一、应用多重聚合酶链反应同时检测二种弧菌的探讨（论文文献综述）
赵宏宇[1]（2021）在《数字微流控海洋病原菌检测芯片系统的构建与研究》文中指出在海洋环境中微生物显示出最为丰富的生物多样性,在海洋生态系统中发挥着最为重要的作用。而其中存在着大量的各种病原微生物,不但能导致各种重要海洋生物患病,还可导致人类患病。随着气候变化的加剧,这些海洋病原微生物有可能会大量繁殖,对沿海地区环境公共卫生健康和海水养殖业造成巨大威胁。对海洋环境中的病原微生物进行检测,对于评估海洋环境质量与海产品安全,以及防范重大环境公共卫生安全风险,具有十分重要的意义。针对副溶血弧菌现场快速检测等关键问题,本课题通过将数字微流控芯片技术与环介导等温扩增技术相结合,研制出紧凑型、便携式、自动化的（DMF-LAMP）检测设备,通过设置芯片自动化的驱动程序,驱动缓冲液与DNA样本自动的进行混合和反应,对结果进行了分析。本论文通过使用较高的驱动电压使微滴高速运动,增加湍流以加速基于扩散的混合从而加快DMF-LAMP反应的进程,并将基于电容的位置估计器引入了该设备,进行了液滴驱动的优化。首次进行芯片上微反应器适当的混合以促进DMF-LAMP反应的进程。通过优化DMF-LAMP检测设备检测副溶血弧菌的时间和温度,进行副溶血弧菌的特异性和灵敏度的检测。并利用该平台检测加标虾的头尾腹背四个部位的菌液DNA,通过对检测结果进行分析,说明该装置可以实现即时检测。为了实现高精度、快速地移动液滴,将基于电容的位置估计器引入该设备。该位置估计器是基于液滴位置根据控制电极电容的无量纲比率计算的,因此与液滴的组成和电极尺寸无关。根据测试,分别含有去离子水、LAMP缓冲液和LAMP试剂的微滴可通过反馈控制器100%完成运输。特别是,含有LAMP试剂微滴的驱动成功率显着增加,从无反馈时的76%增加到有反馈时的100%。因此,在多种液体样本参与的实验中,该方法极大地方便了基于反馈控制的DMF装置的自动化操作。首次探讨了芯片上微反应器适当的混合可以促进DMF-LAMP反应的进程。结果表明,增加流动构型的数量和降低流体的逆流将扩展可用于微反应器内基于扩散的传质的界面,从而有助于加快总体反应速率。实验数据得出,通过适当的混合,DMF-LAMP核酸扩增的荧光强度平稳时间从液滴混合后静态孵育和传统的常规LAMP中的60分钟缩短到2电极混合中的30分钟和3电极混合中的15分钟。通过优化核酸扩增反应温度和反应时间的条件,可以得出,在该设备上最佳的反应温度为65°C。该设备实现了比以前报告的设备高得多的检测灵敏度（2 copies per reaction）,可以实现副溶血弧菌的特异性扩增。通过与3电极混合DMF-LAMP相关联的Q-tip采样检测到了加标虾中的副溶血弧菌,较高浓度时检测信号仅在3 min内出现,最多延迟至18 min,检出限<0.23×103 CFU/g。结论:因此,所开发的DMF-LAMP设备具有特异性强、灵敏度高、耗费试剂少、快速检测等优点,有望成为副溶血弧菌现场即时检测的有力工具,实现“样本进结果出”（sample-to-answer）。
陈娇[2]（2021）在《海产品中副溶血性弧菌和沙门氏菌的核酸快速检测新方法研究》文中研究指明伴随着人们生活水平的提高和食品种类的日益丰富,食品的安全性问题越来越引发人们的密切关注。副溶血性弧菌和沙门氏菌是引起海产品食物中毒两种最主要的食源性致病微生物,由于这两种菌的高致病性和高死亡率,已经对人类的生命健康造成重大威胁。因此开发一种对副溶血性弧菌和沙门氏菌简单、快速、灵敏的现场检测方法不仅可以为分子生物学领域的即时检测（Point-of-Care Testing,POCT）提供技术平台,也为食品安全的检验检疫提供新型有效的方法,对于改善人类食品安全和卫生水平具有极为显着的现实意义。为达到现场快速有效检测副溶血性弧菌和沙门氏菌的目的,本论文基于国内外食源性致病菌的行业发展现状,分别针对副溶血性弧菌和沙门氏菌的各类检测方法进行比较,归纳分析其优势与不足,决定采用耗时较短的核酸检测方法作为对副溶血性弧菌和沙门氏菌检测的手段。变性泡介导的链置换扩增技术（Strand Exchange Amplification,SEA）,是基于双链DNA模板自主呼吸产生变性泡,引物通过嵌入变性泡结构,在Bst DNA聚合酶的作用下进行延伸,短时间内形成大量的指数式扩增产物。本论文利用该技术平台,并与比色染料联用,在1小时内即可实现对副溶血性弧菌的可视化检测,整个检测过程仅需小型的金属加热模块即可完成,摆脱了对高精尖仪器的依赖。在3%Na Cl营养肉汤的纯培养物中,副溶血性弧菌的检测限为1.0×103CFU/m L。该技术具备从样品进-结果出（sample-to-answer）的巨大潜力,可以为环境监测、食品卫生、疾病诊断提供强有力的技术支持。但是,SEA方法的灵敏度相对较低,反应时间相对较长,在对食源性致病菌的即时检测中仍存在一定的局限性。为了进一步满足副溶血性弧菌和沙门氏菌现场快速检测的需求,我们课题组对SEA技术进行了改进,开发了体系简单、反应快速、灵敏度更高的基于窄变温的加速链置换扩增技术（Accelerated Strand Exchange Amplification,ASEA）。该技术通过引入重复的窄热循环可以获得更多的变性气泡和单链,同时由于温度变化较小而缩短了每个循环的时间,从而大幅提高了反应的灵敏度和反应速度。与此同时搭载新型核酸释放剂,整个检测过程可以在30分钟内完成。在纯培养物中,该技术对副溶血性弧菌和沙门氏菌的检测限分别为25 CFU/m L和100CFU/m L,而在人为添加副溶血性弧菌的扇贝样品中,经12小时的增菌培养后,该技术的检测限为400 CFU/m L。相对SEA技术,ASEA技术极大地缩短了反应时间,提高了检测的灵敏度,实现了副溶血性弧菌和沙门氏菌现场快速检测的目的。简而言之,本论文对SEA技术进行了优化,最终通过ASEA技术实现了副溶血性弧菌和沙门氏菌的现场快速检测,具备操作简便、特异性强、灵敏度高等优势,能够解决海产品中食源性致病菌的即时核酸检测所面临的难题。无论对于食品安全性控制、环境卫生监测,还是疾病的早期诊断都具有无比广阔的市场发展前景。
钱程[3]（2021）在《荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究》文中进行了进一步梳理核酸检测技术是以生物体内的核酸为靶标进行分析的检测手段。该技术目前已经被广泛应用于食品安全检测、环境污染物监控、临床诊断、遗传分析等众多领域。从样本获取到结果输出,核酸检测技术一般包含提取、扩增和检测三个基本环节。目前,已知的核酸检测技术或是需要复杂的样本提取操作、或是需要耗时冗长的扩增环节、或是需要毒性较大的凝胶电泳鉴定等,都存在着许多的缺陷。为了能够将该技术更好的在实际使用场合中进行推广,本论文从该技术的三个基本环节入手,针对其中的不足之处进行了相应的优化和改进,建立了集荧光可视化、便携性、低成本等优点的核酸分析平台。论文中选取了三种重要的感染于常见农副产品的动植物病菌作为应用对象,将所建立的分析平台用于对这些病菌的快速检测以评估其实际性能。本论文主要研究内容及相关结论如下:（1）论文建立了集核酸快速提取、快速PCR扩增、终点肉眼检测于一体的高效核酸分析平台,并将其应用于对虾传染性皮下组织及造血器官坏死病病毒（IHHNV）的检测。为了尽可能简化核酸检测的流程,提高检测效率,本论文分别从提取、扩增、检测的三个环节进行了相应的优化。首先,论文中引入了碱裂解法用以快速获取核酸样本,将繁琐的核酸提纯环节缩短到仅需3 min即可完成;其次,引入了快速PCR体系,通过对“平衡范例方程”的理解和探索,将传统的三温区PCR循环简化为动态双温区进行,成功地将本需要2 h的PCR扩增环节缩短到10 min以内;接着,引入了分子信标技术,通过对其结构的研究,设计了具有较高特异性的探针体系,实现了在常温下对靶标核酸的肉眼荧光可视化结果判读。此外,通过改变分子信标末端的荧光标记,实现了在同一反应管内对两种不同靶标核酸的高灵敏度双重检测。该分析平台具有较高的特异性和灵敏度,可以充分用于虾苗的IHHNV感染情况的初筛和周期性复检,其低成本、易操作的特性也十分适宜现场检测的应用,该病毒在对虾养殖产业中危害巨大,连年造成不小的经济损失。基于该分析平台的方法可以实现在15 min内对虾苗样本中的IHHNV靶标进行快速可视化分析,检测限达到每反应1000拷贝。与现行国标方案相比,将检测时间从3 h缩短到仅需15 min,并且减少了对大型仪器设备的需求,大大提高了检测效率和实用性。（2）论文建立了集防止核酸污染、恒温扩增、荧光可视化终点检测为一体的分析平台,并将其应用于对柑橘黄龙病病菌的快速检测。论文中引入了基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术通过对CRISPR/Cas系统的探索,验证了Cas12a效应蛋白尚未被报道的新PAM序列“UUUN”。基于此新PAM序列,论文中进一步引入了利用尿嘧啶糖基化酶（UracilDNA Glycosylase,UDG）体系来实现防止核酸扩增子气溶胶污染的方案,解决了核酸检测领域的这一痛点。此外,用更为便携和快捷的环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）代替国标采用的PCR方法,可以进一步缩短整个检测流程的时间并减少对复杂温控仪器的需求。利用CRISPR/Cas体系的高特异性,当特殊设计的cr RNA与靶标黄龙病病菌的核酸配对后会与Cas12a效应蛋白形成复合体,从而激活该蛋白的旁路切割活性,使得体系中带有荧光标记的单链寡核苷酸探针被切割降解,进而导致荧光信号的释放,实现荧光可视化的高灵敏度检测。该分析平台可以实现对柑橘养殖产业影响颇大的的柑橘黄龙病的致病菌——黄龙病病菌（Cirtus huanglongbing,HLB）每反应10拷贝的高灵敏度检测,其检测限相较传统的嵌入式染料方法提高了约100倍。（3）论文建立了针对组分复杂样本的免核酸提纯分析方案,并结合玻璃化手段为热敏感的酶类试剂提供了一种更方便的储藏思路。为了进一步提高核酸检测技术的实际使用性能,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文以近些年在全球范围内疯狂肆虐的非洲猪瘟疫情的病原菌非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为应用对象,建立了基于玻璃化CRISPR体系及免样本提取的荧光可视化核酸分析平台。基于对CRISPR体系在灵敏度和特异性方面的探索和相关研究结果,论文中进一步尝试省略样本提纯的繁琐步骤,对全血样本不进行任何预处理直接对其中的核酸靶标进行检测。通过对三种常用的具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的实验探究,筛选出了最适宜的酶种,用以对未经处理的原始全血样本进行直接扩增,并进行后续的可视化检测。此外,为了更好地将LAMP扩增体系与热敏感的CRISPR体系兼容于同一反应管中,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文探索了以普鲁兰糖和海藻糖作为保护剂,通过玻璃化的方法,将液态的CRISPR试剂脱水成膜的手段来实现其较长时间的稳定储存。基于该方法,经过老化加速试验的测试,原本需要低温储存环境的CRISPR体系可以在室温下稳定储藏180天。该方案可以很好地解决此类热敏感的酶类试剂对于储存环境的超低温要求,并且可以大大节省其远距离冷链运输的成本。该平台可以实现对家猪全血样本中的非洲猪瘟病毒每反应100拷贝级别的检测灵敏度,并且整个检测过程都可以在便携的装置上完成,实现“从样本到结果”的直观输出。
于洋洋[4]（2020）在《伊通河流域抗生素污染、微生物耐药性及生物毒性研究》文中研究指明目前,抗生素在人与动物的传染性疾病预防和治疗领域被广泛使用,抗生素可以通过多种途径进入各种环境介质,同时产生细菌耐药性和耐药基因污染,对生态系统甚至人类健康造成不利影响。本文以松花江二级支流伊通河为研究区域,设置8个采样断面,开展不同水文期（2016年8月、11月和2017年5月）水中磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲嘧啶（SMD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲恶唑（SMZ）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、盐酸四环素（TCH）、土霉素（OTC）和甲氧苄啶（TMP）共9种抗生素的含量检测,分析其时空分布特征和污染特征;研究了长春市三家污水处理厂不同时期（5月、8月和10月）进出水中抗生素的污染水平;对伊通河水体和污水处理厂出水中抗生素污染的生态风险进行了评价;研究了流域典型抗生素的微生物耐药性、耐药基因分布情况及抗生素的生物（淡水发光菌）毒性作用,为伊通河流域抗生素污染的综合评价及治理提供科学依据。论文研究的主要结果如下:（1）为了研究污水处理厂排水对受纳河流可能造成的影响,测定了长春市三家污水处理厂进水和出水中的9种抗生素残留。结果显示,三家污水处理厂进水口共检测出7种抗生素,总检出率为23.46%;检出率由高至低的排序为:TMP（55.56%）﹥OFX（44.44%）﹥CIP=SD（33.33%）﹥SMZ（22.22%）﹥OTC=TCH（11.11%）,其中TMP浓度最高（1.269μg/L）。出水口共检测出8种抗生素,总检出率为16.05%;检出率由高至低的排序为:TMP=CIP（33.33%）﹥SMD（22.22%）﹥OFX=SD=SMZ=OTC=TCH（11.11%）,浓度最高的是SD（1.612μg/L）。三家污水处理厂出水中抗生素的三个月份总检出率的排序依次为:8月（25.92%）﹥5月（18.52%）﹥10月（3.70%）。风险商值法（RQs）的评价结果表明,污水处理厂出水中对水生态具有高风险潜在危害的抗生素为CIP、OFX、SMZ,中等风险的为OTC、TCH和SD。（2）对伊通河8个断面三个不同水文期水体中抗生素残留检测结果显示:伊通河水体中9种抗生素浓度范围为nd-1.361μg/L。氟喹诺酮类的检出率和浓度分别为54.16%和0.221μg/L,其中OFX的检出率和浓度最高,分别为62.50%和1.361μg/L。磺胺类检出率和浓度分别为22.92%和0.054μg/L,其中检出浓度最高的是SMD（1.083μg/L）,检出率最高的是SD（37.5%）。TMP的检出率为33.33%,最高检出浓度为0.393μg/L。四环素类中的OTC检出率为4.16%,检出浓度为0.024μg/L。从时间上看,丰水期（8月）和枯水期（11月）的抗生素检出率和浓度均高于平水期（5月）,三个水文期的抗生素总检出率由高至低依次为枯水期（12.04%）﹥丰水期（8.79%）﹥平水期（4.17%）,其中枯水期的OFX总检出率为100%。从空间上看,8个采样断面中,接近城镇区的断面水体中抗生素浓度偏高。利用风险商值法（RQs）对伊通河8个断面不同时期水体各种抗生素残留进行风险评价,结果表明,伊通河水体中对水生态具有高风险潜在危害的抗生素为CIP、OFX、SMZ,中等风险的为SD。（3）建立了改进的固定底物酶底物法（DST-酶底物法）,测定了伊通河水体中总大肠菌群和大肠埃希菌对抗生素的耐药性。结果表明:伊通河水体中丰水期（8月）和枯水期（11月）总大肠菌群数明显高于平水期（5月）;SOX、TCH和TMP对伊通河水体中总大肠菌群的抑制率随水文期变化不明显,而CIP、OFX和ENR对多数断面水中总大肠菌群抑制率随水文期变化明显,丰水期和枯水期为18.6-54.7%,平水期最高抑制率为89.5%;丰水期和枯水期氟喹诺酮类污染较重的断面在平水期水体中总大肠菌群仍呈现较高的耐药性。大肠埃希菌对多数抗生素的耐药性存在水文期差异,其对氟喹诺酮类抗生素的耐药率较低,丰水期水体中大肠埃希菌对四环素类耐药率偏高为68.8%;三个不同水文期8个断面均检测到多重耐药大肠埃希菌。（4）用荧光定量PCR对伊通河8个断面水中的耐药基因分布进行了研究,并与改进的DST-酶底物法测得的总大肠菌群耐药性进行了相关性分析。结果显示:耐磺胺类的sul1、sul2,耐甲氧苄啶的dfra1和耐四环素的tet Q是伊通河流域的主要耐药基因;伊通河水体中耐氟喹诺酮类的qnr A,耐四环素类的tet M、tet O和tet Q基因的相对丰度和抗生素对总大肠菌群最高抑制率呈显着负相关,说明这部分耐药基因可能来源于水中的总大肠菌群。（5）分别测定了氟喹诺酮类、甲氧苄啶、磺胺类以及四环素类抗生素对青海弧菌Q67的单一毒性,考察其对青海弧菌Q67的剂量-时间-效应关系;研究了氟喹诺酮类、四环素类和甲氧苄啶二元混合体系对青海弧菌Q67的时间依赖联合毒性。结果显示:单一抗生素对青海弧菌Q67的急性毒性大小依次为四环素类﹥氟喹诺酮类﹥甲氧苄啶=磺胺类。各种抗生素在实验浓度范围内对青海弧菌Q67的毒性均呈现时间-效应关系,其中SOX和SDM在0-0.002 mol/L浓度范围8 h内呈现了明显的Hormesis效应。抗生素二元混合体系对青海弧菌Q67的联合毒性随着混合比例和时间不同而变化,其主要规律为:在4 h、8 h和12 h时,大多数二元混合物对青海弧菌Q67的联合毒性主要呈现低浓度时为加和作用,高浓度时为协同作用;TCH和OTC的联合毒性低浓度呈现协同作用,高浓度为加和作用;四环素类和甲氧苄啶对青海弧菌Q67的联合毒性（12 h）低浓度时为加和作用,高浓度时为拮抗作用。
关玉婷[5]（2020）在《牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立》文中研究说明乳品中包含了许多营养成分,是人们日常生活重要的食物品种,乳品的质量安全与消费者的健康及乳品行业的健康发展有直接关系。原料液态奶中细菌总数的多少和乳品中的致病菌直接影响着乳品的质量好坏,国标要求生乳的细菌总数不得超过2×106 cfu/mL,而巴氏乳中细菌总数不得超过1×105 cfu/mL,而沙门菌和金黄色葡萄球菌是引起食物中毒最常见的病原菌,国标方法对乳品中这两种致病菌的要求是不得检出,而国标方法对细菌总数及特定病原菌检测存在耗时长的缺点,不利于企业的筛查及现场检测,因此亟需一种快速高效的方法对乳品进行检测。乳品中的微生物主要包括细菌和酵母菌,根据本实验室前期研究,分析并确定了吉林省区域内乳品中的细菌组分。通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）获得了不同细菌的Ct值与细菌总数的对应关系,发现大肠杆菌16S的标准曲线值可以用以衡量乳品常见细菌的总数。本研究首先以此为基础,建立了乳品中细菌总数的qPCR检测方法。建立标准曲线,并通过确定Ct值判断乳品中细菌总数情况,对照国标方法对实际样品进行检测,确定了qPCR的准确性,更加快速高效地对乳品质量进行鉴定。本研究首先构建了重组质粒,并建立了qPCR标准曲线,确定了Ct值标准,能够快速对乳品中的细菌总数进行检测,检测时间在3 h以内完成,对实际样品的检测结果良好,准确率在95.83%左右,解决了国标方法不能快速、高效检测细菌总数的问题。此外,食品中致病菌的排查也作为本研究的探讨重点。本研究通过建立环介导恒温扩增方法（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）定性检测乳品中的沙门菌和金黄色葡萄球菌。首先,分别建立了沙门菌和金黄色葡萄球菌的单重LAMP检测方法,对反应条件进行优化;其次,建立了液态奶金黄色葡萄球菌和沙门菌两种食物中毒菌LAMP同步快速可视化检测方法;最后,按照国标要求组装了LAMP试剂盒,本研究通过设计并筛选出特异性引物,然后对不同条件的优化建立了单重LAMP检测方法分别对沙门菌和金黄色葡萄球菌进行过检测,并通过加标样品确定沙门菌检测低限为1.55×10-8ng/μL,金黄色葡萄球菌检测低限为7.8×10-6ng/μL。然后建立了两种菌同步LAMP检测方法,优化条件并组装试剂盒检测实际样品。检测结果与国标方法和PCR方法进行比较,试剂盒的灵敏度和特异性符合标准,检测可以在2 h内完成,检测结果可视化,仅仅使用简单的设备仪器,适合企业及大批量样品现场快速检测应用。
郭莹[6]（2020）在《罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立》文中认为本研究针对罗氏沼虾常见病原白斑综合征（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）和虾肝肠胞虫（EHP）建立了单一PCR病原检测技术和多重PCR病原检测技术,同时对罗氏沼虾致病性气单胞菌维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌进行分离鉴定以及致病性和耐药性进行探究,主要研究结果如下:1. 罗氏沼虾WSSV、IHHNV和EHP单一PCR检测技术的建立本研究通过设计虾肝肠胞虫（EHP）和白斑综合征（WSSV）特异性引物以及OIE推荐检测传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）所用引物序列,建立EHP、WSSV和IHHNV单一PCR检测方法,并对引物退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳单一PCR反应条件,并检测单一PCR反应的灵敏度。结果显示:WSSV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是59.8℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,WSSV单一PCR检测灵敏度为200 fg包含5.41x104个拷贝;IHHNV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV单一PCR的检测灵敏度是200 fg包含5.99x104个拷贝;EHP单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是58℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸20s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP单一PCR检测灵敏度是2 pg,包含6.36x105个拷贝。2. EHP和IHHNV、EHP和WSSV及IHHNV和WSSV多重PCR检测技术的建立本实验对EHP和IHHNV、EHP和WSSV以及IHHNV和WSSV分别建立多重PCR检测方法,对其引物的退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳多重PCR反应条件,并检测其特异性和反应灵敏度,结果表明:在EHP和IHHNV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共36个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200 pg包含6.36x107个拷贝,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝;在EHP和WSSV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58℃,反应时间为30s,72℃延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200pg包含6.36x107个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝;在IHHNV和WSSV多重PCR反应中,其最反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58.9℃,反应时间为30s,72℃延伸50 s,共38个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝。分别对三种多重PCR反应的特异性进行检测,结果表明,三种多重PCR反应的阴性对照豚鼠气单胞菌DNA和SPF罗氏沼虾DNA均无条带扩出,该结果表明本研究建立的三种多重PCR技术具有较强的特异性。3. 罗氏沼虾维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌的分离鉴定本实验从濒死罗氏沼虾幼虾和成虾肝胰腺中分别分离出两株致病菌,对其溶血性、革兰氏染色、形态学、生理生化进行鉴定,并结合16Sr RNA基因测序以及系统进化树分析,判断两株分离菌株分别为维氏气单胞菌（登录号MN733186）和豚鼠气单胞菌（登录号MN736843）,并利用分离菌株分别进行人工感染实验,结果发现,被感染的罗氏沼虾出现与自然水域患病虾相似的症状,且在较短时间内发病死亡,说明这两株分离菌株对罗氏沼虾均具有较强的致病性,对分离菌株的药物敏感性进行检测,结果显示维氏气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、多西环素和利福平5种药物高度敏感,对新生霉素和复方新诺明2种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、链霉素、卡那霉素、四环素7种药物耐药;豚鼠气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、四环素、多西环素5种药物高度敏感,对卡那霉素1种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、新生霉素、链霉素、复方新诺明和利福平8种药物耐药。本研究实验结果为罗氏沼虾气单胞菌的病原鉴定及药物诊治提供一定的参考和理论基础。
杨珺[7]（2020）在《鱼肉污染副溶血弧菌非预增菌快速检测方法的研究》文中研究指明随着人民物质生活水平的不断提高,对食品质量要求也愈来愈高,食品安全现如今已经成为影响人类生命健康财产安全的重大公共卫生问题。食源性致病菌是引起食品安全中毒事件最主要的原因,而副溶血弧菌主要污染海产品从而引起急性肠胃炎。因此,快速有效地检测筛查污染的海产品,是有效防控副溶血弧菌食源性疾病暴发的必要条件。首先,本研究以副溶血弧菌特异性tlh基因设计合成引物,并联合BCAC,建立了一种非预增菌快速检测鱼肉污染副溶血弧菌方法。BCAC能成功吸附溶液中的水溶性DNA抑制剂且不吸附细菌,模拟副溶血弧菌污染1 g鱼肉样品,经4 g BCAC吸附处理后用于实时荧光环介导等温扩增反应。结果显示,本研究建立的Rti-LAMP方法对纯培养副溶血弧菌的检测灵敏度为1 CFU/反应。模拟副溶血弧菌污染鱼肉经预增菌4 h,提取细菌DNA用于Rti-LAMP扩增,其最高检测灵敏度为10 CFU/g,整个检测需要约7 h。而采用BCAC前处理联合Rti-LAMP方法建立的非预增菌快速检测鱼肉污染副溶血弧菌的最低检出限为3 CFU/g,用时约4.5 h。说明BCAC-Rti-LAMP是一种快速灵敏检测鱼肉污染副溶血弧菌的方法。但是,BCAC-Rti-LAMP方法不能有效区分死、活细菌。基于此,本研究蒙脱石封闭的活性炭联合叠氮溴化乙锭前处理样品,再采用Rti-LAMP非预增菌快速检测鱼肉中污染活的副溶血弧菌。模拟副溶血弧菌污染1 g鱼肉样品,经4 g BCAC吸附处理,精制细菌样品,然后加入终浓度6.0μg/m L EMA暗处理5 min,置于500 W的光照下反应10 min后,提取细菌DNA模板用于Rti-LAMP扩增反应,结果显示,该方法最低能检出6 CFU/g活的副溶血弧菌污染。从市场购买海水鱼样品33份用于检测副溶血弧菌污染情况。结果表明,国标法能检测到两份副溶血弧菌阳性样品,BCAC-Rti-LAMP方法能检测到6份阳性样品,BCAC-EMA-Rti-LAMP方法能检测到3份阳性样品,显示BCAC-EMA-Rti-LAMP较BCAC-Rti-LAMP和国标法检测符合率更高,而前者较国标法更快速灵敏,有望为检测鱼肉活的副溶血弧菌污染提供一种快速检测筛查方法。鉴于鱼肉等食品成分的复杂性,免疫磁珠法富集食品中含量较低的副溶血弧菌也是一种有效的前处理技术。为此,本研究首先通过U型管分离产鞭毛能力强的副溶血弧菌,然后分离鞭毛,分离纯化后将鞭毛抗原和全菌体抗原各取250μg分别与等量佐剂混匀,在雌性日本大耳兔的皮下多次免疫,制备抗血清。纯化抗体经间接ELISA测定多克隆抗体的效价为1:320000,为建立副溶血弧菌的免疫吸附前处理样品联合Rti-LAMP检测方法奠定了基础。
卢奕[8]（2020）在《不同来源副溶血性弧菌遗传多样性与耐药性研究》文中研究表明食品安全问题一直是全球关注的热点问题,而食源性致病微生物是引起食源性疾病、影响食品安全的首要危害因素。而在我国,致病微生物是引起食源性疾病的首要因素,其中又以食源性致病菌最为多见,目前,由食源性致病菌所引发的疾病主要通过抗生素治疗,而抗生素滥用所引发的耐药性问题日渐成为人们关注的另一焦点;此外,我国是世界水产品进出口贸易大国,水产品产量多年以来居世界首位,依据我国现下水产品产量结构,大部分水产品来自水产养殖,而来自捕捞的水产品仅占3成不到。副溶血性弧菌不仅是一种常见的食源性致病菌,误食会导致食物中毒,并引发一系列食源性腹泻病等,同时也是导致虾类早期死亡综合征（EMS）,又称为急性肝胰脏坏死病（AHPND）的病原菌,一旦爆发会引起感染区域的虾类出现持续性大规模死亡,造成对虾养殖业巨大的经济损失。为了解副溶血性弧菌生长异质性、耐药性与微进化之间的潜在关系,从而为副溶血性弧菌所引发的食源性疾病及水产品疾病的控制提供数据支持,本文开展了如下几方面的综述及研究工作:（1）水产品、临床及病虾分离的副溶血性弧菌遗传多样性与微进化研究;（2）水产品及病虾分离的副溶血性弧菌耐药性与微进化研究。本研究的主要研究内容和研究具体结果如下:1.水产品、临床及病虾分离的副溶血性弧菌遗传多样性与微进化研究为探究副溶血性弧菌遗传和进化关系,从上海及广东共分离得到184株副溶血性弧菌,分别为临床样本（VPC,40株）、AHPND病虾（VPE,10株）和各种水产来源（VPF,134株）。对所有副溶血性弧菌分离株通过聚合酶链式反应（PCR）评估潜在的毒力因子（tlh,tdh,trh）和基因组测序得到单核苷酸多态性（SNPs）。毒力因子分析表明,绝大多数临床样本VPC（97.5%）携带tdh和/或trh,而绝大多数水产品样本VPF（83.58%）不编码溶血素基因。因此,我们推测副溶血性弧菌通过水平基因转移,推动菌株微进化的进行,进而导致新的潜在的致病菌株的出现。系统发育分析结果表明,VPF-112是一株从水产品中分离出来的非致病菌株,具有较高的进化地位。此外,所有AHPND病虾VPE株和少数VPC株都可以分散成几个小的亚群,在系统发育树上均匀分布,说明不同分离来源的菌株之间存在种内或种间的基因交流,而人类活动和环境选择压力可能是非致病菌向致病菌转化的重要决定因素。2.水产品及病虾分离的副溶血性弧菌耐药性与微进化研究为了解水产品及病虾中分离得到的副溶血性弧菌的耐药情况及微进化关系,通过药敏纸片扩散法（K-B法）对这61株副溶血性弧菌进行25种常用抗生素的药敏实验,并通过PCR检测所有副溶血性弧菌分离株的潜在毒力因子（tlh,tdh,trh）和结合多位点序列分析（MLST）评估菌株的遗传多样性。结果显示,61株分离株对所选的25种抗生素产生了不同程度的耐药,其中最少为4重耐药,最多高达14重耐药;同时发现副溶血性弧菌的致病基因类型与多重耐药性之间可能存在一定的关联,其中tdh-/trh+/tlh+有促使副溶血性弧菌对更多抗生素产生耐药性的可能,tdh+/trh-/tlh+存在导致菌株耐药性增强的趋势。MLST结果揭示了分离菌株间的遗传变异和相关性,发现菌株毒力基因型与微进化之间是存在一定关联的,四种不同的毒力基因型中,毒力基因型为tdh-/trh+/tlh+的菌株较之基因型为tdh+/trh-/tlh+的菌株在系统发育树上的分布更分散,聚类程度较低,说明亲缘关系相对较远。结合热图分析,水产品及病虾来源的菌株,其耐药谱存在一定程度的差异,病虾来源菌株耐药性更强,所耐抗生素种类也更多,推测人为活动和环境选择压力在菌株致病力从无致病力或者较弱致病力转化为强致病力的过程中存在影响;同时依据研究结果,目前有必要进一步加强水产品中细菌耐药性的监测,并采取更有效措施控制细菌耐药性。
钟宜科[9]（2020）在《基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立》文中提出近年来,食源性疾病的发病率居高不下,在全世界范围内都是一个日益严重的公共卫生问题。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计显示由病原微生物引起的食源性疾病比例达50%以上,因此急需建立一种有效的食源性致病菌检测方法。传统的食源性病原体检测和鉴定方法费时费力,不足以满足食品快速检测的要求。为阻止疾病的传播、监控食品的卫生安全,保障人民的安全,急需建立一种快速、简单和有效的检测技术。本文将肠粘附性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和福氏志贺氏菌为模式菌株,建立一种快速检测15种食源性致病菌的多重实时PCR技术。主要研究结果如下:（1）通过HAND系统建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌多重实时PCR方法,具有特异性高、灵敏度好、重复性和稳定性高等特点,并且适用于复杂样本的检测;（2）通过玻璃化技术,将多重实时PCR中热不稳定成分（Taq酶、dNTP、染料和引物）玻璃化到PCR管盖上。实验表明,试剂的活性不受玻璃化的影响实验,并且被玻璃化成分高度稳定,能够在室温（25℃）下保存12年,从而克服了冷链运输和低温储存的局限性;（3）针对复杂样本的快速提取,研制了一种以Chelex-100和TritonX-100为主要裂解成分的核酸提取液,评价其对15种食源性致病菌核酸提取的效果,结果显示只需要在90℃裂解10 min,即可适用于荧光定量PCR检测技术,具有操作简便、裂解效果好、不影响后续反应的特点,且不受粪便和食品等复杂样本的影响。综上所述,本研究通过HAND系统与玻璃化技术相结合建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌快速检测方法,具有良好的特异性与敏感性,解决了样本核酸提取和加样繁琐、复杂以及试剂在非低温环境下易失活的问题。
张浩[10]（2019）在《大鲵虹彩病毒等温扩增可视化检测方法的建立》文中研究说明大鲵虹彩病毒病是由大鲵虹彩病毒（Giant Salamander Iridovirus,GSIV）感染引起的恶性传染病,传播速度很快,致死率极高,给大鲵养殖行业带来重大经济损失。现有的检测方法大多依赖于实验室仪器设备和专业人员的操作,严重制约了日常养殖中对大鲵虹彩病毒的监控和防治。本研究利用单交叉引物等温扩增技术（Single Crossing Priming Amplification,SCPA）和重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）,结合核酸快速检测试纸,建立了两种简单快速、肉眼可视化的GSIV现场检测方法,为大鲵虹彩病毒的防控提供技术支持。本论文研究的主要内容如下:1.建立大鲵虹彩病毒的单交叉引物GSIV-SCPA可视化检测方法针对GSIV基因组保守区的核衣壳蛋白MCP基因,设计并筛选用于SCPA的引物,并对SCPA基础反应体系的各组分浓度以及反应温度、时间进行优化,确定最佳反应条件。结果表明,当交叉引物2R1F的浓度为1.0μmol/L,特异引物（检测引物）2R（2R-Bio）和3R（3R-FAM）的浓度分别为0.5μmol/L,剥离引物4F和5R的浓度分别为0.6μmol/L,Mg2+浓度为8 mmol/L,d NTPs浓度为1.2 mmol/L,甜菜碱浓度为0.7 mol/L时,在63℃下恒温扩增40 min效果最佳,将SCPA扩增产物与核酸快速检测试纸相结合,建立用于大鲵虹彩病毒现场检测的GSIV-SCPA方法。使用大菱鲆红体病虹彩病毒（Turbot reddish body iridovirus,TRBIV）;真鲷虹彩病毒（Red sea bream iridovirus,RSIV）;虎纹蛙虹彩病毒（Tiger Frog Virus,TFV）以及锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus disease,KHVD）等相近种属病毒和水产养殖中常见病的病原检测基因的重组质粒对GSIV-SCPA方法的特异性进行评价,结果表明,GSIV-SCPA方法可特异性扩增GSIV的MCP基因,特异性良好;对GSIV-SCPA方法的灵敏度评价表明,GSIV-SCPA方法检测的检测极限为104拷贝数的标准质粒,PCR方法的检测极限为105拷贝数的标准质粒,证明GSIV-SCPA法的灵敏度高于PCR 10倍,可以检出微量的病毒DNA;在对送检的54份大鲵样品进行检测时,GSIV-SCPA方法的阳性率为72.22%（39/54）,PCR方法的阳性率为74.07%（40/54）,经统计学分析,GSIV-SCPA检测的敏感性为97.50%（39/40）,特异性为92.86%（13/14）,符合率为94.44%（51/54）。Kappa值为0.870,P<0.0001,证明本研究建立的GSIV-SCPA方法与PCR方法的检测结果基本一致,新建立的GSIV-SCPA方法可作为GSIV的现场检测方法。2.建立大鲵虹彩病毒的重组酶聚合酶GSIV-RPA可视化检测方法针对GSIV基因组的保守区核衣壳蛋白MCP基因,设计用于RPA扩增的引物,经引物筛选后又对反应时间进行了优化;将RPA扩增产物与核酸快速检测试纸相结合,建立用于大鲵虹彩病毒现场检测的GSIV-RPA方法。使用大菱鲆红体病虹彩病毒TRBIV;真鲷虹彩病毒ISKNV;虎纹蛙虹彩病毒TFV以及锦鲤疱疹病毒等相近种属病毒的基因组DNA重组质粒对新建立的GSIV-RPA方法进行特异性评价,结果显示GSIV-RPA方法可特异性扩增GSIV的MCP基因,特异性良好;对GSIV-RPA方法的灵敏度评价表明,GSIV-RPA方法检测的检测极限为104拷贝数的标准质粒,PCR方法的检测极限为105拷贝数的标准质粒,证明GSIV-RPA法的灵敏度高于PCR 10倍,可以检出微量的病毒DNA;采集的54份大鲵样品诊断结果显示,GSIV-RPA方法的阳性率为72.22%（39/54）,PCR方法的阳性率为74.07%（40/54）,经统计学分析,GSIV-RPA检测的敏感性为97.50%（39/40）,特异性为92.86%（13/14）,符合率为94.44%（51/54）。Kappa值为0.870,P<0.0001,证明本研究建立的GSIV-RPA方法与PCR方法的检测结果基本一致,新建立的GSIV-RPA方法可作为GSIV的现场检测方法。GSIV-SCPA检测方法和GSIV-RPA检测方法摆脱了昂贵的热循环设备和高标准实验室条件的束缚,扩增时间短,扩增产物量大,反应条件易于达到,在地域偏僻和资源欠发达地区也可完成大鲵虹彩病毒的快速检测,提高日常养殖和引种过程中对大鲵虹彩病毒得监控效率,为大鲵虹彩病毒的快速诊断提供了技术支持。
二、应用多重聚合酶链反应同时检测二种弧菌的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用多重聚合酶链反应同时检测二种弧菌的探讨（论文提纲范文）
（1）数字微流控海洋病原菌检测芯片系统的构建与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 海洋病原菌的检测方法 |
| 1.2 数字微流控技术 |
| 1.3 通道式微流控液滴技术 |
| 1.4 基于电润湿原理(EWOD)的数字微流控技术 |
| 1.4.1 电润湿(EWOD)技术 |
| 1.4.2 基于电润湿原理(EWOD)与PCR结合的数字微流控芯片 |
| 1.4.3 基于电润湿原理与环介导等温扩增LAMP结合的数字微流控芯片 |
| 1.5 基于LAMP与 DMF芯片相结合的DMF-LAMP检测设备 |
| 1.6 论文研究内容与意义 |
| 2 DMF-LAMP检测设备的设计与制造 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.2 DMF-LAMP紧凑型便携式仪器的搭建 |
| 2.1.3 数字微流控芯片的设计与制作 |
| 2.2 DMF-LAMP紧凑型便携式仪器的检测机制 |
| 2.3 液滴驱动可靠性的评估 |
| 3 DMF-LAMP检测设备在副溶血弧菌检测中的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 实验方法与步骤 |
| 3.3 结果分析与讨论 |
| 3.3.1 常规LAMP检测副溶血弧菌影响因素的研究 |
| 3.3.2 DMF-LAMP设备检测副溶血弧菌影响因素的研究 |
| 3.3.3 DMF-LAMP设备检测分析性能的评估 |
| 4 DMF-LAMP设备检测加标虾中副溶血弧菌的应用研究 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验仪器与试剂 |
| 4.1.2 实验方法与步骤 |
| 4.2 结果分析与讨论 |
| 4.2.1 加标虾中副溶血弧菌的检测与研究 |
| 4.2.2 DMF-LAMP在海洋病原菌检测中的优势探讨 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 缩写词 |
| 附录 B 溶液的配制 |
| 附录 C 进行细菌定量 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）海产品中副溶血性弧菌和沙门氏菌的核酸快速检测新方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 副溶血性弧菌和沙门氏菌简介 |
| 1.2 副溶血性弧菌检测方法 |
| 1.2.1 细菌培养法 |
| 1.2.2 免疫学检测法 |
| 1.2.3 核酸扩增检测法 |
| 1.2.3.1 聚合酶链式反应 |
| 1.2.3.2 环介导的等温扩增技术 |
| 1.2.3.3 依赖于解旋酶的等温核酸扩增技术 |
| 1.2.3.4 交叉引物等温扩增技术 |
| 1.2.3.5 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 1.2.3.6 变性泡介导的链交换扩增技术 |
| 1.2.4 核酸分子杂交法 |
| 1.2.5 电化学检测方法 |
| 1.3 沙门氏菌检测方法 |
| 1.3.1 细菌培养法 |
| 1.3.2 免疫学检测法 |
| 1.3.3 核酸分子杂交法 |
| 1.3.4 核酸扩增检测法 |
| 1.3.4.1 聚合酶链式反应 |
| 1.3.4.2 环介导的等温扩增技术 |
| 1.3.4.3 链置换扩增技术 |
| 1.3.4.4 滚环扩增技术 |
| 1.3.4.5 指数等温扩增技术 |
| 1.3.4.6 单引物引发的等温核酸扩增技术 |
| 1.4 本研究的主要内容与意义 |
| 第二章 变性泡介导的链交换扩增技术对副溶血性弧菌的检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 SEA方案引物设计 |
| 2.2.3 副溶血性弧菌培养基的配制及增菌培养 |
| 2.2.4 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 |
| 2.2.5.2 琼脂糖凝胶电泳的制备 |
| 2.2.6 SEA体系检测副溶血性弧菌 |
| 2.2.6.1 SEA检测副溶血性弧菌的可行性 |
| 2.2.6.2 SEA检测副溶血性弧菌的灵敏度 |
| 2.2.6.3 SEA检测副溶血性弧菌的特异性 |
| 2.2.6.4 SEA检测副溶血性弧菌抗干扰能力 |
| 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.7.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 |
| 2.2.7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备 |
| 2.2.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳方法对副溶血性弧菌核酸提取效果的验证 |
| 2.3.2 SEA方法检测副溶血性弧菌的温度条件优化 |
| 2.3.3 SEA方法检测副溶血性弧菌的灵敏度验证 |
| 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对SEA方法扩增产物的验证 |
| 2.3.5 SEA 方法检测副溶血性弧菌的特异性验证 |
| 2.3.6 SEA方法检测副溶血性弧菌的抗干扰能力验证 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 窄变温的加速链置换扩增技术对副溶血性弧菌和沙门氏菌的检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 ASEA体系检测副溶血性弧菌 |
| 3.2.1 仪器与试剂 |
| 3.2.2 副溶血性弧菌ASEA方案引物设计 |
| 3.2.3 副溶血性弧菌培养基的配制及增菌培养 |
| 3.2.4 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 |
| 3.2.5 ASEA方法检测副溶血性弧菌的可行性验证 |
| 3.2.6 ASEA方法检测副溶血性弧菌引物浓度优化 |
| 3.2.7 ASEA方法检测副溶血性弧菌酶浓度优化 |
| 3.2.8 ASEA方法检测副溶血性弧菌灵敏度验证 |
| 3.2.9 ASEA方法检测副溶血性弧菌特异性验证 |
| 3.2.10 ASEA方法检测副溶血性弧菌抗干扰能力验证 |
| 3.2.11 模拟实际样品的副溶血性弧菌的增菌过程 |
| 3.3 ASEA体系检测沙门氏菌 |
| 3.3.1 仪器与试剂 |
| 3.3.2 沙门氏菌ASEA方案引物设计 |
| 3.3.3 沙门氏菌培养基的配制及增菌培养 |
| 3.3.4 沙门氏菌基因组DNA的提取 |
| 3.3.5 ASEA方法检测沙门氏菌可行性验证 |
| 3.3.6 ASEA方法检测沙门氏菌引物浓度优化 |
| 3.3.7 ASEA方法检测沙门氏菌酶浓度验证 |
| 3.3.8 ASEA方法检测沙门氏菌灵敏度验证 |
| 3.3.9 ASEA方法检测沙门氏菌特异性验证 |
| 3.3.10 ASEA方法检测沙门氏菌抗干扰能力验证 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 结论与前景展望 |
| 参考文献 |
| 附录:论文中使用的缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（3）荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.1.1 核酸检测技术在分子诊断方面的应用 |
| 1.1.2 农副产品中动植物病菌快速检测的重要性 |
| 1.1.3 本节小结 |
| 1.2 核酸扩增检测技术的原理和基本流程 |
| 1.2.1 核酸提取 |
| 1.2.2 核酸扩增 |
| 1.2.3 核酸扩增子检测 |
| 1.2.4 本节小结 |
| 1.3 新型核酸检测分析方法的研究进展 |
| 1.3.1 核酸气溶胶污染防止办法 |
| 1.3.2 快速PCR技术的应用 |
| 1.3.3 免扩增的核酸分析方法 |
| 1.3.4 新型探针技术的应用 |
| 1.3.5 基因编辑技术的应用 |
| 1.3.6 本节小结 |
| 1.4 核酸检测技术目前面临的问题 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 基于分子信标和快速PCR的双重荧光可视化检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 对虾IHHNV病毒标准PCR检测方法建立 |
| 2.3.2 快速PCR体系循环时间参数探索 |
| 2.3.3 分子信标用于可视化检测条件探索 |
| 2.3.4 可视化检测平台灵敏度与特异性评估 |
| 2.3.5 可视化检测平台应用于双重检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于基因编辑技术的防污染核酸荧光可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 针对柑橘黄龙病菌的LAMP扩增体系 |
| 3.3.2 Cas12a效应蛋白新PAM序列可行性分析 |
| 3.3.3 基于Cas12a效应蛋白的荧光可视化检测体系 |
| 3.3.4 基于UDG酶消解的防污染核酸检测体系 |
| 3.3.5 防污染荧光可视化核酸分析平台的搭建 |
| 3.3.6 防污染荧光可视化核酸分析平台灵敏度评估 |
| 3.3.7 防污染荧光可视化核酸分析平台用于柑橘黄龙病菌检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于玻璃化CRISPR及免样本提取的荧光可视化核酸分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 针对非洲猪瘟病毒的LAMP扩增体系 |
| 4.3.2 免样本提取的恒温核酸扩增体系 |
| 4.3.3 针对非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a检测体系 |
| 4.3.4 普鲁兰糖和海藻糖用于对CRISPR体系的保护 |
| 4.3.5 玻璃化的CRISPR薄膜加速老化试验 |
| 4.3.6 免样本提取可视化核酸分析平台搭建 |
| 4.3.7 免样本提取可视化核酸分析平台用于非洲猪瘟病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（4）伊通河流域抗生素污染、微生物耐药性及生物毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 抗生素概述 |
| 1.1.1 抗生素分类 |
| 1.1.2 抗生素药理作用 |
| 1.1.3 环境中抗生素的来源 |
| 1.1.4 抗生素的危害 |
| 1.1.5 抗生素检测方法 |
| 1.1.6 抗生素污染研究进展 |
| 1.2 抗生素细菌耐药性与耐药基因 |
| 1.2.1 细菌的耐药机制 |
| 1.2.2 耐药基因的转移方式 |
| 1.2.3 细菌耐药性及耐药基因的检测方法 |
| 1.2.4 耐药细菌和耐药基因的研究进展 |
| 1.3 水环境生物监测方法 |
| 1.3.1 微生物监测方法 |
| 1.3.2 发光细菌生物毒性测定方法 |
| 1.3.3 抗生素对发光菌毒性研究进展 |
| 1.4 论文的选题依据、研究目标、研究内容和技术路线 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 第二章 伊通河流域抗生素污染特征及风险评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2.2 水样的采集 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 长春市三家污水处理厂进、出水中抗生素残留特征与水平 |
| 2.3.2 伊通河流域目标抗生素污染特征 |
| 2.3.3 污水处理厂排水和伊通河水体抗生素污染风险评价 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 伊通河流域总大肠菌群及大肠埃希菌耐药性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 伊通河水体中总大肠菌群浓度分布特征 |
| 3.3.2 伊通河水体中大肠埃希菌的耐药性分析 |
| 3.3.3 改进的DST-酶底物法的建立及大肠菌群耐药性测定 |
| 3.3.4 伊通河水体中总大肠菌群耐药性时空分布特征 |
| 3.3.5 伊通河抗生素残留、总大肠菌群耐药性和大肠埃希菌耐药率的相关性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 伊通河水体抗生素耐药基因与耐药性相关性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 抗生素对伊通河水体中总大肠菌群的抑制率 |
| 4.3.2 伊通河水体中ARGs的绝对丰度 |
| 4.3.3 伊通河水体中ARGs的相对丰度 |
| 4.3.4 总大肠菌群耐药性与ARGs相关性分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 典型抗生素对淡水发光菌的毒性效应研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 5.3.1 抗生素对青海弧菌Q67的时间依赖毒性 |
| 5.3.2 抗生素二元混合体系对青海弧菌Q67的时间依赖联合毒性 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论、创新点与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（5）牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 乳制品概况及检测方法研究 |
| 1.1 乳制品的种类与特点 |
| 1.2 乳制品中的微生物污染 |
| 1.3 国内外乳制品微生物限量标准对比 |
| 1.4 微生物检测方法 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌及沙门菌研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌研究进展 |
| 2.2 沙门菌污染 |
| 2.3 乳品中金黄色葡萄球菌及沙门菌检测 |
| 第3章 荧光定量PCR检测方法和环介导恒温扩增方法的原理及进展 |
| 3.1 QPCR和 LAMP的原理特点 |
| 3.2 QPCR和 LAMP引物设计 |
| 3.3 QPCR和 LAMP结果分析 |
| 3.4 QPCR和 LAMP检测特点 |
| 3.5 QPCR和 LAMP的应用进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 乳品中细菌总数荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 沙门菌环介导恒温扩增检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 金黄色葡萄球菌环介导恒温扩增检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 双重环介导恒温扩增检测方法的建立及试剂盒组装 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 试剂盒的组装 |
| 4.4 试剂盒检测 |
| 4.5 结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 罗氏沼虾发展现状 |
| 2 传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) |
| 2.1 IHHNV基因结构与分类 |
| 2.2 IHHNV宿主范围 |
| 2.3 IHHNV病理症状 |
| 2.4 IHHNV的传播途径 |
| 2.5 IHHNV检测技术 |
| 3 白斑综合征病毒(WSSV) |
| 3.1 白斑综合征病毒形态结构 |
| 3.2 白斑综合征病毒命名 |
| 3.3 白斑综合征病毒基因组 |
| 3.4 白斑综合征病毒的病理症状 |
| 3.5 白斑综合征易感宿主和传播途径 |
| 3.6 白斑综合征检测技术 |
| 4 虾肝肠胞虫 |
| 4.1 虾肝肠胞虫的易感宿主和传播途径 |
| 4.2 虾肝肠胞虫致病性 |
| 4.3 虾肝肠胞虫患病症状及病理变化 |
| 4.4 虾肝肠胞虫检测方法 |
| 4.5 虾肝肠胞虫防控措施 |
| 5 细菌常规鉴定法 |
| 5.1 气单胞菌 |
| 5.2 气单胞菌致病性 |
| 5.3 细菌鉴定方法 |
| 6 研究内容及目的意义 |
| 第二章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验毒株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 DNA提取 |
| 2.3 PCR反应体系 |
| 2.4 PCR条件优化 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 灵敏度检测 |
| 2.7 临床检验试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 退火温度优化结果 |
| 3.2 预变性条件优化结果 |
| 3.3 变性条件优化 |
| 3.4 循环数优化 |
| 3.5 WSSV、IHHNV和 EHP的 PCR程序优化结果 |
| 3.6 灵敏度检测 |
| 3.7 临床检测试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV多重PCR病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA提取 |
| 2.2 多重PCR反应体系 |
| 2.3 多重PCR反应条件优化 |
| 2.4 多重PCR特异性 |
| 2.5 多重PCR反应敏感性 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR退火温度优化 |
| 3.2 多重PCR预变性条件优化 |
| 3.3 多重PCR变性条件优化 |
| 3.4 多重PCR循环次数优化 |
| 3.5 多重PCR程序优化结果 |
| 3.6 多重PCR的特异性扩增结果 |
| 3.7 多重PCR灵敏度检测 |
| 4 讨论 |
| 第四章 罗氏沼虾两种细菌性病原的检测与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验材料及仪器设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细菌分离培养 |
| 2.2 细菌形态观察 |
| 2.3 细菌生理生化特性鉴定 |
| 2.4 药敏实验 |
| 2.5 分子生物学鉴定 |
| 2.6 人工感染实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 病原菌形态特征 |
| 3.2 生理生化特性 |
| 3.3 药敏试验 |
| 3.4 细菌16SrRNA分子鉴定 |
| 3.5 人工感染 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）鱼肉污染副溶血弧菌非预增菌快速检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 食源性致病菌引起的食品安全现状 |
| 1.2 副溶血弧菌 |
| 1.3 副溶血弧菌及其活菌的检测方法 |
| 1.3.1 副溶血弧菌的检测方法 |
| 1.3.1.1 细菌培养检测法 |
| 1.3.1.2 分子生物学方法 |
| 1.3.1.3 免疫学方法 |
| 1.4 样品前处理方法 |
| 1.4.1 蒙脱石封闭活性炭(BCAC)方法 |
| 1.4.2 免疫磁分离方法 |
| 1.5 致病菌活菌的检测方法 |
| 1.6 研究内容及意义 |
| 1.6.1 研究的内容 |
| 1.6.2 研究的意义 |
| 2 Rti-LAMP结合BCAC非预增菌快速检测鱼肉中副溶血弧菌 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 实验菌株与原料 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌培养及计数 |
| 2.2.2 细菌DNA提取 |
| 2.2.3 Rti-LAMP反应 |
| 2.2.4 模拟污染鱼肉样品预增菌培养处理的Rti-LAMP检测(E-Rti-LAMP) |
| 2.2.5 蒙脱石封闭活性炭的制备 |
| 2.2.6 模拟污染鱼肉样品BCAC前处理的非预增菌Rti-LAMP检测(BCAC-Rti-LAMP) |
| 2.2.7 实际样品中细菌DNA的提取 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 建立菌液稀释倍数及吸光值间的线性关系 |
| 2.3.2 Rti-LAMP检测副溶血弧菌方法的建立 |
| 2.3.3 E-Rti-LAMP检测模拟副溶血弧菌污染鱼肉方法的建立 |
| 2.3.4 BCAC-Rti-LAMP非预增菌检测模拟副溶血弧菌污染鱼肉方法的建立 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测鱼肉中活副溶血弧菌 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.1.1 实验菌株与原料 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细菌培养及计数 |
| 3.2.2 死菌的制备 |
| 3.2.3 EMA前处理副溶血弧菌样品 |
| 3.2.4 不同浓度EMA对 LAMP扩增活菌的影响 |
| 3.2.5 不同浓度EMA对 LAMP扩增死菌的影响 |
| 3.2.6 EMA-Rti-LAMP方法检测活的副溶血弧菌标准曲线的建立 |
| 3.2.7 EMA-Rti-LAMP从死活混合菌中检测活菌的标准曲线的建立 |
| 3.2.8 样品细菌DNA提取 |
| 3.2.9 模拟污染鱼肉样品BCAC结合EMA前处理的非预增菌Rti-LAMP检测(BCAC-EMA-Rti-LAMP) |
| 3.2.10 市售鱼肉样品的对比检测 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 不抑制Rti-LAMP方法扩增活菌的EMA最大浓度 |
| 3.3.2 抑制Rti-LAMP方法扩增死菌的EMA最小浓度 |
| 3.3.3 EMA-Rti-LAMP检测活的副溶血弧菌标准曲线的建立 |
| 3.3.4 EMA-Rti-LAMP方法从死活混合菌中检测活菌的标准曲线的建立 |
| 3.3.5 BCAC-EMA-Rti-LAMP非预增菌检测模拟活副溶血弧菌污染鱼肉样品的方法建立 |
| 3.3.6 对比检测生鲜鱼肉样品中活副溶血弧菌的污染情况 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 抗副溶血弧菌多克隆抗体免疫磁珠的制备 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 实验菌株与原料 |
| 4.1.2 主要材料与试剂 |
| 4.1.3 仪器与设备 |
| 4.1.4 实验试剂的制备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 全菌抗原的制备 |
| 4.2.2 鞭毛蛋白的制备 |
| 4.2.3 SDS-PAGE分析 |
| 4.2.4 硫酸铵用量优化 |
| 4.2.5 蛋白浓度的测定 |
| 4.2.6 日本大耳兔的免疫 |
| 4.2.7 抗体血清的制备 |
| 4.2.8 抗体血清的纯化 |
| 4.2.9 副溶血弧菌多克隆抗体效价的测定 |
| 4.2.10 免疫磁珠的制备 |
| 4.2.11 免疫磁珠偶联时抗体用量的优化 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 筛选运动能力强的副溶血弧菌 |
| 4.3.2 硫酸铵用量优化 |
| 4.3.3 副溶血弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 4.3.4 抗体纯化后的SDS-PAGE分析 |
| 4.3.5 抗体浓度的测定 |
| 4.3.6 副溶血弧菌全菌抗体的效价测定 |
| 4.3.7 副溶血弧菌鞭毛蛋白抗体的效价测定 |
| 4.3.8 偶联磁珠的抗体用量优化 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）不同来源副溶血性弧菌遗传多样性与耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 细菌基因组结构 |
| 3 微进化 |
| 3.1 细菌微进化的研究方法 |
| 3.1.1 全基因组测序技术 |
| 3.1.2 多位点序列分型(MLST) |
| 3.2 基因组学在微进化中的应用 |
| 4 食源性使病菌生长异质性对微生物风险评估的影响 |
| 4.1 微生物异质性 |
| 4.2 食品微生物风险评估概况 |
| 4.3 常见食源性致病菌生长异质性对风险评估的影响 |
| 4.3.1 李斯特菌生长异质性研究 |
| 4.3.2 副溶血性弧菌生长异质性研究 |
| 4.3.3 沙门氏菌生长异质性研究 |
| 4.3.4 其他食源性致病菌生长异质性研究 |
| 4.4 小结 |
| 5 课题引出 |
| 第二章 水产品、临床与病虾来源副溶血性弧菌遗传多样性与微进化研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株信息及培养条件 |
| 2.2 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 |
| 2.3 毒力基因的检测 |
| 2.4 多位点序列分型及种群结构分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 序列类型(Sequence Types,STs)的多样性 |
| 3.2 克隆复合体(Clonal Complexes,CCs)的鉴定 |
| 3.3 系统发育分析 |
| 3.4 毒力基因的分布 |
| 3.5 副溶血性弧菌呈现季节性差异分布 |
| 3.6 核苷酸多样性分析 |
| 3.7 微进化分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 水产品与病虾来源副溶血性弧菌耐药性与微进化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 副溶血性弧菌菌株信息 |
| 2.3 副溶血性弧菌鉴定 |
| 2.4 菌种的活化以及接种液的制备 |
| 2.5 副溶血性弧菌耐药性检测 |
| 2.6 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 |
| 2.7 副溶血性弧菌毒力基因的检测 |
| 2.8 副溶血性弧菌多位点测序分型分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 副溶血性弧菌耐药概况 |
| 3.2 水产品及病虾分离的副溶血性弧菌耐药表型对比分析 |
| 3.3 水产品及病虾分离的副溶血性弧菌多重耐药情况分析 |
| 3.4 基于多位点测序分型分析水产品及病虾分离株的耐药性差异 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食源性致病菌 |
| 1.2 病原微生物常用鉴别方法 |
| 1.2.1 传统培养法 |
| 1.2.2 传统培养法的优化 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 核酸检测 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第2章 基于HAND系统食源性致病菌实时PCR检测技术的建立 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 菌株及来源 |
| 2.1.2 培养基和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 2.2.2 靶序列与引物 |
| 2.2.3 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.2.4 单重实时PCR的特异性 |
| 2.2.5 单重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.6 单重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.2.7 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.2.8 多重时候PCR的特异性 |
| 2.2.9 多重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.10 多重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.3.2 单重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.3 单重实时PCR敏感性结果 |
| 2.3.4 单重实时PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.3.5 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.3.6 多重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.7 多重荧光定量PCR敏感性结果 |
| 2.3.8 多重荧光定量PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 多重实时PCR体系的玻璃化 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 菌株及来源 |
| 3.1.2 培养基和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 3.2.2 反应体系的玻璃化 |
| 3.2.3 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 反应体系的玻璃化 |
| 3.3.2 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 复杂样本的快速提取 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株及来源 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 复杂样本快速提取方法 |
| 4.2.1 食品模拟样本 |
| 4.2.2 粪便模拟标本 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果 |
（10）大鲵虹彩病毒等温扩增可视化检测方法的建立（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大鲵虹彩病毒病研究进展 |
| 1.1 虹彩病毒简介 |
| 1.2 虹彩病毒的流行病学研究 |
| 1.3 虹彩病毒的检测方法 |
| 2 等温扩增技术研究进展 |
| 2.1 核酸序列依赖等温扩增技术 |
| 2.2 滚环扩增技术 |
| 2.3 单引物等温扩增技术 |
| 2.4 链置换等温扩增技术 |
| 2.5 依赖解旋酶的等温扩增 |
| 2.6 环介导等温扩増技术 |
| 3 交叉引物等温扩增(CPA)技术原理及应用 |
| 3.1 交叉引物等温扩增技术概述 |
| 3.2 单交叉引物等温扩增(SCPA)技术的扩增原理 |
| 3.3 SCPA的引物设计原则 |
| 3.4 SCPA扩增结果的分析方法 |
| 3.5 SCPA技术的特点 |
| 3.6 CPA技术的应用 |
| 4 重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术原理及应用 |
| 4.1 重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的扩增原理 |
| 4.2 RPA的引物设计原则 |
| 4.3 RPA扩增结果的分析方法 |
| 4.4 RPA技术的特点 |
| 4.5 RPA技术的应用 |
| 5 核酸快速检测试纸原理及应用 |
| 5.1 核酸快速检测试纸原理 |
| 5.2 核酸快速检测试纸应用 |
| 第二章 大鲵虹彩病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立和优化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 主要试剂材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒提取方法 |
| 2.3.2 PCR方法 |
| 2.3.3 PCR产物和单交叉引物等温扩增产物检测方法 |
| 2.4 引物设计 |
| 2.5 GSIV-SCPA检测体系建立及条件优化 |
| 2.5.1 GSIV-SCPA检测体系建立和引物筛选、鉴定 |
| 2.5.2 交叉引物浓度优化 |
| 2.5.3 Mg~(2+)浓度优化 |
| 2.5.4 dNTPs浓度优化 |
| 2.5.5 Betaine浓度优化 |
| 2.5.6 反应时间的优化 |
| 2.5.7 反应温度的优化 |
| 2.6 GSIV-SCPA方法的特异性评价 |
| 2.7 GSIV-SCPA方法的灵敏度评价 |
| 2.8 GSIV-SCPA方法用于患病大鲵样品的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GSIV-SCPA检测体系建立及条件优化 |
| 3.1.1 GSIV-SCPA检测体系建立和引物筛选、鉴定 |
| 3.1.2 交叉引物浓度优化 |
| 3.1.3 Mg~(2+)浓度优化 |
| 3.1.4 dNTPs浓度优化 |
| 3.1.5 Betaine浓度优化 |
| 3.1.6 反应时间的优化 |
| 3.1.7 反应温度的优化 |
| 3.2 GSIV-SCPA方法的特异性评价 |
| 3.3 GSIV-SCPA方法的灵敏度评价 |
| 3.4 GSIV-SCPA方法用于实际样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 大鲵虹彩病毒重组酶聚合酶等温扩增检测方法的建立和优化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 主要试剂材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病样组织总 DNA 提取 |
| 2.3.2 重组酶聚合酶等温扩增产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.3 DNA胶回收 |
| 2.4 引物设计 |
| 2.5 GSIV-RPA检测体系建立及条件优化 |
| 2.5.1 GSIV-RPA检测体系建立和引物筛选 |
| 2.5.2 GSIV-RPA扩增时间的优化 |
| 2.6 GSIV-RPA方法的特异性评价 |
| 2.7 GSIV-RPA方法的灵敏度评价 |
| 2.8 GSIV-RPA方法用于患病大鲵样品的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GSIV-RPA检测体系建立及条件优化 |
| 3.1.1 GSIV-RPA检测体系建立和引物筛选 |
| 3.1.2 GSIV-RPA扩增时间的优化 |
| 3.2 GSIV-RPA方法的特异性评价 |
| 3.3 GSIV-RPA方法的灵敏度评价 |
| 3.4 GSIV-RPA方法用于实际样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
四、应用多重聚合酶链反应同时检测二种弧菌的探讨（论文参考文献）
- [1]数字微流控海洋病原菌检测芯片系统的构建与研究[D]. 赵宏宇. 大连大学, 2021(01)
- [2]海产品中副溶血性弧菌和沙门氏菌的核酸快速检测新方法研究[D]. 陈娇. 青岛科技大学, 2021(01)
- [3]荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 钱程. 浙江大学, 2021(01)
- [4]伊通河流域抗生素污染、微生物耐药性及生物毒性研究[D]. 于洋洋. 东北师范大学, 2020(04)
- [5]牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立[D]. 关玉婷. 吉林大学, 2020(08)
- [6]罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立[D]. 郭莹. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]鱼肉污染副溶血弧菌非预增菌快速检测方法的研究[D]. 杨珺. 江西农业大学, 2020
- [8]不同来源副溶血性弧菌遗传多样性与耐药性研究[D]. 卢奕. 上海海洋大学, 2020(03)
- [9]基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立[D]. 钟宜科. 河北工程大学, 2020(02)
- [10]大鲵虹彩病毒等温扩增可视化检测方法的建立[D]. 张浩. 河南农业大学, 2019(06)