一、肝癌患者PBMC的TNFRⅠ、Ⅱ的表达及治疗对表达率的影响（论文文献综述）
兰晶[1]（2020）在《共刺激分子OX40、PD-1分子在乳腺癌T细胞与B细胞相互调控中的作用及生物学意义》文中研究指明第一部分 乳腺肿瘤患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子的表达及与TFH、TFR细胞亚群的相关性目的:浸润性乳腺癌患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子与TFH、TFR细胞亚群的相关性还不明确,通过研究OX40、PD-1、CXCR5分子的表达并分析其与TFH、TFR细胞亚群的相关性,明确浸润性乳腺癌患者外周血OX40、PD-1、CXCR5分子的表达和TFH、TFR细胞亚群的分布情况及与临床病理特征的相关性。方法:采用免疫组织化学方法、流式细胞仪检测肿瘤局部组织以及乳腺肿瘤患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子的表达及其与TFH、TFR细胞亚群的相关性,并分析这些分子及细胞亚群与临床病理参数之间的相关性;利用全基因测序技术分析OX40信号激发与TFH细胞相关基因的表达情况;利用TRAF6敲基因小鼠分析OX40信号阻断后,TFH细胞相关分子及细胞因子的表达情况。结果:（1）浸润性乳腺癌肿瘤局部组织PD-1分子与CD4+T细胞密度显着高于原位癌及纤维腺瘤,其差异有明显统计学意义（P=0.001,z=-5.548;P=0.001,z=-4.418）;（2）随着肿瘤组织学分级的升高以及临床分期的增加,肿瘤周围浸润淋巴细胞中PD-1蛋白阳性表达也随之升高,其差异有显着统计学意义（P=0.009,z=-2.792;P=0.017,z=-1.151）;且浸润性乳腺癌肿瘤局部浸润淋巴细胞PD-1蛋白阳性表达与CD4+T细胞存在共表达（P=0.014,kappa=0.19）;（3）浸润性乳腺癌患者外周血检测结果显示随着TNM临床分期的升高,PD-1+CD4+T细胞、TFH细胞的百分率也随之上升（P=0.03,P=0.01）;同时,随着肿瘤直径的增大,外周血中TFH、TFR细胞的百分率也明显升高,差距具有显着统计学意义（P=0.01,P=0.03）;（4）随着TNM临床分期的升高和肿瘤直径的增加,浸润性乳腺癌患者外周血中TFH细胞其表面OX40分子的表达呈下降趋势,但未见明显统计学差异（P>0.05）;（5）相关性分析结果显示,浸润性乳腺癌患者外周血中CXCR5与TFH细胞（r=0.37,P<0.01）、OX40与 TFH 细胞（r=0.26,P=0.01）、PD-1 与 TFH 细胞（r=0.55,P<0.01）、CXCR5 与TFR细胞（r=0.42,P<0.01）、PD-1与TFR细胞（r=0.48,P<0.01）均存在显着正相关性。（6）全基因测序结果显示,OX40信号的激发可上调小鼠CXCR5、IL-21、IL-9、Tnfrsf4等相关基因的表达;（7）OX40信号激发下,相对野生型,TRAF6基因敲除后,小鼠TFH细胞的百分率以及细胞因子IL-21的分泌显着下降（P=0.001;P=0.001）。结论:肿瘤局部浸润淋巴细胞以及外周血CD4+T细胞上PD-1分子的表达、TFH细胞的百分率均与乳腺癌患者临床分期密切相关,且OX40信号的激发可影响TFH细胞表面分子的表达以及细胞因子IL-21的分泌。第二部分 乳腺癌外周血中TFH细胞和TFR细胞与B细胞亚群的相关性及其生物学意义目的:浸润性乳腺癌患者外周血中TFH、TFR与B细胞亚群的相关性及其生物学意义尚不明确,通过研究B细胞亚群及TFH、TFR细胞亚群和细胞表面OX40的分布,了解TFH、TFR与B细胞亚群的相关性及其生物学意义。方法:采用流式细胞仪检测乳腺肿瘤患者外周血中成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞及长寿命浆细胞与TFH、TFR细胞亚群的相关性,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性。结果:（1）浸润性乳腺癌患者外周血中成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞、长寿命浆细胞显着高于健康人,其差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）在临床Ⅰ期和Ⅳ期、ER阴性、PR阴性以及三阴性乳腺癌中,患者外周血中成熟B细胞百分率明显增加并具有显着统计学意义（P=0.008;P<0.001;P<0.001;P<0.001）;（3）随着TNM分期增加,记忆性B细胞的数量呈下降趋势;经统计学分析,差异具有统计学意义（P=0.010）;在HER2亚型和TNBC组中有较高记忆性B细胞（P=0.006）,且记忆性B细胞与HER2阳性表达存在显着的相关性（P=0.007）;（4）浆母细胞与淋巴结转移具有显着统计学意义（P=0.001）;（5）长寿命浆细胞的百分率在TNM分期的Ⅱ期和Ⅳ期明显低于Ⅰ期和Ⅲ期,差距具有统计学意义（P=0.025）;（6）相关性分析结果显示,记忆性B细胞与成熟B细胞（r=0.58,P<0.01）、浆细胞（r=0.41,P<0.01）、浆母细胞（r=0.40,P<0.01）、长寿命浆细胞（r=0.81,P<0.01）均成正相关;成熟B细胞与浆母细胞（r=0.43,P<0.01）、长寿命浆细胞（r=0.69,P<0.01）、浆细胞（r=0.46,P<0.01）均成正相关;长寿命浆细胞与浆母细胞（r=0.65,P<0.01）、浆细胞与浆母细胞（r=0.78,P<0.01）、浆细胞与长寿命浆细胞成（r=0.66,P<0.01,）均成正相关;（7）OX40+TFH细胞分别与浆母细胞（r=0.26,P=0.03）、长寿命浆细胞（r=0.32,P=0.01）、浆细胞（r=0.26,P=0.04）成正相关。结论:浸润性乳腺癌患者外周血中存在一定数量的成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞以及长寿命浆细胞且彼此成正相关,且TFH细胞表面OX40分子与浆细胞的活化过程存在相关性。这提示体液免疫也是浸润性乳腺癌肿瘤免疫中一种形式,且与肿瘤临床分期、分子分型密切相关。第三部分 乳腺癌外周血中B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义目的:浸润性乳腺癌患者外周血中B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义尚不明确,通过检测CD4+T细胞与CD19+B细胞及各自亚群的分布情况及相关性,观察其表面CD24、CD38和PD-L1分子的表达,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性,了解B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义。方法:采用流式细胞仪检测乳腺肿瘤患者外周血中CD4+T细胞与CD19+B细胞及各自亚群的分布情况及相关性,观察其表面CD24、CD38和PD-L1分子的表达,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性。结果:（1）浸润性乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-Tregs细胞显着高于纤维腺瘤患者和健康人,其差异具有统计学意义（P<0.05）;且CD4+CD25+CD127low/-Tregs低表达PD-1分子,而CD4+CD25+CD127+效应性T细胞则高表达PD-1分子（P<0.05）;（2）浸润性乳腺癌患者外周血中CD19+CD24+CD38+Bregs的百分率显着高于良性患者和健康人（P<0.05）,且分泌高水平的IL-10（P=0.046）;（3）浸润性乳腺癌患者外周血中,相对于non-Bregs,无论是PD-L1lo还是PD-L1hi都高表达于 CD19+CD24+CD38+Bregs（P<0.001）,且随着 TNM 分期升高,CD19+CD24+CD38+PD-L1+Bregs的百分率也随之升高（P=0.011）;（4）通过浸润性乳腺癌患者外周血中各细胞亚群的相关性进行分析发现,CD4+T细胞和CD19+B细胞（r=0.397,P<0.001）、CD4+CD25+CD127low/-Tregs 和 CD19+CD24+CD38+Bregs（r=0.316,P=0.001）、PD-L1+Bregs 和 CD19+CD24+CD38+Bregs（r=0.267,P=0.007）、PD-L1+Bregs 和 CD4+CD25+CD127low/-Tregs（r=0.299,P=0.003）均存在正相关;而 PD-L1+Bregs 与 PD-1hi CD4+CD25+CD127+效应 T 细胞则存在着负相关（r=-0.22,P=0.031）。结论:浸润性乳腺癌患者外周血中存在高水平CD4+CD25+CD127low/-Tregs和分泌 IL-10 的 CD19+CD24+CD38+Bregs,其中 CD19+CD24+CD38+Bregs 高表达 PD-L1分子并与CD4+CD25+CD127low/-Tregs呈正相关,与PD-1hi效应性T细胞呈负相关,提示PD-1/PD-L1信号可能介导效应性T细胞的凋亡。
赵英杰[2]（2020）在《sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制》文中研究指明类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的炎性、慢性、系统性自身免疫病,其发病机制可能与T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞等各种细胞、炎症细胞因子共同作用有关,目前还没有令人满意的治疗方法。肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）在RA的发病机制中扮演重要角色,其与细胞上的肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor,TNFR）结合,在诱导RA炎症介质的产生、炎症细胞浸润、滑膜血管翳形成、骨侵蚀等病理生理过程中起重要作用。临床上,以依那西普（Etanercept）为代表的TNF-α抑制剂,在治疗中重度和难治性RA中起到举足轻重的作用。Etanercept是人可溶型肿瘤坏死因子受体Ⅱ（soluble tumour necrosis factor receptorⅡ,sTNFRⅡ）与人免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G1的Fc段构建的融合蛋白,作为一种假受体,通过竞争性地结合TNF-α,阻断了TNF-α信号的传递,从而抑制细胞的活化。但是,由于其作用于单一靶点,不能从多个环节调控,发挥治疗作用,而且全身给药靶向性不强,并且可能引发感染、肿瘤和耐药等问题。因此,目前急需一种安全、有效、容易获取的载体,将药物送达患处,减少不良反应的发生。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于其具有免疫原性低、具有“归巢”至炎症部位促进组织再生和损伤修复能力、免疫调节能力、多向分化能力等特点,为免疫相关性疾病的治疗研究提供了新的思路。目前,已经有多项临床试验证实了使用MSC治疗RA的安全性和有效性。然而,有研究表明,炎性环境并不利于MSC发挥其治疗作用。炎性细胞因子（特别是TNF-α）能够诱导MSC发生自噬和凋亡,并且增加MSC中HLA-DR的表达,从而加速机体免疫细胞对MSC的清除,影响MSC的治疗效果。RA也是一种炎性、系统性自身免疫病,体内伴随多种炎性细胞因子水平的升高,那么MSC在RA炎性微环境中是否会发生凋亡和自噬,从而影响其疗效,目前还未见报道。因此,MSC在炎症性疾病治疗中的应用,应当考虑降低炎性微环境对其凋亡和自噬的诱导作用,从而提高MSC的治疗效果。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展,以MSC作为生物活性物质的细胞载体,靶向治疗RA具有可行性,其突出特点可能包括:（1）MSC作为基因治疗的细胞载体。（2）基因修饰的MSC仍保留其免疫调节和分化特性,抑制炎症和修复受损的关节组织。（3）MSC基因修饰后增强某基因表达,基因修饰的MSC可以“归巢”到局部炎症受损部位,避免大剂量系统性给药带来的全身不良反应。本课题拟构建能够稳定表达sTNFRⅡ-Fc的人脐带MSC（umbilical cord derived-MSC,UC-MSC）稳定细胞株（sTNFRⅡ-MSC）。运用基因转染、Transwell小室、细胞流式术、Q-PCR等技术,研究sTNFRⅡ-MSC对RA经典动物模型（小鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA））的治疗作用和特点;体外在TNF-α的作用下,探讨sTNFRⅡ-MSC是否能够通过分泌sTNFRⅡ-Fc,结合并中和TNF-α,减少TNF-α诱导MSC的凋亡和自噬,从而更好地发挥其治疗作用,为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。目的:构建sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人UC-MSC（sTNFRⅡ-MSC）。明确sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性,以及sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用,揭示sTNFRⅡ-MSC是通过怎样的机制,多靶点、多环节调节免疫反应而发挥作用。为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。方法:1.采用全合成方法构建sTNFRⅡ和IgG1-Fc基因片段,两段基因中间用柔性肽（5’-GGAGGTGGAGGATCA-3’）连接,得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,通过混合克隆法和有限稀释法构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株sTNFRⅡ-MSC。2.细胞流式术检测sTNFRⅡ-MSC表面分子标志物（CD45、HLA-DR、CD34、CD90、CD73和CD105）,检测sTNFRⅡ-MSC成骨、成软骨和成脂分化能力,用TNF-α和IL-1β刺激后,Western blot法和免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC中VCAM-1和ICAM-1的表达。使用transwell小室共培养sTNFRⅡ-MSC和RA患者成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）,TNF-α和IL-1β刺激后,ELISA法检测共培养体系中RANKL和OPG的水平。用sTNFRⅡ-MSC和Etanercept预处理NOD/SCID小鼠,LPS腹腔注射诱导急性炎症,ELISA法检测0 h,1.5 h和6 h小鼠血清中人sTNFRⅡ、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。3.使用鸡Ⅱ型胶原诱导建立小鼠CIA模型,尾静脉注射sTNFRⅡ-MSC或UC-MSC,皮下注射Etanercept,给药四周。观察各组小鼠整体指标（体重、关节炎指数和关节肿胀数）变化,胸腺和脾脏指数变化,对各组小鼠脾脏和踝关节病理进行评分,CCK-8法检测LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应,ELISA法检测各组小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ、IL-10、IgG1、anti-CⅡ和IgG2a水平,流式细胞术检测CIA小鼠脾脏T和B细胞亚群变化,免疫组化法检测小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5、CollagenⅡ、MMP-13和TIMP-1的表达,免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC在CIA小鼠脾脏和关节组织中的分布情况,免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的UC-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达情况。4.分离CIA小鼠CD4+T细胞,与sTNFRⅡ-MSC共培养,QPCR法检测CD4+T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、ROR-γt、Bcl6和Foxp3的表达。5.用TNF-α和放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中Bax、Bcl2、Caspase 8、Caspase 3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase 3、LC3B-Ⅱ和TRIB3蛋白的表达,Annexin V/PI法和TUNEL法检检测sTNFRⅡ-MSC凋亡。CCK-8法检测TNF-α诱导的凋亡和自噬对sTNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响。用TNF-α刺激sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达。结果:1.成功构建sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株采用全合成方法得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,成功获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,筛选得到sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株,sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的纯度可达98%以上。2.sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性我们检测了sTNFRⅡ-MSC培养上清中人sTNFRⅡ的水平,结果显示,慢病毒转染后第一代和第三代sTNFRⅡ-MSC均能够分泌较高水平的sTNFRⅡ-Fc。那么sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染后的UC-MSC是否还保留其固有生物学特性呢?我们发现,sTNFRⅡ-MSC几乎不表达CD45,CD34,HLA-DR,其阳性率均在2%以下;并且sTNFRⅡ-MSC高表达CD105,CD73和CD90,其阳性率均在99%以上。同时,sTNFRⅡ-MSC仍然保留成骨、成软骨和成脂分化能力。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC仍然保留UC-MSC的固有生物学特性。进一步我们检测sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc在体外是否具有生物学效应。结果显示,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调,而对IL-1β诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调没有作用,并且sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的与RA患者FLS共培养体系中RANKL和OPG的上调,而对IL-1β诱导的共培养体系中RANKL和OPG的上调没有作用。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc体外能够选择性中和TNF-α,从而发挥其生物学效应。在sTNFRⅡ-MSC体内生物学特性检测中我们发现,NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS1.5 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清中sTNFRⅡ的水平显着降低。NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 1.5 h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清TNF-α水平急剧增加,达到2000pg/ml左右,而sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平显着低于EGFP-MSC组和Etanercept组,LPS腹腔注射6 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平仍然显着低于Etanercept组。在NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 6h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清IL-1β和IL-6水平开始增加,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清IL-1β和IL-6水平显着低于EGFP-MSC组和Etanercept组。结果提示,sTNFRⅡ-MSC可以通过分泌sTNFRⅡ-Fc,从而阻断小鼠体内TNF-α的生物学功能,降低其他炎性因子水平。3.sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用sTNFRⅡ-MSC移植可明显恢复CIA小鼠体重,降低关节炎指数和关节肿胀数评分,降低CIA小鼠脾脏指数,降低脾脏和踝关节病理评分。sTNFRⅡ-MSC可明显下调LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应。sTNFRⅡ-MSC可明显下调CIA小鼠血清中IL-17、IFN-γ、anti-CCⅡ、IgG2a的水平,明显上调IL-10和IL-4的水平。免疫组化结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可明显下调CIA小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5和MMP-13的表达,明显上调踝关节软骨中CollagenⅡ的表达,对软骨和滑膜组织中TIMP-1的表达无明显影响。流式细胞术结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可显着下调CIA小鼠脾脏Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Tfh（CD4+CXCR5+PD-1+）和浆细胞（CD19-CD138+）的比例,显着上调Th2（CD4+IL-4+）、Treg（CD4+CD25+Foxp3+）和Breg（CD19+IL-10+）比例。4.sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠脾脏CD4+T细胞相关转录因子表达的影响QPCR结果显示,sTNFRⅡ-MSC能显着下调CIA小鼠脾脏CD4+T细胞中转录因子T-bet、ROR-γt、Bcl6的表达,显着上调Foxp3和GATA-3的表达。5.sTNFRⅡ-MSC能够迁移到CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,并且sTNFRⅡ-Fc基因修饰可以减少UC-MSC凋亡和自噬的发生免疫荧光结果显示,sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后,d 1到d 14均能在CIA小鼠脾脏和踝关节组织中检测到EGFP+CD105+sTNFRⅡ-MSC。我们在sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后d 7检测CIA小鼠脾脏组织中EGFP+sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达,结果显示,与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达明显减少。6.TNF-α能够诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,降低其免疫抑制能力,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α的这一作用Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,UC-MSC中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显增加,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显降低。Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,与UC-MSC组相比,sTNFRⅡ-MSC组中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显降低,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显增加。CCK-8结果显示,TNF-α诱导的自噬和凋亡降低UC-MSC的免疫抑制能力,而sTNFRⅡ-MSC可以抵制TNF-α功能。7.TNF-α对sTNFRⅡ-MSC向软骨细胞分化的影响Western Blot结果显示,TNF-α处理后,UC-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显降低,而与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显增加。阿利新蓝染色结果显示,TNF-α处理后,在成软骨诱导培养液中的UC-MSC无法聚集成球状,而且阿利新蓝着色浅;与EGFP-MSC相比,成软骨诱导培养液中的sTNFRⅡ-MSC成球状生长,且阿利新蓝着色深。结论:1.本课题首次以UC-MSC为载体,利用慢病毒转染,成功构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株（sTNFRⅡ-MSC）,并且sTNFRⅡ-MSC仍然保留其MSC的固有生物学特性。2.sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc融合蛋白在体内外均具有生物学效应,通过中和细胞培养上清和血清中的TNF-α发挥作用。3.与UC-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠具有更好的治疗作用。sTNFRⅡ-MSC能够迁移至CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,通过调控CIA小鼠T、B细胞活化和分化,降低炎性细胞因子水平和促进组织修复发挥其治疗作用。4.炎性环境不利于UC-MSC发挥其治疗作用。CIA小鼠体内的炎性环境以及体外TNF-α刺激均会诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,影响UC-MSC发挥其治疗作用,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,降低炎性细胞因子水平,减少其凋亡和自噬的产生。5.TNF-α抑制UC-MSC向软骨细胞分化,影响UC-MSC的软骨修复功能,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,增强其软骨分化能力。
金正宇[3]（2019）在《负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义及其免疫调节作用初步分析》文中研究说明胆囊癌是一种起源于胆囊上皮的恶性肿瘤。在消化系统恶性肿瘤中,胆囊癌发病率虽然不高,但具有恶性程度高、进展迅速的特点。胆囊癌常继发于慢性胆囊炎或胆囊结石,早期症状往往不明显,易被原发病掩盖,当出现明显临床症状时,往往已进展至中、晚期,大部分患者此时已失去了行根治性手术的机会。胆囊癌对放、化疗多不敏感。对于无法行根治性手术的胆囊癌患者,目前的治疗手段多采用姑息性手术治疗,其目的仅在于减轻或解除患者黄疸或十二指肠梗阻症状,无法延缓肿瘤进展。这类患者的预后较差,总生存期较短,3年生存率低于20%。肿瘤免疫学的建立将肿瘤的临床诊治与基础免疫研究紧密结合,对指导肿瘤的免疫治疗具有重要意义。随着研究者对机体免疫功能与肿瘤发生、发展相互关系研究的逐渐深入,目前,一系列的肿瘤免疫治疗方法已进入临床。以EGFR/HER为靶点的靶向抗体,如:西妥昔单抗、曲妥珠单抗在胆囊癌的免疫治疗中取得了一定的成效,但仍存在敏感性差、耐药率高等特点,一定程度上制约了免疫治疗在胆囊癌患者中的推广。以负性共刺激分子为靶点的免疫调节剂有望改善这一困境。负性共刺激分子,又称免疫检查点,主要通过抑制免疫细胞功能来下调免疫应答。B7家族被认为是导致肿瘤免疫逃逸的关键调节分子。已存研究表明,B7家族成员,如:PD-1、B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H7等免疫检查点分子,在多种肿瘤组织中呈异常表达,表达水平与患者预后相关。鉴此,研究胆囊癌组织中B7家族分子的表达规律及其临床意义对探讨胆囊癌的免疫治疗具有重要意义。本研究首先通过收集胆囊癌患者的肿瘤和癌旁组织病理切片,检测了 B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌和癌旁组织中的表达,发现这三个分子在胆囊癌组织中表达均上调。在此基础上,分析了这三个分子与相应临床病理特征以及相互表达间的相关性,初步探讨了三者在胆囊癌中表达的临床意义。然后,使用PBMC（外周血单个核细胞）和胆囊癌细胞株GBC-SD构建了共培养体系,加入阻断型抗体分别或联合阻断这三个分子。初步探讨胆囊癌细胞表达B7-H1、B7-H3及B7-H4对免疫细胞的负性调节作用。第一部分负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义目的:研究B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中的表达并分析其临床意义。方法:收集2014年10月至2017年6月期间苏州大学附属第一医院行手术治疗并经病理确诊的90例胆囊癌病理石蜡切片,记录患者年龄、性别、临床分期、病理分级等临床资料,同时收集其中20例的癌旁组织作为对照。免疫组化SP法检测胆囊癌组织和癌旁组织中B7-H1、B7-H3及B7-H4的表达。对比B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌以及癌旁组织中表达的差异性,并分析三者与临床病理参数间的相关性。结果:（1）B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中的阳性高表达率分别为:68.8%（62/90）、40.0%（36/90）、34.4%（31/90）,而在癌旁组织中的阳性高表达率分别为:30%（6/20）、5.0%（1/20）、5.0%（1/20）;B7-H1表达程度与胆囊癌有无远处转移相关,B7-H3表达程度与浸润深度、Nevin分期、AJCC临床分期、血清CA125水平及淋巴结转移呈正相关,B7-H4表达程度与肿瘤直径呈正相关;（2）B7-H1和B7-H4的表达呈正相关,B7-H3和B7-H4的表达呈显着正相关。Spearman相关性分析结果显示,B7-H3和B7-H4在表达上的关联性较B7-H1和B7-H4的关联更为显着。结论:（1）负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中呈异常表达。B7-H1与胆囊癌远处转移相关,B7-H3与胆囊癌进展有一定关联性,而B7-H4参与胆囊癌原位生长。（2）B7-H1和B7-H4、B7-H3和B7-H4在表达上呈正相关。综合检测三者表达对评估患者预后有一定的临床意义。第二部分胆囊癌细胞表达的B7-H1、B7-H3及B7-H4对外周血淋巴细胞抑制作用的初步分析目的:比较胆囊癌细胞表达的B7-H1、B7-H3及B7-H4对PBMC的体外抑制作用及其阻断效应。方法:细胞免疫组化SP法及单标流式细胞术检测B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌细胞株GBC-SD的表达。利用经丝裂霉素处理的GBC-SD与PBMC共培养以模拟胆囊癌免疫微环境。设立同型对照组、单分子阻断组、双分子联合阻断组及三分子联合阻断组。按组别分别或联合加入B7-H1阻断型抗体、B7-H3阻断型抗体或B7-H4阻断型抗体,CCK-8法测定各组吸光度。通过各组PBMC的计数变化,比较并分析B7-HI、B7-H3及B7-H4分子阻断的作用。结果:（1）细胞免疫组化及单标流式细胞术均显示B7-H1、B7-H3及B7-H4在GBC-SD细胞中表达;（2）阻断B7-H1、B7-H3及B7-H4分子中的任何一个均能增加共培养环境中PBMC细胞数,且组间对比结果显示,阻断B7-H3、阻断B7-H3和B7-H4或阻断B7-H1、B7-H3和B7-H4后PBMC细胞数增加显着。结论:（1）B7-H1、B7-H3及B7-H4分子在胆囊癌细胞的表达可介导显着的免疫负调控作用;（2）体外共培养实验显示,B7-H3分子阻断、B7-H3和B7-H4联合阻断及B7-H1、B7-H3和B7-H4联合阻断作用显着。B7-H3可能是胆囊癌免疫治疗的一个有效靶点。
庄小津[4]（2019）在《靶向肝癌细胞的不同GPC3单链抗体构建的CAR-T细胞的作用》文中研究表明研究目的构建以HN3为单链抗体的GPC3-CAR慢病毒表达载体,将其与以GC33为单链抗体的GPC3-CAR慢病毒表达载体修饰的T细胞进行比较,检测它们对肝癌细胞杀伤的靶向性、有效性的差异,选择更优化的GPC3-CAR修饰的T细胞用于肝癌治疗,为GPC3-CAR-T的临床应用奠定基础。研究方法1.利用基因合成技术合成HN3-4-1BB-CD3ζ和HN3-CD28-4-1BB-CD3ζ基因序列（简称HBBζ、H28BBζ,课题组前期构建的以GC33为单链抗体的二代三代GPC3-CAR-T细胞简称GBBζ和G28BBζ）,人工合成以HN3为单链抗体的CAR基因,制备目的质粒,用慢病毒转染的方法获得针对抗GPC3的不同单链抗体构建的CAR-T细胞,并通过流式细胞术、Western blot等方法检测GPC3-CAR在T细胞上的表达。流式检测PBMC、T细胞、HBBζ、H28BBζ、GBBζ和G28BBζ及对照组Mock细胞中CD3+CD8+T细胞与CD3+CD4+T细胞的百分比;2.通过Q-PCR、Western-blot及流式细胞术检测多种肝癌细胞中GPC-3的表达水平,筛选出不同GPC3表达水平的肝癌细胞株;针对不同GPC3表达水平肝癌细胞,应用体外细胞毒性试验检测HBBζ、H28BBζ、GBBζ和G28BBζ的杀伤效率的差异;通过酶联免疫吸附实验测定GPC3-CAR-T与肿瘤细胞共敷育后细胞因子的分泌;3.使用GPC3阳性肝癌细胞建立NCG小鼠肝癌模型,并将GPC3-CAR-T细胞注入小鼠尾静脉。通过测量皮下肿瘤体积的大小来评估CAR-T细胞在体内抑制肝癌细胞的能力。病理组织免疫组化染色用于评估CAR-T细胞的归巢能力。TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡并评价CAR-T细胞的疗效。研究结果1.采用慢病毒感染T细胞,流式检测结果表明CAR-T感染率在30%-80%,Western-blot证实靶向GPC3的嵌合抗原受体能够在T细胞上表达;流式检测CAR-T表型,发现经过体外培养之后,GPC3-CAR-T中发挥主要杀伤作用的CD8+的T细胞逐渐增多;2.通过QPCR、流式细胞术和Western-blot,证明GPC3在HepG2、Huh-7、Hep3B和两株原代肝癌细胞1214、1222均高表达,阳性率达70%-98.8%,PLC/PRF/5、SMMC7721为低表达,不表达GPC3肝癌细胞株有SK-HEP-1、QGY7701、Bel7402、97L;3.体外杀伤实验证明GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞的杀伤效率随着效靶比的增加而增加,相同代数的CAR-T细胞,以GC33为单链抗体构建的CART细胞杀伤效率更为显着,相同单链抗体构建的CAR-T细胞,三代杀伤效率更优于二代。但当靶细胞为GPC3阴性的肝癌细胞时,各组之间无明显差异（P>0.05）;共培养上清在以GC33为单链抗体的CAR-T中检测到更高水平的细胞因子分泌,尤其在GPC3高表达的Hep-G2中;4.通过皮下注射GPC3阳性肝癌细胞成功建立肝癌NCG小鼠模型,GPC3-CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤生长速率明显更慢,肿瘤平均体积显着低于MOCK细胞组,差别具有统计学意义（P<0.05）,HE染色提示GPC3-CAR-T细胞对小鼠重要脏器没有明显毒副作用,免疫组化染色提示实验组中有更多CD3+CD8+T细胞浸润肿瘤组织,明显高于对照组,TUNEL法检测到GPC3-CAR-T细胞治疗组肿瘤细胞凋亡率高于MOCK组,差别有统计学意义（P<0.05）。研究结论1.携带以HN3为单链抗体的CAR基因的慢病毒成功合成,病毒转染T细胞后,CAR蛋白能够稳定表达于T细胞表面;2.GPC3-CAR-T细胞经过体外培养后,细胞大量增殖,其中绝大部分为CD8+效应T细胞;3.在体外实验中,相同单链抗体构建的GPC3-CAR-T细胞三代杀伤效率要优于二代CAR-T细胞,相同代数的GPC3-CAR-T细胞,以GC33构建的CAR-T细胞显示出更强的杀伤能力,在体外效靶细胞共培养时,以GC33为单链抗体构建的CAR-T细胞分泌出更高水平的细胞因子;4.各组GPC3-CAR-T细胞都能抑制GPC3阳性肝癌小鼠模型的生长,但各组之间差异不明显。
谭庆龙[5]（2018）在《巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价》文中认为肿瘤微环境是一个复杂结构系统,具有增强或逃避宿主免疫监视和杀伤的作用。组成肿瘤免疫环境的核心免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞。肿瘤微环境中的免疫细胞的位置、数量、功能表型和Closstalk影响肿瘤的免疫应答、治疗和预后结果。因此,重塑肿瘤免疫环境中免疫细胞的特征和削弱其在肿瘤免疫治疗中抑制性,对开发针对癌症的新型免疫治疗和化疗抵抗至关重要。由于肿瘤生长通常伴随着髓系细胞在肿瘤中的积累和免疫表型改变,从而抑制T细胞靶向肿瘤的免疫治疗。本研究针对肿瘤微环境中关键的“保安”巨噬细胞和“特种兵”T淋巴细胞入手,分别探寻调节巨噬细胞免疫极化表型的物质及其机制,和构建人源化T细胞免疫的小鼠膀胱癌肿瘤评价模型,希冀为重塑肿瘤免疫环境的治疗关键问题提供启示。1、巨噬细胞具有两种作用相反的表型,经典激活的M1表型和选择激活的M2表型,M1型巨噬细胞抵抗入侵病原体、抑制肿瘤、吞噬微生物、促进炎症反应和增强免疫监视功能。相反,M2型为“休息”表型,抑制免疫反应、促进组织愈合、降低炎症发生和促进肿瘤生长。猪苓多糖具有免疫调节作用已被证实,在本研究中,通过甲醇脱脂、水提醇沉提取猪苓粗多糖,经过滤、Savage法去蛋白、冷冻干燥、DEAE-Cellulose及Sephadex G-100柱层析分离猪苓均一多糖（Polyporus polysaccharide,PPS）;发现纯化的PPS极化M-CSF诱导人M2(CD206 high)型巨噬细胞极化为M1(CD86 high)型,且PPS影响巨噬细胞的粘附和诱变细胞形态;降低PD1表达,升高MHCⅡ分子表达;促进细胞因子白细胞介素（IL）‐1β、IL‐6、IL‐8、IL10及肿瘤坏死因子（TNF）‐α（P<0.01）分泌;增强M2巨噬细胞对肿瘤杀伤的能力（P<0.05）;降低FN、COLⅢ和ICMA-1转录水平（P<0.05）,升高TLR2、TLR4和NF-κB蛋白的表达（P<0.05）;RNA-seq也证实NF-κB信号及细胞生理的基质组成参与了PPS对巨噬细胞的作用。本研究发现PPS抑制M2巨噬细胞的粘附和伪足生成,且具有显着增强巨噬细胞免疫和抗肿瘤功能。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）对非肌层浸润性膀胱癌有效,其激活了免疫系统和加剧炎症反应,其中巨噬细胞为BCG的重要靶细胞之一。实验探讨了BCG在巨噬细胞极化调控中的作用和潜在机制,以及和信号调节蛋白-α（SIRPα）的关系。将单核细胞系THP-1分化为M2巨噬细胞(CD206 high和Th2细胞因子分泌细胞),观察到BCG诱导的M2极化为M1表型(CD86 high、CD197 high和Th1细胞因子分泌细胞);下调SIRPα（CD172α）;促进IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（i NOS）等促炎因子的表达（P<0.05）。与BCG处理的M2巨噬细胞共培养的人膀胱癌T24和RT4细胞,显示出CD47高表达的于生长抑制作用的正相关（P<0.05）。此外,BCG以剂量依赖性方式显着增加Janus激酶2（JAK2）和p信号转导物和转录激活物1（STAT1）蛋白的表达。实验结果表明JAK2/STAT1途径介导BCG极化巨噬细胞为M1和抑制SIRPα表达是BCG作用于巨噬细胞为杀伤膀胱癌的重要机制。另外,通过体内研究BCG（0.25、1.25和6.25μg/小鼠,i.v.）在NOD/scid IL2Rg-/-（NSI）小鼠膀胱癌肿瘤模型中的作用和潜在机制。惊讶的是,观察到NSI小鼠T24膀胱癌模型在尾静脉注射BCG后,显示巨噬细胞标志物CD11b+F4/80+高水平浸润以及肿瘤体积的显着减少（P<0.05）。与对照组相比,外周巨噬细胞的M2比例显着下降（P<0.05）,血清和肿瘤上清中巨噬细胞相关炎症和分化细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12P70、RANKL和MCP-1的水平也显着增加（P<0.05）。此外,BCG促进骨髓中促分化基因PU-1、EGR-1、NF-κB和C-Fos m RNA转录的表达（P<0.05）。结合分析,本研究结果表明体内注射BCG可以靶向巨噬细胞来抑制膀胱癌的生长,其机制与巨噬细胞成熟、免疫激活和浸润膀胱肿瘤的巨噬细胞数量增加有关。2、人源化小鼠或小鼠-人类嵌合体已成为研究体内替代活生物体的重要模型。近年来,人源化小鼠模型在人类艾滋病、癌症、传染病、血液疾病和退行性疾病领域研究得到了广泛的认可和应用。患者来源的异种移植肿瘤（PDX）保留了原始的肿瘤特征如组织学异质性、生物分子特征、临床恶性表型、基因型、肿瘤结构和肿瘤脉管系统,可提供相关评估特别是新型癌症疗法和对临床结果的具有预见性,与肿瘤细胞系相比为更可靠的药物研发平台,已成为公认的临床前药物评价模型。Atezolizumab（MPDL3280A）作为化免疫治疗药物为膀胱肿瘤近30年以来的首个重大药物,开启了膀胱癌精准免疫靶向治疗。实验建立PBMC人源化NSI皮下荷瘤T24膀胱癌CDX小鼠模型,Atezolizumab（10mg/kg,i.v）每周尾静脉给药2次,连续治疗4周,对Atezolizumab的免疫治疗效果和机制进行评价。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;但对T细胞亚群CD8+/CD4+比例无影响;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1、TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）但对T细胞激活分子CD25、CD69均无影响。实验另进行了人源化NSI膀胱癌PDX小鼠模型构建,观测Atezolizumab（高、中、低:20、10、5 mg/kg,i.v）对患者来源肿瘤样本（PDX）的治疗作用。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;能明显增加CD4+亚群细胞数量;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）,但对外周T细胞激活CD25、CD69无影响。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1和TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）,对T细胞激活分子CD25和CD69均无影响。本次建立的人源化膀胱癌PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,且具有与CDX某些不同的特征表型,特别是T细胞浸润情况,CDX模型中浸润T细胞远大于PDX模型肿瘤。实验建立的人源化膀胱癌CDX或PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,为具有T淋巴细胞特征的肿瘤免疫评价模型。实验表明Atezolizumab不仅对肿瘤PD-L1具有明显抑制作用,还能间接抑制PD1促进NSI小鼠体内人源T细胞的增加,具有重塑肿瘤免疫环境的作用。PDX与CDX模型的差异,能为患者肿瘤的异质性、不同免疫浸润环境和精准治疗提供临床前依据。
闫丹丹[6]（2016）在《β-葡聚糖对慢性乙型肝炎患者免疫细胞的调节作用》文中研究指明目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是影响人类身体健康的主要病毒之一。HBV在机体内持续感染进而导致宿主发生慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）,慢性乙型肝炎恶化,成为肝硬化和原发性肝癌,因此,慢性乙型肝炎的防止和治疗成为当今一项重要的医学课题。外周血是免疫应答的重要场所,其所含的所有免疫细胞中除巨噬细胞具有直接吞噬、清除的作用外,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）产生的如干扰素、IL-12等免疫调节因子在免疫调节中也扮演重要角色。树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞,在激活初始T细胞进而激发初始免疫应答过程中发挥重要作用。葡聚糖有调节机体免疫和调节代谢等作用,是一种免疫活性最强并且最容易被人体吸收的非特异性的免疫调节剂。本实验通过体外细胞培养CHB患者外周血DC细胞及PBMC细胞,采用流式细胞术检测β-葡聚糖对PBMC及DC细胞表型的影响,探讨在CHB患者发病机制中,β-葡聚糖在免疫调节中的作用,为开展慢性乙型肝炎的细胞免疫治疗方法和开发新型的抗CHB疫苗提供重要的科学依据。方法:1采集10名健康对照组外周血,经密度梯度离心法分离单个核细胞,分别使用有血清培养基和无血清培养基做DC细胞培养,流式细胞仪检测DC细胞表面CD11c、CD86的表达水平。2收集在石家庄市第五医院就诊的CHB患者30例,健康对照组12例,采集外周血8 mL,使用EDTA抗凝。用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离单个核细胞,分别做DC细胞和PBMC细胞培养,分组成四组,分别为未刺激组,LPS组和β-葡聚糖组。在培养的过程中用倒置显微镜间断观察细胞的大小、形态及生长情况。3使用APC-CD11c、PE-Cy7-CD86、FITC-CD80抗体（各2μL）标记DC细胞;使用APC-CD11c、PE-Cy7-CD3、FITC-CD4、PE-CD8a和Percp-CD56抗体（各2μL）标记PBMC细胞,用流式细胞仪检测各细胞的表达量。4汇总整理所有数据、并应用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果:1、有血清培养基、无血清培养基培养DC细胞,细胞在形态上基本无差别,在数量上差别不明显,流式细胞仪检测DC细胞表面CD11c、CD86,两组比较CD11c表达有差异,有血清培养基组略高于无血清培养基组,具有统计学意义（P<0.05）,CD86+表达无差异（P>0.05）。2、DC细胞培养与刺激中,使用倒置显微镜观察细胞,慢性乙型肝炎患者DC细胞与健康对照组DC细胞相比较,密度较低;使用LPS、β-葡聚糖刺激24小时后,与未刺激组比较,两组细胞生长旺盛,胞体较大,具有典型的树枝状凸起;LPS组细胞成熟较β-葡聚糖组细胞早。3、流式细胞仪检测慢性乙型肝炎患者DC细胞与健康对照组DC细胞表面CD11c、CD80、CD86,结果显示,健康对照组与慢性乙型肝炎患者未刺激组、LPS组和β-葡聚糖组的外周血DC细胞表面CD11c+的表达无统计学意义（P>0.05）;CD80+、CD86+的表达有统计学意义（P<0.05）,健康对照组CD80+、CD86+的表达均高于HBV患者;且给予不同处理后,未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,CD80+、CD86+的表达差异有统计学意义（P<0.05）;不同刺激因子CD80+、CD86+的表达量按从低到高的顺序排列依次为未刺激组<β-葡聚糖组<LPS组。4、PBMC细胞培养与刺激中,使用倒置显微镜观察细胞,加入刺激培养2 d后,未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组细胞在形态上无区别。5、流式细胞仪检测各组PBMC细胞中CD11c+的表达,对照组与病例组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,CD11c+的表达差异仍无统计学意义（P>0.05）。病例组与对照组比较,CD3+CD4+的表达无统计学意义（P>0.05）;慢乙肝患者、健康对照组中未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,CD3+CD4+的表达差异有统计学意义（P<0.05）,CD3+CD4+的表达量依次为未刺激组<β-葡聚糖组<LPS组。CD3+CD8a+的表达,健康对照组与患者两组比较,具有统计学意义（P<0.05）,健康对照组未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组均大于患者未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组,慢乙肝患者、健康对照组中未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,有统计学意义（P<0.05）,CD3+CD8a+的表达量依次为未刺激组<β-葡聚糖组<LPS组。CD3-CD56+的表达健康对照组与患者两组比较,具有统计学意义（P<0.05）,健康对照组未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组均大于患者未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组;慢乙肝患者、健康对照组未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,有统计学意义（P<0.05）,CD3-CD56+的表达量依次为未刺激组<β-葡聚糖组<LPS组。CD3+CD56+的表达,健康对照组与患者两组比较,具有统计学意义（P<0.05）;健康对照组未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组均大于患者未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组,慢乙肝患者、健康对照组中未刺激组、LPS组、β-葡聚糖组两两比较,有统计学意义（P<0.05）,CD3+CD56+的表达量依次为未刺激组<β-葡聚糖组<LPS组。结论:1、慢性乙型肝炎患者免疫功能低下与DC细胞成熟状态明显低下密切相关,LPS和β-葡聚糖刺激可促进DC增殖,诱导细胞成熟。2、DC细胞在LPS和β-葡聚糖的刺激下,DCs成熟度基本无变化,抗原提呈能力增强。3、慢性乙型肝炎患者体内Th细胞的数量与健康对照组无明显差异,而慢性乙型肝炎患者体内CTL细胞、NK细胞、NKT细胞的数量均小于健康对照组,从而造成慢乙肝患者的免疫耐受。4、LPS、β-葡聚糖刺激PBMC细胞后,CTL细胞、NK细胞表达量增加,NKT细胞减少。5、β-葡聚糖具有免疫调节功能,有助于改善慢性乙型肝炎患者的免疫耐受状态,为慢性乙型肝炎的免疫治疗提供新思路。
徐梅[7]（2014）在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中研究表明卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ14CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B17DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C12CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ14CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B17DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第1421天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第1421天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
章由贤[8]（2011）在《体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究》文中指出目的：体外培养刺激AFP特异性T细胞,检测其杀伤功能,为研究AFP158-166特异性T细胞免疫治疗奠定基础。方法：采用带FITC荧光标记的HLA-A2抗体,流式细胞技术筛选HLA-A2阳性健康志愿者,通过HLA-A2基因分型高分辨检测试剂盒（PCR-SSP）,选择其中基因型为HLA-A0201者,取其外周血,密度梯度离心法分离获取外周血单核细胞（PBMC）,通过加入人GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子贴壁粘附培养法培养收获树突状细胞（DC）,将DC负载HLA-A0201表位态AFP158-166后,按1：10比例将其与新鲜淋巴细胞混合培养,并加入人细胞因子IL-2刺激,出现细胞大量增殖后收获细胞,行细胞毒性试验,用MTT法分别检测其杀伤肝癌细胞、负载AFP的T2细胞,以及未负载AFP的T2的能力。结果：从13例健康志愿者中筛选出基因型HLA-A0201阳性者4例,每50ml外周血培养的细胞中可收获DC细胞2×106个,培养至第7天检测表面抗原：CD83、CD80和CD86阳性率分别为（81.3±2.4）%、（92.8±1.4）%和（70.5±1.9）%。将DC负载AFP与淋巴细胞混合培养14d左右出现大量细胞增殖,行细胞毒性试验结果示,其对肝癌细胞、负载AFP的T2细胞有明显杀伤作用,而对未负载AFP的T2细胞杀伤作用不明显。结论：通过加入GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子体外贴壁粘附培养人PBMC可收获树突状细胞,将树突状细胞负载AFP158-166后与淋巴细胞混合,加细胞因子IL-2可刺激AFP158-166特异性T细胞增殖,并且可杀伤AFP+肝癌细胞以及负载AFP的T2细胞,为研究肝癌的过继细胞免疫治疗提供了实验基础。
陈陆馗[9]（2008）在《Fas/DcR3的配体FasL/RGD-FasL对垂体腺瘤细胞生长的抑制作用及其机制的研究》文中认为第一章Fas、Fas配体（FasL）和诱骗受体3（DcR3）在人垂体腺瘤组织中的表达目的检测Fas、Fas配体（FasL）和诱骗受体3（DcR3）的蛋白和mRNA在人各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平。方法分别应用免疫组织化学染色法（IHC）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测98例垂体腺瘤组织中Fas、FasL和DcR3的蛋白,及24例垂体腺瘤组织中Fas、FasL和DcR3的mRNA的表达水平,并比较它们各自在正常垂体与垂体腺瘤之间、各种内分泌类型垂体腺瘤之间、以及侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤之间表达水平的差异。结果1、免疫组化染色显示,Fas蛋白、DcR3蛋白在垂体腺瘤组织中的表达分布于细胞浆和细胞膜中。FasL蛋白在垂体腺瘤组织中未见明显表达。Fas蛋白在垂体腺瘤组织中的表达水平高于DcR3蛋白在垂体腺瘤组织中的表达水平。Fas蛋白及DcR3蛋白在功能性腺瘤组织中的表达水平高于其在无功能腺瘤组织中的表达水平。在功能性腺瘤组织中,Fas蛋白的表达水平高于DcR3蛋白的表达水平。Fas蛋白及DcR3蛋白在侵袭性腺瘤组织的表达水平与其在非侵袭性腺瘤组织的表达水平无明显差别。2、RT-PCR分析显示,Fas mRNA和FasL mRNA在正常垂体组织中均有表达,DcR3 mRNA在正常垂体组织中未见表达。Fas mRNA和DcR3 mRNA在垂体腺瘤组织中均有表达,FasL mRNA在垂体腺瘤组织中未见表达。Fas mRNA在各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平均低于其在正常垂体组织中的表达水平。Fas mRNA在各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平高于DcR3 mRNA在相应内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平。Fas mRNA在各内分泌类型侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤中的表达水平无明显差别。DcR3 mRNA在各内分泌类型侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤中的表达水平亦无明显差别。结论我们首次证实,从人类正常垂体到垂体腺瘤组织,出现Fas表达水平的下降、FasL表达的缺失、以及DcR3的表达。这些受体和配体表达水平的变化可能在垂体腺瘤的发生发展中起着重要作用。Fas有望作为垂体腺瘤生物治疗的一个新靶点,为外源性FasL治疗垂体腺瘤提供了新的思路。第二章Fas配体（FasL）和RGD-Fas配体（RGD-FasL）对垂体腺瘤细胞的生长抑制作用及其作用机制的研究目的探讨Fas配体（FasL）和RGD-Fas配体（RGD-FasL）对垂体腺瘤细胞生长的影响及其可能的作用机制。方法1、人工构建重组FasL基因和重组RGD-FasL基因,获得纯化的FasL蛋白和RGD-FasL蛋白。2、体外培养大鼠垂体腺瘤细胞系GH3和MMQ,及小鼠垂体腺瘤细胞系AtT20。应用RT-PCR法及流式细胞法检测Fas和DcR3在垂体腺瘤细胞的表达。3、在不同时间经不同浓度的FasL和RGD-FasL干预后,进行以下实验:（1）MTT法观察腺瘤细胞的生长抑制效应;（2）应用倒置显微镜和电镜观察腺瘤细胞的凋亡现象;（3）琼脂糖凝胶电泳观察DNA裂解片段;（4）应用流式细胞仪（FCM）进行细胞周期分析（PI染色）;（5）应用Western blot法检测凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、RANKL、JNK2和Bcl-2的蛋白水平。（6）Caspase抑制实验验证RGD-FasL诱导细胞凋亡的机制。结果1、人工获得了纯化的FasL蛋白和RGD-FasL蛋白。2、RT-PCR分析和流式细胞法证实了Fas和DcR3在垂体腺瘤细胞的表达。但在GH3细胞中Fas的表达水平较低,在AtT20细胞中DcR3的表达水平很低。3、MTT实验揭示了RGD-FasL对垂体腺瘤细胞的抑制效应等同于FasL。两者的生长抑制效应表现为剂量和时间依赖关系和线性正相关。AtT20细胞对药物的敏感性相对较高,MMQ细胞对药物的敏感性次之,而GH3细胞对药物的敏感性相对较差。4、经RGD-FasL处理的腺瘤细胞发生了典型的凋亡形态学变化。5、琼脂糖凝胶电泳显示,DNA裂解片段出现一个典型的梯形条带,证实了腺瘤细胞的凋亡。6、RGD-FasL和FasL均可诱导细胞周期停滞,凋亡指数（AI）显着上升,处于G0/G1期和G2/M期的细胞数量分别显着增加和减少。经统计学分析RGD-FasL的凋亡指数等同于或大于FasL的凋亡指数。7、Western blot分析显示,RGD-FasL和FasL处理腺瘤细胞后,Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、RANKL和JNK2的表达明显增加,而Bcl-2的表达明显减少。在GH3细胞中RANKL和JNK2的表达较低。Caspase抑制实验证实了RGD-FasL正是通过Caspase途径诱导了垂体腺瘤细胞的凋亡。结论我们首次人工构建的FasL和RGD-FasL通过Caspase途径诱导了垂体腺瘤细胞的凋亡和细胞周期的停滞,从而发挥其抑制垂体腺瘤细胞生长的作用。RGD-FasL对垂体腺瘤细胞的生长抑制效应等同于FasL,由于RGD本身具有肿瘤病理血管的靶向性功能,因此RGD-FasL较之FasL在垂体腺瘤的生物治疗方面更具特异性、安全性和临床应用价值。
苗艳艳[10]（2008）在《芦荟多糖干预的PBMC对肝癌细胞的作用及其机制研究》文中提出本课题在较全面综述近年来芦荟研究进展及肝癌中西医综合治疗研究的基础上,重点开展了芦荟多糖干预的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）对肝癌细胞生长的作用及其机制的实验研究。文献研究表明,芦荟多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保肝、降血糖、促进创伤和溃疡愈合及抗炎、抗病毒等多方面的药理活性。其中,芦荟多糖的抗肿瘤作用是我国近年芦荟研究的热点之一,但已有的研究多为动物实验研究,研究成果多数尚待临床研究证实。本课题通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,从细胞水平探讨了芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。目的:通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,探讨芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。方法:1、采用水提醇沉法提取芦荟粗多糖,无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,三氯乙酸除蛋白,得精制芦荟粗多糖AP1,选用10万分子量与3万分子量的超滤膜截留不同分子量芦荟多糖AP11（分子量＞10万）、AP12（3万＜分子量＜10万）、AP13（分子量＜3万）,蒽酮-浓硫酸法测定各多糖含量,考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。2、采用人淋巴细胞分离液、Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。AlamarBlue法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对PBMC生长的影响,MTT法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对HepG2生长的影响。3、Alamar Blue法测定芦荟多糖AP11单独及联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC生长的影响。MTT法测定多糖AP11干预后PBMC上清及PBMC细胞悬液对HepG2生长的影响。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定多糖AP11对PBMC各组上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,流式细胞仪检测其FasL的表达。ELISA法测定干预后各组PBMC对HepG2上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,AKP检测试剂盒测定对AKP水平的影响,流式细胞仪检测干预后HepG2细胞周期、凋亡率及其Fas的表达。4、以手术切除肝癌组织为标本,胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞,通过倒置显微镜观察其形态学特征。并于分离培养的第2天,加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中,倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响。MTT法测定其对癌细胞生长的影响。结果:1、从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取的芦荟多糖AP1、AP11、AP12、AP13中多糖所占比例分别为58%、79%、84%和85%;蛋白含量分别为15.61μg/mL、13.33μg/mL、21.03μg/mL和10.70μg/mL。2、人淋巴细胞分离液、密度梯度离心法可成功分离PBMC,细胞的存活率可达95%以上。不同分子量芦荟多糖对PBMC的生长有一定的促进作用。与PBMC空白对照组相比,AP11（200μg/mL）组可显着促进PBMC生长（P＜0.01）。与空白对照HepG2组相比,各浓度AP11、AP12、AP13组对HepG2生长的影响没有明显差异（P＞0.05）。3、与空白对照PBMC组（BC组）相比,芦荟多糖AP11及其联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC的生长有不同程度地促进作用。与空白对照HepG2组（H组）相比,干预后各组PBMC效应细胞的上清液对HepG2生长的影响无明显差异（P＞0.05）,干预后各组PBMC效应细胞可不同程度抑制HepG2的生长。光镜下观察可见,H组细胞以多边形细胞为主,细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞浆透明。与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组CIAP+H组细胞镜下生长视野减少,均出现不同程度的形态改变,大多细胞呈梭形、蝌蚪形,部分细胞皱缩,变黑、变圆。芦荟多糖AP11对PBMC上清中IFN-γ水平的影响:与BC组相比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显着提高（P＜0.01）;与AP组比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显着提高（P＜0.01）,与BC组相比差异显着（P＜0.01）。芦荟多糖AP11对PBMC上清中TNF-α水平的影响:BC组、AP组、CI组和CIAP组之间的TNF-α水平无明显变化（P＞0.05）。效应细胞对靶细胞HepG2上清中IFN-γ水平的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显着提高（P＜0.01）;与BC+H组相比,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显着提高（P＜0.01）。效应细胞对靶细胞HepG2上清中TNF-α水平的影响:与H组相比,BC+H组有增高的趋势,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显着提高（P＜0.01）;与BC+H组比,AP+H组TNF-α水平有明显提高（P＜0.05）,CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显着提高（P＜0.01）。流式细胞仪检测结果显示,H组细胞在正常二倍体细胞DNA峰（G1峰）前无明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率很低（5.13%）,更多处于S期（43.33%）,较少处于G1期（52.27%）;与H组相比,CIAP+H组中靶细胞在G1峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率显着增高（30.37%,P＜0.01）,S期比例降低（24.37%,P＜0.05）,较多处于G1期（75.63%,P＜0.05）。与H组相比,其余各组靶细胞都有凋亡峰出现,其凋亡率、S期比例都有不同程度降低,G1期比例有不同程度增加。芦荟多糖AP11对PBMC FasL表达的影响:与BC组相比,AP组、CI组和CIAP组的FasL荧光表达率升高。效应细胞对HepG2 Fas表达的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组的Fas荧光表达率升高。4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。培养6h后即可在倒置显微镜下观察到贴壁细胞,48h可观察到细胞呈单个或团块状贴壁生长,每个团块约有20～100个不等的细胞,有的细胞已经完全贴壁展开。倒置显微镜下,活细胞以多边形或不规则上皮样细胞为主,有少量梭形细胞。细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞质少,胞浆内可见丰富颗粒及空泡。与未加多糖干预的空白对照组相比,癌细胞在数量及形态上没有明显的变化。与未加PBMC干预的癌细胞相比,芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC作用于癌细胞后,癌细胞形态发生明显变化,细胞混合后6h,一部分细胞形态由多边形变为梭形,一部分细胞皱缩,变黑、变圆。MTT实验结果表明,与癌细胞空白对照组比,芦荟多糖AP11对原代肝癌细胞生长的影响没有明显差异（P＞0.05）;芦荟多糖AP11干预及未干预PBMC组可明显抑制肝癌细胞的生长（P＜0.01）。结论:1、在传统多糖提取工艺的基础上,得到纯度较高的不同分子量芦荟多糖AP11、AP12、AP13,为本研究提供了理想的实验用药。2、成功建立PBMC分离方法。PBMC体外分离后第1天,其数量有下降趋势,第4～6天比较稳定,我们选用处于稳定期的细胞作为实验用细胞模型。PBMC的活性与供血者体质及体外培养条件有关。芦荟多糖AP11（200μg/mL）组可显着促进PBMC生长。不同分子量的芦荟多糖对HepG2的生长没有明显抑制作用。3、芦荟多糖AP11单独及其联合Anti-CD3McAb与rhIL-2应用可显着促进体外PBMC的增值,同时可增加PBMC IFN-γ的分泌,增强FasL的表达。表明其可以促进PBMC的增殖,并能增强其分泌杀伤肿瘤活性细胞因子IFN-γ的分泌,提示其抗肿瘤作用与增强机体免疫,诱导细胞凋亡有关。芦荟多糖AP11干预的PBMC效应细胞上清液对HepG2的生长没有明显抑制,而PBMC效应细胞可以显着抑制HepG2的生长,并能诱导HepG2靶细胞的凋亡、改变其细胞周期。此外,还能增加混合培养后细胞上清中IFN-γ、TNF-α的水平,降低AKP的水平及增强靶细胞Fas蛋白的表达。提示芦荟多糖AP11的抗肿瘤作用与降低肿瘤细胞活性、改变细胞周期、提高IFN-γ和TNF-α水平,通过IFN-γ与TNF-α的协同作用及激活Fas/FasL途径、诱导凋亡有关。4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。其活性与肝癌患者发病阶段及体外培养条件有关。芦荟多糖对原代培养肝癌细胞的生长及形态没有明显作用。芦荟多糖干预及未干预的自体PBMC对原代肝癌细胞有明显的抑制作用。
二、肝癌患者PBMC的TNFRⅠ、Ⅱ的表达及治疗对表达率的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌患者PBMC的TNFRⅠ、Ⅱ的表达及治疗对表达率的影响（论文提纲范文）
（1）共刺激分子OX40、PD-1分子在乳腺癌T细胞与B细胞相互调控中的作用及生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 一、浸润性乳腺癌 |
| 二、免疫分子与肿瘤 |
| 三、免疫细胞与肿瘤 |
| 四、结语 |
| 参考文献 |
| 第一部分 乳腺肿瘤患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子的表达及与TFH、TFR细胞亚群的相关性 |
| 1. 资料和方法 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌外周血中TFH细胞和TFR细胞与B细胞亚群的相关性及其生物学意义 |
| 1. 资料和方法 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乳腺癌外周血中B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义 |
| 1. 资料和方法 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TFH细胞分化、表型以及功能 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本课题获得的基金资助 |
| 致谢 |
（2）sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(ABBREVIATION) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 人滑膜组织样本 |
| 2.2 细胞 |
| 2.3 动物 |
| 2.4 药物与试剂 |
| 2.5 仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 人脐带间充质干细胞的培养和传代 |
| 3.2 人脐带间充质干细胞的冻存和复苏 |
| 3.3 人脐带间充质干细胞的鉴定 |
| 3.3.1 表面分子标记物的检测 |
| 3.3.2 成骨能力检测 |
| 3.3.3 成脂能力检测 |
| 3.3.4 成软骨能力检测 |
| 3.4 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测 |
| 3.4.1 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒克隆的构建 |
| 3.4.2 sTNFRⅡ-Fc蛋白表达检测 |
| 3.4.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的包装 |
| 3.4.4 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的质量检测 |
| 3.5 STNFRⅡ-FC过表达UC-MSC稳定细胞株(STNFRⅡ-MSC)的构建 |
| 3.5.1 筛选稳定细胞株的puro最佳浓度 |
| 3.5.2 确定UC-MSC的最佳转染条件 |
| 3.5.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒转染UC-MSC |
| 3.5.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的筛选和扩大培养 |
| 3.5.5 稳定细胞株纯度检测 |
| 3.6 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定 |
| 3.6.1 ELISA法检测sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平 |
| 3.6.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物的检测 |
| 3.6.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力的检测 |
| 3.6.4 MSC条件培养基的获取 |
| 3.6.5 激光共聚焦法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达 |
| 3.6.6 Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达 |
| 3.6.7 ELISA检测sTNFRⅡ-MSC与 FLS共培养体系中RANKL和OPG的水平 |
| 3.7 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定 |
| 3.8 STNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的作用 |
| 3.8.1 制备小鼠CIA模型 |
| 3.8.2 实验分组和给药方法 |
| 3.8.3 整体指标观察 |
| 3.8.4 踝关节病理学检测和评分 |
| 3.8.5 脾脏病理学检测和评分 |
| 3.8.6 免疫学指标检测 |
| 3.8.7 免疫组化法检测踝关节软骨和滑膜组织中MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ的表达 |
| 3.9 QPCR法检测STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞亚群相关转录因子mRNA表达的影响 |
| 3.9.1 sTNFRⅡ-MSC与 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞共培养 |
| 3.9.2 小鼠脾脏CD4+T 细胞RNA的提取 |
| 3.9.3 RNA逆转录成c DNA |
| 3.9.4 Th17、Th1、Th2、Treg和 Tfh相关转录因子引物序列 |
| 3.9.5 QPCR法检测CD4+T 细胞相关转录因子m RNA表达 |
| 3.10 免疫荧光法检测STNFRⅡ-MSC在 CIA小鼠脾脏和关节组织中的留存时间 |
| 3.11 免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的STNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 表达情况 |
| 3.12 TUNEL法检测STNFRⅡ-MSC凋亡 |
| 3.13 Annexin V/PI法检测STNFRⅡ-MSC凋亡 |
| 3.14 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 Bax、Bcl2、Caspase8、Caspase3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、LC3B-Ⅱ和TRIB3的蛋白表达 |
| 3.15 CCK-8 法检测自噬和凋亡对STNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响 |
| 3.16 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 SOX-9和Aggrecan蛋白表达 |
| 3.17 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 UC-MSC的鉴定 |
| 4.2 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测 |
| 4.2.1 GV358载体酶切结果 |
| 4.2.2 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因片段的获取 |
| 4.2.3 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因与载体进行交换 |
| 4.2.4 阳性克隆测序 |
| 4.2.5 质粒表达检测 |
| 4.2.6 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体质量检测 |
| 4.2.7 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体滴度检测 |
| 4.3 STNFRⅡ-MSC稳定细胞株的构建 |
| 4.3.1 筛选sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的puro最佳浓度 |
| 4.3.2 sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染UC-MSC的最佳转染条件 |
| 4.3.3 sTNFRⅡ-MSC单克隆稳定细胞株的筛选 |
| 4.3.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株纯度检测 |
| 4.4 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定 |
| 4.4.1 sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平 |
| 4.4.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物检测 |
| 4.4.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力检测 |
| 4.4.4 sTNFRⅡ-MSC条件培养液对UC-MSC中ICAM-1和VCAM-1表达的影响 |
| 4.4.5 TNF-α和 IL-1β对 sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 表达的影响 |
| 4.4.6 sTNFRⅡ-MSC和 FLS共培养体系中RANKL和 OPG的水平 |
| 4.5 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定 |
| 4.6 细胞存活率检测 |
| 4.7 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠整体指标的影响 |
| 4.7.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠体重的影响 |
| 4.7.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数的影响 |
| 4.8 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏病理的影响 |
| 4.9 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节病理的影响 |
| 4.10 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠免疫学指标的影响 |
| 4.10.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺和脾脏指数的影响 |
| 4.10.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响 |
| 4.10.3 sTNFRⅡ-MSC对 CCⅡ特异的CD4+T 细胞增殖的影响 |
| 4.10.4 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞亚群的影响 |
| 4.10.5 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏浆细胞和Breg细胞亚群的影响 |
| 4.10.6 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10水平的影响 |
| 4.10.7 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清IgG1、IgG2a和抗CCⅡ抗体水平的影响 |
| 4.11 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节软骨MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ表达的影响 |
| 4.12 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节滑膜组织中MMP-13、TIMP-1和ADAMTS-5 表达的影响 |
| 4.13 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞相关转录因子表达的影响 |
| 4.14 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠脾脏组织中的分布情况 |
| 4.15 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠踝关节组织中的分布情况 |
| 4.16 迁移至CIA小鼠脾脏组织中的STNFRⅡ-MSC上 LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 的表达情况 |
| 4.17 TNF-α对 STNFRⅡ-MSC功能的影响 |
| 4.17.1 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC凋亡和自噬的影响 |
| 4.17.2 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC成软骨功能的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 课题创新点 |
| 8 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:间充质干细胞通过调控记忆T细胞治疗类风湿关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义及其免疫调节作用初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 胆囊癌细胞表达的B7-H1、B7-H3及B7-H4对外周血淋巴细胞抑制作用的初步分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 综述 B7-H3在消化道肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
| 英文缩写 |
| 致谢 |
（4）靶向肝癌细胞的不同GPC3单链抗体构建的CAR-T细胞的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 不同单链抗体构建的GPC3 特异性CAR-T细胞的制备及鉴定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 GPC3-CART细胞对人肝癌细胞的体外研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 GPC3-CAR-T细胞对人肝癌细胞株小鼠移植瘤模型的体内研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 巨噬细胞与肿瘤免疫治疗相关进展 |
| 一、巨噬细胞来源和功能分型 |
| 二、目前的肿瘤相关的巨噬细胞 |
| 三、TAM在肿瘤治疗中的作用与治疗策略 |
| 第二节 人源化PDX小鼠肿瘤模型研究进展 |
| 一、国内外研究现状发展趋势评述 |
| 二、人源化鼠的模型建立方法 |
| 三、人源化PDX小鼠模型研究与应用 |
| 第三节 中药猪苓研究进展 |
| 一、化学成分研究 |
| 二、现代药理作用研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究 |
| 第一部分 猪苓多糖对人巨噬细胞的形态及抗肿瘤作用的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果分析 |
| 四、小结 |
| 第二部分 卡介苗增强THP-1 源巨噬细胞的抗膀胱癌作用及其机制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三部分 卡介苗(BCG)在膀胱癌NOD /scid~(IL2Rg -/-) (NSI)小鼠模型中通过靶向巨噬细胞的免疫治疗研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 人源化肿瘤小鼠模型的建立与Atezolizumab免疫治疗评价 |
| 第一部分 人源化膀胱癌CDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 第二部分 人源化膀胱癌PDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）β-葡聚糖对慢性乙型肝炎患者免疫细胞的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 原发性肝癌的免疫治疗进展 |
| 1、自然杀伤细胞(Natural killer,NK) |
| 2、树突状细胞(dendritic cell,DC) |
| 3、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK) |
| 4、嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,CAR)的T细胞(CAR-T) |
| 5、小结 |
| 第一章 不同培养基对树突状细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究资料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 细胞的分离与培养 |
| 2.1.1 血液标本的采集 |
| 2.1.2 分离PBMC |
| 2.1.3 DC细胞的刺激和培养 |
| 2.1.4 细胞的收集 |
| 2.2 细胞形态的观察 |
| 2.3 流式细胞仪检测培养细胞表面CD11c、CD86 细胞的表达 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞生长状况 |
| 3.2 细胞计数 |
| 3.3 所培养细胞表面标志的表达 |
| 3.3.1 两组所培养细胞CD11c~+表达率的比较 |
| 3.3.2 两组所培养细胞CD86~+表达率的比较 |
| 4 讨论 |
| 第二章 β-葡聚糖对慢性乙型肝炎患者免疫细胞的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 血液标本的无菌采集 |
| 2.2 DC细胞的培养 |
| 2.2.1 分离PBMC |
| 2.2.2 DC细胞的体外培养 |
| 2.2.3 DC细胞的刺激 |
| 2.2.4 DC细胞的收集 |
| 2.2.5 细胞形态的观察 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测细胞表面标志CD11c、CD80、CD86 的表达 |
| 2.2.7 统计学处理 |
| 2.3 PBMC细胞的培养 |
| 2.3.1 分离PBMC |
| 2.3.2 细胞的刺激和培养 |
| 2.3.3 细胞的收集 |
| 2.3.4 细胞形态的观察 |
| 2.3.5 流式细胞仪检测PBMC表面CD11c、CD3、CD4、CD8a和 CD56 的表达情况 |
| 2.3.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 PBMC的获取 |
| 3.2 DC细胞实验结果 |
| 3.2.1 各组DC细胞形态的观察 |
| 3.2.2 各组DC细胞表面标志的表达情况 |
| 3.3 PBMC细胞实验结果 |
| 3.3.1 各组PBMC细胞形态的观察 |
| 3.3.2 各组PBMC细胞表面标志的表达结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 |
（7）化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 一、EOC 的生物标志物 |
| 二、筛查策略 |
| 三、治疗 |
| 四、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 第一章 材料和方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
| 第一章 资料与方法 |
| 第二章 临床病例资料结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一：CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：miRNA 与卵巢癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（8）体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 目的及方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 综述 肝癌的免疫治疗研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）Fas/DcR3的配体FasL/RGD-FasL对垂体腺瘤细胞生长的抑制作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 一.中文摘要 |
| 二.英文摘要 |
| 三.目录 |
| 四.英文缩略词表 |
| 五.论文正文 |
| 第一章 Fas、Fas配体(FasL)和诱骗受体3(DcR3)在人垂体腺瘤组织中的表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 附表和附图 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 Fas配体(FasL)和RGD-Fas配体(RGD-FasL)对垂体腺瘤细胞的生长抑制作用及其作用机制的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 附表和附图 |
| 2.5 讨论 |
| 六.总结 |
| 七.参考文献 |
| 八.综述一 |
| 参考文献 |
| 九.综述二 |
| 参考文献 |
| 十.致谢 |
| 十一.攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）芦荟多糖干预的PBMC对肝癌细胞的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 一、芦荟研究进展 |
| 1 芦荟的种类 |
| 2 芦荟的历史 |
| 3 芦荟的主要化学成分 |
| 4 芦荟的主要功效 |
| 二、芦荟多糖药理作用研究现状 |
| 1 免疫调节作用 |
| 2 抗肿瘤作用 |
| 3 抗辐射作用 |
| 4 保肝作用 |
| 5 创伤愈合作用 |
| 6 抗炎、抗艾滋病病毒作用 |
| 7 降血糖作用 |
| 8 其他作用 |
| 9 结语 |
| 三、原发性肝癌的病因和发病机制研究 |
| 1 肝炎病毒 |
| 2 肝硬化 |
| 3 黄曲霉素 |
| 4 饮水污染 |
| 5 肝吸虫 |
| 6 幽门螺杆菌 |
| 7 饮酒和吸烟 |
| 8 遗传因素 |
| 9 糖尿病 |
| 10 结论 |
| 四、中医药治疗原发性肝癌研究进展 |
| 1 辨证论治研究 |
| 2 中医治法研究 |
| 3 中药外治研究 |
| 4 单味药及有效成分研究 |
| 5 中药复方研究 |
| 6 中西医结合治疗研究 |
| 7 讨论 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 芦荟多糖的提取纯化及含量测定 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 芦荟凝胶冻干粉中总糖的测定 |
| 2.1.1 葡萄糖标准溶液的配制 |
| 2.1.2 蒽酮试剂的配制 |
| 2.1.3 标准曲线的测定 |
| 2.1.4 总糖的含量测定 |
| 2.2 芦荟凝胶冻干粉中多糖的分离、纯化及含量测定 |
| 2.2.1 芦荟粗多糖的分离 |
| 2.2.2 芦荟粗多糖的纯化 |
| 2.2.3 芦荟多糖含量测定 |
| 2.3 蛋白质含量测定 |
| 2.3.1 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制 |
| 2.3.2 蛋白质标准溶液的配制 |
| 2.3.3 标准曲线的测定 |
| 2.3.4 蛋白质含量的测定 |
| 2.4 统计方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 芦荟多糖对外周血单个核细胞和HepG2生长的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 其它 |
| 2 方法 |
| 2.1 PBMC的原代培养 |
| 2.1.1 PBMC的分离制备 |
| 2.1.2 PBMC生长曲线测定 |
| 2.1.3 PBMC活力检测 |
| 2.2 芦荟多糖对PBMC生长的影响 |
| 2.3 芦荟多糖对HepG2生长的影响 |
| 2.3.1 HepG2细胞的解冻和培养 |
| 2.3.2 HepG2细胞的冷冻保存 |
| 2.3.3 HepG2细胞的传代 |
| 2.3.4 MTT法测定HepG2细胞的生长趋势 |
| 2.3.5 MTT法测定芦荟多糖对HepG2生长的影响 |
| 2.4 统计方法 |
| 结果 |
| 1 PBMC原代培养 |
| 2 PBMC生长趋势 |
| 3 HepG2生长趋势 |
| 4 芦荟多糖对PBMC生长的影响 |
| 5 芦荟多糖对HepG2生长的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分 芦荟多糖抗肿瘤作用机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 其它 |
| 2 方法 |
| 2.1 AP11单独及联合Anti-CD3McAb、rhIL-2干预的PBMC对HepG2生长的影响 |
| 2.1.1 效应细胞PBMC的诱导制备及分组 |
| 2.1.2 倒置显微镜下观察各组PBMC形态特点 |
| 2.1.3 AP及其联合Anti-CD3McAb与rhIL-2对PBMC生长的影响 |
| 2.1.4 MTT法观察效应细胞上清液对靶细胞生长的影响 |
| 2.1.5 MTT法观察效应细胞对靶细胞生长及其形态的影响 |
| 2.2 AP抗肿瘤作用机制研究 |
| 2.2.1 效应细胞对靶细胞周期及凋亡率的影响 |
| 2.2.2 TNF-α、IFN-γ和AKP的测定 |
| 2.2.3 芦荟多糖AP11单独或联合Anti-CDMcAb、rIL-2对PBMC FasL表达的影响 |
| 2.2.4 效应细胞对靶细胞HepG2 Fas表达的影响 |
| 2.3 统计方法 |
| 结果 |
| 1 PBMC在光镜下的形态特点 |
| 2 AP11及其联合Anti-CD3McAb与rhIL-2对PBMC生长的影响 |
| 3 MTT法观察效应细胞上清液对靶细胞生长的影响 |
| 4 MTT法观察效应细胞对靶细胞生长及其形态的影响 |
| 5 效应细胞对靶细胞周期及凋亡率的影响 |
| 6 TNF-α、IFN-γ和AKP的测定 |
| 6.1 芦荟多糖对PBMC上清中IFN-γ水平的影响 |
| 6.2 芦荟多糖对PBMC上清中TNF-α水平的影响 |
| 6.3 效应细胞对靶细胞HepG2上清中IFN-γ水平的影响 |
| 6.4 效应细胞对靶细胞HepG2上清中TNF-α水平的影响 |
| 6.5 效应细胞对靶细胞HepG2上清中AKP水平的影响 |
| 7 Fas/FasL的测定 |
| 7.1 芦荟多糖对PBMC FasL表达的影响 |
| 7.2 效应细胞对HepG2 Fas表达的影响 |
| 讨论 |
| 1 芦荟多糖对PBMC生长的影响 |
| 2 芦荟多糖干预的PBMC效应细胞及其上清液对HepG2生长的影响 |
| 3 芦荟多糖干预的PBMC效应细胞对HepG2靶细胞周期及凋亡率的影响 |
| 4 芦荟多糖对PBMC分泌IFN-γ的影响 |
| 5 芦荟多糖对细胞因子TNF-α的影响 |
| 6 芦荟多糖干预的效应细胞对靶细胞HepG2 AKP水平的影响 |
| 7 芦荟多糖对效应细胞FasL与靶细胞Fas蛋白表达的影响 |
| 第四部分 PHCC原代培养及AP11、自体PBMC对其影响的探讨 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 其它 |
| 2 方法 |
| 2.1 人PBMC分离制备 |
| 2.2 原发性肝细胞癌癌细胞的制备 |
| 2.2.1 取材 |
| 2.2.2 初步处理 |
| 2.2.3 原代肝癌细胞分离及分组培养 |
| 2.2.4 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞形态的影响 |
| 2.2.5 同源外周血单个核细胞(PBMC)对肝癌细胞生长的影响 |
| 2.3 统计方法 |
| 结果 |
| 1 肝癌细胞的原代培养 |
| 2 原代肝癌细胞形态学研究 |
| 3 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞形态的影响 |
| 4 芦荟多糖对原代培养肝癌细胞生长的影响 |
| 讨论 |
| 第三章 结语 |
| 一、结论 |
| 二、本课题的创新点 |
| 三、存在的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
四、肝癌患者PBMC的TNFRⅠ、Ⅱ的表达及治疗对表达率的影响（论文参考文献）
- [1]共刺激分子OX40、PD-1分子在乳腺癌T细胞与B细胞相互调控中的作用及生物学意义[D]. 兰晶. 苏州大学, 2020
- [2]sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制[D]. 赵英杰. 安徽医科大学, 2020
- [3]负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义及其免疫调节作用初步分析[D]. 金正宇. 苏州大学, 2019(04)
- [4]靶向肝癌细胞的不同GPC3单链抗体构建的CAR-T细胞的作用[D]. 庄小津. 福建医科大学, 2019(07)
- [5]巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价[D]. 谭庆龙. 广州中医药大学, 2018(01)
- [6]β-葡聚糖对慢性乙型肝炎患者免疫细胞的调节作用[D]. 闫丹丹. 河北师范大学, 2016(04)
- [7]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
- [8]体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究[D]. 章由贤. 天津医科大学, 2011(04)
- [9]Fas/DcR3的配体FasL/RGD-FasL对垂体腺瘤细胞生长的抑制作用及其机制的研究[D]. 陈陆馗. 中南大学, 2008(12)
- [10]芦荟多糖干预的PBMC对肝癌细胞的作用及其机制研究[D]. 苗艳艳. 广州中医药大学, 2008(09)