鼠体重及一般状态的影响 |
| 3.2 药物对AS斑块水平对影响 |
| 3.3 药物对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 3.4 药物对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 3.5 药物对AS小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响 |
| 3.6 药物对AS小鼠主动脉纤维斑块层及胶原纤维水平的影响 |
| 3.7 药物对AS小鼠主动脉CD68及α-SMA表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第五章 讨论 |
| 1.体外实验研究 |
| 1.1 Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 2.体内实验研究 |
| 2.1 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 2.2 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 2.3 Rg3与瑞舒伐他汀联用对ApoE~(-/-)小鼠AS病理改变的影响 |
| 结论及创新点 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得科研成果 |
| 致谢 |
（7）炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ :血清白介素增强结合因子3对动脉粥样硬化斑块破裂预测价值的研究 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ:白介素增强结合因子3在斑块易损性中的作用与机制研究 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅲ:调节性T细胞抑制COX-2表达对腹主动脉瘤发挥保护作用 |
| 中文摘要Ⅲ |
| 英文摘要Ⅲ |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（8）基于“血-脉-心-神”一体观的“益肾健脾”法对冠心病免疫损伤的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 理论部分 基于“血-脉-心-神”一体观探讨“益肾健脾”法干预冠心病 |
| 1 “血-脉-心-神”一体观的理论基础 |
| 2 “血-脉-心-神”一体观贯穿冠心病始终 |
| 3 “血-脉-心-神”一体观指导下的“益肾健脾”法 |
| 4 验案举隅 |
| 临床部分 “益肾健脾”法治疗稳定型心绞痛的临床疗效观察及机制研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 小结 |
| 实验部分 |
| 实验一 益肾健脾方对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 益肾健脾方干预动脉粥样硬化小鼠单核-巨噬细胞分化的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 单核-巨噬细胞免疫代谢在动脉粥样硬化中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）人胎盘合成的血清淀粉样蛋白A1（SAA1）在分娩中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.主要实验仪器 |
| 2.常用试剂与耗材 |
| 3.实验试剂配制 |
| 3.1 免疫组织化学检测试剂 |
| 3.2 胎盘滋养细胞分离及原代培养试剂 |
| 3.3 蛋白提取试剂 |
| 3.4 蛋白定量试剂 |
| 3.5 Western blot实验试剂 |
| 3.6 组织免疫荧光染色试剂 |
| 3.7 原位杂交试剂 |
| 3.8 药物配制方法 |
| 3.9 实验所用激动剂和拮抗剂 |
| 3.10 实验所用抗体 |
| 4.实验材料 |
| 5.实验方法 |
| 5.1 人胎盘绒毛组织SAA1 的原位杂交染色 |
| 5.2 人胎盘绒毛组织SAA1 的免疫组织化学染色 |
| 5.3 胎盘绒毛组织免疫荧光染色 |
| 5.4 人胎盘绒毛组织蛋白的提取 |
| 5.5 人胎盘绒毛组织总RNA的提取 |
| 5.6 人晚孕胎盘滋养细胞的原代培养及加药处理 |
| 5.7 滋养细胞总RNA提取 |
| 5.8 人胎盘滋养细胞的转录组高通量测序 |
| 5.9 实时荧光定量PCR |
| 5.10 提取细胞总蛋白 |
| 5.11 BCA法测定样本蛋白浓度 |
| 5.12 蛋白质免疫印迹杂交(Western Blot) |
| 5.13 ELISA测定孕妇血清、胎盘组织及滋养细胞培养液SAA1、IL-1β、IL-8、TNF-α、PGE_2和PGF_2α含量 |
| 5.14 动物实验 |
| 5.15 统计分析 |
| 结果 |
| 1.人胎盘滋养细胞合体化前后转录组学测序结果 |
| 2.SAA1 在人胎盘绒毛组织的分布与表达 |
| 3.SAA1 诱导人胎盘合体滋养细胞促炎因子和前列腺素合成及其机制 |
| 3.1 SAA1 促进人胎盘合体滋养细胞IL-1β、IL-8、TNF-α的表达 |
| 3.2 SAA1 促进人胎盘合体滋养细胞COX-2 的表达和前列腺素的合成 |
| 3.3 SAA1 不影响人胎盘合体滋养细胞CRH及芳香化酶的表达 |
| 3.4 TLR4 介导了SAA1对人胎盘合体滋养细胞IL-8、TNF-α和COX-2 的诱导作用 |
| 3.5 NFκB参与SAA1对人胎盘合体滋养细胞IL-8、TNF-α和COX-2 的诱导作用 |
| 3.6 MAPK信号通路参与SAA1对人胎盘合体滋养细胞IL-8、TNF-α和COX-2 的诱导作用 |
| 4.人胎盘滋养细胞SAA1 表达受LPS、皮质醇及TNF-α的调控 |
| 4.1 LPS对人胎盘合体滋养细胞SAA1 表达的影响 |
| 4.2 糖皮质激素对人胎盘合体滋养细胞SAA1 表达的影响 |
| 4.3 TNF-α和 IL-8 对人胎盘合体滋养细胞SAA1的表达的影响 |
| 5.SAA1 水平在正常分娩及感染性早产中的变化 |
| 5.1 血清及胎盘组织SAA1 含量与足月正常分娩过程相关 |
| 5.2 血清SAA1 水平与感染性早产的关系 |
| 6.动物实验 |
| 6.1 SAA1 在孕晚期小鼠胎盘及胎膜组织的分布与表达 |
| 6.2 孕晚期小鼠胎盘及胎膜组织中SAA1 蛋白表达量的变化 |
| 6.3 腹腔注射常规剂量LPS诱导胎膜及胎盘的SAA1 |
| 6.4 腹腔注射SAA1 引起早产 |
| 6.5 孕鼠腹腔注射SAA1 引起胎盘促炎性细胞因子水平增加 |
| 6.6 腹腔注射SAA1 引起小鼠胎盘COX-2 蛋白增加 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1.SAA1 在胎盘的表达及其意义 |
| 2.SAA1 诱导人胎盘合体滋养细胞促炎基因的表达及机制 |
| 3.糖皮质激素和促炎性因子对人胎盘合体滋养细胞SAA1 的诱导作用 |
| 结论 |
| 综述-急性期反应蛋白血清淀粉样蛋白(A-SAA)研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）Kallistatin通过miR-29c-3p/BACH2途径促进ABCA1表达抗动脉粥样硬化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语中英文索引 |
| 绪论 |
| 第1章 冠心病患者血清中KAL水平的变化 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第2章 KAL通过miR-29c-3p/BACH2 途径调控巨噬细胞ABCA1 表达及脂质蓄积 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第3章 KAL对apoE~(-/-)小鼠ABCA1及As斑块面积的影响 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的科研成果 |
| 课题资助 |
| 致谢 |
四、Effect of HDL and apo AI on PGE_2 Production by Monocyte-Derived Macrophages（论文参考文献）
- [1]Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展[D]. 李特. 吉林大学, 2021(01)
- [2]炎症消退因子LXA4和RvD1与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究[D]. 李安然. 吉林大学, 2021(01)
- [3]APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究[D]. 贾林·阿布扎力汗. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究[D]. 徐磊. 吉林大学, 2020(03)
- [5]心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究[D]. 张刘洋. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [6]基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究[D]. 耿嘉男. 吉林大学, 2020(01)
- [7]炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究[D]. 刘斌. 山东大学, 2020(01)
- [8]基于“血-脉-心-神”一体观的“益肾健脾”法对冠心病免疫损伤的干预研究[D]. 穆怀玉. 天津中医药大学, 2020(04)
- [9]人胎盘合成的血清淀粉样蛋白A1（SAA1）在分娩中的作用[D]. 甘晓文. 上海交通大学, 2020(01)
- [10]Kallistatin通过miR-29c-3p/BACH2途径促进ABCA1表达抗动脉粥样硬化[D]. 王刚. 南华大学, 2020(01)
标签：巨噬细胞论文; 动脉粥样硬化指数论文; 冠状动脉粥样硬化论文; 单核细胞论文; 动脉硬化症论文;