骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究

一、骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究（论文文献综述）

王松^[1]（2019）在《CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究》文中研究说明目的:以携带牙骨质蛋白1（cementum protein 1,CEMP1）基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并构建细胞膜片,探讨CEMP1基因修饰的BMSCs细胞膜片对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用。方法:1.全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,使用流式细胞术检测其表面标志物,经成骨、成脂诱导后观察细胞的多向分化能力。2.使用维生素C连续诱导法构建BMSCs细胞膜片,通过组织学染色以及扫描电镜观察膜片的结构。使用免疫荧光染色检测膜片胞外基质Ι型胶原（collagen typeΙ,Col-Ι）、骨膜蛋白（periostin,PN）和纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。3.使用携带CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs并构建细胞膜片,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR和Western Blot检测转染后BMSCs膜片中CEMP1基因和蛋白的表达。4.采用双侧卵巢切除术构建大鼠绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO）动物模型,通过比较术后3个月大鼠体重以及股骨和子宫组织形态学鉴定模型构建是否成功。5.在PMO大鼠下颌构建牙周缺损模型,将CEMP1基因修饰的BMSCs膜片植入牙周组织缺损中,术后28 d取材制作组织切片,HE和Masson染色观察分析牙周组织再生情况,评价CEMP1基因修饰BMSCs细胞膜片对PMO大鼠牙周组织再生的作用。结果:1.成功分离培养大鼠BMSCs,经成骨诱导液培养21 d,茜素红染色可见矿化结节生成;成脂诱导液培养21 d,油红O染色可见空泡状脂滴形成。流式细胞术检测发现所培养的BMSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD45和CD34。2.成功构建BMSCs细胞膜片,膜片呈乳白色半透明薄膜状,细胞死活荧光染色示膜片由具有活力的细胞构成。3.HE和Masson染色可见BMSCs细胞膜片由多层细胞重叠排列,富含细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,免疫荧光结果示膜片ECM中高表达FN、PN以及Col-Ι。4.扫描电镜下可以观察到BMSCs膜片间存在大量ECM。5.成功构建转染LV-CEMP1-EGFP的BMSCs细胞膜片,流式细胞术检测其转染效率为85.2%,荧光倒置显微镜下可以观察到密集的绿色荧光表达。6.RT-PCR和Western Blot结果显示转染后的BMSCs细胞膜片中高表达CEMP1基因和蛋白。7.成功构建SD大鼠PMO模型,去势组大鼠体重较假手术组明显增加,子宫体积缩小,腺体萎缩,松质骨骨小梁稀疏,数目明显减少。8.CEMP1基因修饰的BMSCs膜片植入PMO大鼠牙周缺损28 d后,LV-CEMP1-EGFP组的新生牙骨质、牙槽骨以及牙周组织面积最大（P<0.05）,LV-EGFP组和膜片组之间没有明显差异（P>0.05）,但均较对照组面积大（P<0.05）。各组间新生牙周膜宽度没有显着差异（P>0.05）。结论:使用维生素C连续诱导法可成功构建BMSCs细胞膜片,膜片内细胞活力良好,富含ECM。CEMP1基因修饰的BMSCs膜片可促进PMO状态下的牙周组织再生。

杨川博,何惠宇,崔杰,马文渊,杨楠^[2]（2013）在《骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨》文中提出背景:研究证明骨髓基质干细胞与煅烧骨支架材料结合后可形成组织工程化骨,但在动物体内的生物相容性及皮下诱导成骨的能力国内报道较少。目的:观察骨髓基质细胞复合异种煅烧骨植入BALB/c裸鼠背部皮下的成骨性能及煅烧骨材料作为组织工程骨支架材料的可行性。方法:选用经脱脂及脱蛋白处理后高温煅烧形成的骨支架材料与梯度密度离心法分离培养至第3代的羊骨髓基质干细胞构建细胞-煅烧骨复合物植入BALB/c裸鼠背部皮下,选同期对侧背部皮下植入单纯煅烧骨为对照组。结果与结论:煅烧后的松质骨块为白垩色,表面呈蜂窝状多孔结构,保留了天然松质骨的多孔状空间结构。骨小梁结构完整,孔隙相互连通。骨髓基质干细胞接种到煅烧骨后24h可见大量细胞黏附于支架上,7d后细胞分泌大量细胞外基质,细胞与基质分界不清,细胞能在材料上良好地黏附、增殖与生长,细胞活性未受到支架材料的影响。植入4周后,两组均可见煅烧骨边缘出现少量残片,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙周边可发现骨细胞,对照组煅烧骨表面可见纤维结缔组织包绕。植入后8周,两组均可见到煅烧骨部分降解为片状类骨质,周围有成纤维细胞包绕,排列紧密,形态多样,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙内可见煅烧骨表面有排列成行的成骨细胞,孔隙间有散在淋巴细胞浸润。对照组标本可见孔隙内有大量结缔组织长入,未见明显成骨迹象。结果说明,经高温煅烧后的松质骨材料,具有良好的生物相容性和生物安全性,可作为骨髓基质干细胞的良好载体,复合后植入体内能够诱导新生骨组织形成,可作为骨缺损组织工程修复的支架材料。

李景峰^[3]（2012）在《表面修饰煅烧骨的制备及其在体外体内的成骨实验研究》文中研究指明第一部分表面矿化修饰煅烧骨的制备及其理化性质和生物相容性的研究目的探讨一种新的仿生骨材料表面修饰煅烧牛松质骨的制备方法,以提高煅烧牛松质骨作为组织工程骨的活性。方法将制备好的大小一致的煅烧牛松质骨随机分成两组,分别浸泡在配制好的单倍模拟体液（SBF）和1.5倍SBF中。每组材料的浸泡时间均为三个时间点分别为7d、14d、21d。浸泡结束后取出煅烧骨材料烘干,然后每组材料每个时间点取样喷金,用扫描电镜（SEM）观察材料表面形态并分析材料表面矿化成分。通过比较选出效果最理想的表面修饰煅烧牛松质骨材料,研究其孔径、孔隙率、抗压和抗折强度等理化性质,并与未经表面修饰的煅烧骨材料进行比较。初步评价其生物相容性。结果EM对两组各个时间点进行表面观察与分析显示,浸泡在1.5倍SBF里面的材料7d后表面可见有散在的类骨磷灰石,14d时表面可见类骨磷灰石层较完整、均一,21d时材料表面类骨磷灰石层凌乱并有裂纹,而浸泡在单倍SBF的煅烧骨材料在浸泡7d、14d、21d后表面形成的类骨磷灰石均较少。在1.5倍SBF中浸泡14d后的煅烧骨材料在理化性质方面与未经表面矿化的煅烧骨未见明显差别,其生物相容性能良好。结论煅烧骨材料在1.5倍模体液中浸泡14d可以获得最佳表面修饰效果,同时保留了原有煅烧骨材料的基本理化特性,具有良好的生物相容性。第二部分表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料对小鼠MC3T3-E1粘附、增殖和向成骨方向分化的研究目的构建表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料,评价表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料对小鼠MC3T3-E1细胞的粘附、增殖和诱导成骨分化的影响。方法对煅烧骨材料进行表面改性以提高煅烧骨支架材料的骨传导活性与骨诱导活性。将制备好的表面矿化修饰煅烧骨直接与本课题组自主设计并研制的BMP-2活性多肽（P24）进行复合,构建表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料。检测P24在表面矿化修饰煅烧骨支架材料中的释放情况。实验分三组：A组为表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽材料,B组为表面矿化修饰煅烧骨材料,C组为单纯的煅烧骨材料。分别将小鼠MC3T3-E1细胞种植在三种材料表面,测定细胞与材料到粘附率。四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT）和扫描电镜（SEM）检测小鼠MC3T3-E1细胞体外增殖活性,同时通过检测碱性磷酸酶（ALP）活性,ALP染色和钙结节茜素红染色了解小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化情况。结果体外缓释试验证实P24在表面矿化修饰煅烧骨表面具有缓慢释放特性。细胞粘附率,MTT试验和SEM检测显示,小鼠MC3T3-E1细胞在表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料表面的粘附性能和增殖能力明显高于表面矿化修饰煅烧骨和单纯的煅烧骨材料,同时表面矿化修饰煅烧骨材料组高于单纯的煅烧骨材料组,组间差异具有统计学意义（P<0.05）。ALP活性检测显示：P24诱导的A组ALP活性明显高于B组和C组,B组高于C组。ALP染色和钙结节茜素红染色：P24诱导的A组出现阳性表现的时间最早。结论表面矿化修饰煅烧骨能促进小鼠MC3T3-E1细胞在骨基质材料表面的粘附与增殖并能较好地保持细胞的形态。表面矿化修饰煅烧骨是活性多肽P24较理想的一种载体材料,有利于充分发挥P24的成骨活性。第三部分BMP-2活性肽/鼠尾Ⅰ型胶原复合物植入异位成骨的实验研究目的用动物实验的方法验证鼠尾工型胶原支架与自行研制合成的BMP2活性多肽复合后诱导异位成骨的能力与作用。方法自行提取鼠尾Ⅰ型胶原以及与BMP2活性多肽复合冻干后低真空模式下电镜观察胶原结构。实验分2组。对照组：单纯鼠尾Ⅰ型胶原组；实验组：BMP2活性多肽/鼠尾Ⅰ型胶原复合物组。将24只SD大鼠随机分成2组,对照组6只,实验组18只。每只大白鼠右侧大腿作2cm的切口,制备股四头肌肌袋模型,将上述材料分别植入肌袋。术后第3,6周分别作放射学检查（X-ray, CT）,第6周将所有大白鼠处死作组织学（HE和Von Kossa染色）检查。结果鼠尾Ⅰ型胶原冻干后孔径大小合适与BMP2活性多肽复合后无明显改变,是一种较理想的载体。术后第3,6周放射学检查可见实验组有明显的钙化影形成,且第6周成骨范围要明显大于第3周时所见,而对照组无成骨现象。术后第6周组织学观察可见实验组植入区有成骨细胞和大量新骨形成,而对照组仅见炎性细胞改变。结论鼠尾工型胶原是一种较好的载体支架材料,自行研制合成的BMP2活性多肽与其复合后,具有较强的异位诱导成骨能力。目的探讨表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修复兔桡骨缺损的可行性与疗效。方法取新西兰大白兔36只,雌雄不限,随机分成三组,每组12只,建立桡骨中段10mm的临界大小骨缺损模型。A组,植入表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料；B组,植入表面矿化修饰煅烧骨材料；C组,植入单纯的煅烧骨材料。三组材料植入前分别行电镜扫描观察。术后未行固定。术后4、8、12周行X线观察与评分,12周时行三维CT观察,8、12周行HE染色与评分,12周时行Masson染色观察,比较三组材料修复骨缺损的能力。结果电镜观察显示：三组材料均保留了天然的孔隙结构,孔径大小为200μm～850μm。A组材料可见白色絮状或纤维状活性多肽紧贴在矿化修饰煅烧骨孔壁表面,B组材料煅烧骨表面可见一层较完整、均一的类骨磷灰石层形成。X线片观察显示,4周时,A组植入材料周围骨痂较丰富,与宿主骨间界限较模糊,B组植入材料周围形成骨痂较之为少,C组植入材料与断端界限清楚,未见明显骨痂形成。8周时,A组植入材料与宿主骨间界限模糊,可见大量骨痂形成,骨缺损基本消失,材料有不同程度的吸收,B组植入材料周围骨痂形成较前增多,C组植入材料与断端界限较模糊。12周时,A组植入材料与宿主骨连接自然,骨痂开始塑形,髓腔有再通现象,B组植入材料与宿主骨愈合欠自然,材料部分吸收,C组植入材料未见明显吸收,骨缺损界限不清。X线评分显示术后4、8、12周时,A组与B组和C组相比,具有有统计学意义（P<0.05）。术后12周时三维CT显示,A组骨缺损基本修复,新生骨与宿主骨未见明显界限,B组新生骨与宿主骨之间断端不清,C组骨缺损尚未完全修复。组织学观察,术后8、12周时HE染色评分示A组骨缺损修复情况要明显优于与B组和C组,组间具有显着差异性（P<0.05）。Masson染色结果示,12周时,A组可见植入材料与宿主骨交界处大量新生骨和板层骨形成,同时可见不规则骨髓腔和大量纤维组织形成,B组植入材料被增生纤维组织包裹,新生骨较A组少,C组缺损区被大量纤维组织充填,新生骨明显较少,骨髓腔封闭。结论体外构建的表面矿化修饰煅烧骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料是一种较理想的骨缺损修复支架材料,能在体内启动经典的软骨内化骨过程,促进骨缺损的修复。

刘斌钰,樊功为,李宁毅,金晓明,袁荣涛,陈立强^[4]（2009）在《复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的应用》文中研究指明背景:用于修复骨缺损的方法有直接植入、复合细胞植入以及加入生长因子植入。近年来,复合细胞植入和加入生长因子植入的研究受到比较广泛的关注。目的:观察复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨修复颌骨缺损的作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-04在青岛大学医学院附属医院中心实验室及口腔研究室完成。材料:取成年牛长骨骨骺端,经脱脂、脱蛋白、煅烧处理后制得煅烧骨。将第3代的骨髓间充质干细胞悬液加到煅烧骨上制备煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。将富血小板血浆因子滴加到将要植入的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体上,制得含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。方法:用牙钻在Wistar大鼠左侧下颌骨下缘备出1.0cm×0.8cm大小缺损,将30只大鼠随机分为3组,每组10只。对照组:将煅烧骨直接植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞组:将煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组:将含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。主要观察指标:观察各组煅烧骨在4,8,12周的成骨情况。结果:复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组煅烧骨在4,8,12周3个时间点的成骨情况明显优于对照组煅烧骨及复合骨髓间充质干细胞组煅烧骨（P<0.01）,对照组和复合骨髓间充质干细胞组之间的成骨情况差异无显着性意义（P>0.05）。结论:复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨可以促进下颌骨缺损修复,增加血管化与骨化。

王福科^[5]（2009）在《脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌骨缺损研究》文中提出目的:为解决组织工程骨血管化缓慢,新骨生长迟缓等问题,在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞,而且同时植入加速血管形成的内皮细胞。血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells,VECs）可以有力的支持脂肪干细胞（Adipose-Derived Stromal Cells,ADSCs）向成骨方向转变,还可以加快血管的发生为干细胞的成骨提供营养支持。有血管内皮细胞参与的联合培养的骨组织工程种子细胞越来越成为有希望在临床上应用。本实验研究在体、外情况下,在联合培养体系中血管内皮细胞对脂肪干细胞的增殖、成骨分化的影响;确定联合培养ADSCs和VECs作为种子细胞的生物工程骨修复骨缺损能力。方法:（1）分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液培养分化,于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF表面标志。（2）用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CDl33、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14天进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性。（3）取脂肪干细胞与脐血源血管内皮细胞按照血管内皮细胞、3:1、1:3、1:1、脂肪干细胞的浓度共同培养;分别倒置显微镜下观察联合细胞的形态变化;MTT法描出各浓度细胞的生长曲线,比较各组细胞生长曲线差异;7、14天各组ALP试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性和饱和茜素红钙染色;倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙分泌情况;4、7、14天定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量。（4）用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,扫描电镜观察;脂肪干细胞和血管内皮细胞接种部分脱蛋白骨和部分脱蛋白生物骨片,MTT法检测吸光度,评价纤维粘连蛋白脂肪干细胞在PDPB生长影响及三种不同细胞组在PDPBB生长情况,分析移植最佳时机,扫描电镜观察不同细胞组在PDPBB生长情况。（5）分别用BrdU标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,植于SD大鼠两侧股部肌袋处;流式细胞仪检测外周血CD3、CD4、CD8因子情况,根据CD4/CD8分析外周血T淋巴亚群情况来分析机体植入组织工程骨的免疫排斥情况;硬组织切片计算比较新骨成骨量;硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况。（6）取健康SD大鼠60只,随机分为5组（A组:PDPBB+血管内皮细胞组;B组;PDPBB+脂肪干细胞组;C组:PDPBB+1:1联合培养细胞组;D组:单纯PDPBB组:E组:空白组）,在下颌骨体部椎板咬骨钳制造0.5×0.4临界骨缺损,分别将组织工程骨植于SD大鼠下颌骨骨缺损处;E组做空白对照;X线检查及硬组织切片分析新骨面积成骨量。结果:（1）培养3周脐血单个核细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性;六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、vWF为阳性,CD133部分为阳性。（2）脂肪干细胞培养新生牛血清组贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,免疫荧光检测可见CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;成骨诱导后碱性磷酸酶阳性;茜素红染色可见大量红色钙结节影;胎牛血清组大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在;多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CDl33部分为阳性,梭形细胞均为阴性;成骨诱导后多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶和钙结节阳性。（3）体外联合培养细胞1:1和3:1组14天细胞之间出现许多突触相互连接,部分细胞融合成团块状,其余组细胞未见细胞团出现。生长曲线可见各组混合细胞吸光度逐渐升高,脂肪干细胞、3:1、1:3、1;1浓度组12天时处于高峰,1:1浓度组吸光度最高;血管内皮细胞组第10天吸光度达到高峰;随后各浓度组细胞吸光度逐渐下降,差异有统计学意义。（4）体外培养第7天时ALP染色脂肪干细胞、3:1、血管内皮细胞组呈阴性反应,1:3和1:1组混合培养细胞部分细胞阳性;茜素红骨钙检测各组均未发现红色阳性细胞。14天时ALP染色脂肪干细胞、血管内皮细胞组仍呈阴性反应,3:1、1:3和1:1组混合培养细胞可见片状阳性细胞;茜素红骨钙检测3:1、1:3和1:1组混合培养细胞极少数阳性细胞,其余各组未发现阳性细胞;各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间1:1组ALP最高;脂肪干细胞组和血管内皮细胞组ALP基本没有变化;1:1组和其它各组之间两两比较均有显着统计学意义（P＜0.01）;各组OC检测量随时间延长逐渐增高,4天时1:3组OC最高;7天和14天时1:1组OC最高;1:1组和其它各组之间两两比较均有显着统计学意义（P≤0.01）。（5）猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;细胞在部分脱蛋白骨上增殖曲线呈“S”形,在部分脱蛋白生物骨增殖曲线失去“S”形,第10天均达到高峰,各分组之间差异有统计学意义（P＜0.01）;各细胞组在PDPBB上吸光度逐渐增加,第10天均达到高峰,1:1混合细胞组最高,各细胞组之间差异有统计学意义（P＜0.01）;10天联合培养细胞细胞组大量细胞与PDPBB附着,呈巢状分布。（6）异位成骨第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,4周大量多核巨大破骨细胞位于支架材料周围长入材料内部,破坏、吸收支架材料;混合细胞组支架材料边缘开始出现均质、无细胞的类骨物质,孔隙内大量滋养血管形成;12周各组支架材料部分吸收,边缘模糊,易碎裂;各组边缘均可见均质的类骨物质出现,单纯PDPBB组较少,混合细胞组最多;部分切片上材料周边骨化中心;各组未见大量淋巴细胞侵润;新生骨形成联合细胞组最多,单纯PDPBB组较少,复合联合细胞组与各组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。（7）外周血T淋巴亚群CD4/CD8变化曲线:单纯PDPBB组大鼠外周血CD4/CD8在1-8周期间逐渐升高,第8周时位于最高点,之后逐渐降低,与空白组比较有统计学意义（P＜0.05）;复合VECs组第一周最高,1-3周逐渐降低,3-12周基本成直线状;复合ADSCs组、复合混合细胞组和空白组基本成直线状,与空白组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。（8）Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记BrdU空白组未见阳性细胞出现。（9）修复骨缺损第2周各组大量纤维组织包绕植入组织工程骨;空白组纤维组织已经封闭骨缺损;第4周各组植入材料不能移动,PDPBB复合血管内皮细胞组周围肌肉及纤维组织明显增厚,把组织工程骨和下颌骨连接成一体,组织工程骨血供较其他组丰富;第8周PDPBB复合联合培养细胞组组织工程骨空隙已经消失,与下颌骨骨性连接,表面部分材料已皮质化;第12周各组均已和下颌骨骨性连接,单纯PDPBB组、PDPBB复合脂肪干细胞和复合血管内皮细胞组材料部分吸收,材料大体形态还保留有原来形态;PDPBB复合联合培养细胞组形态大体和正常下颌骨相似,材料表面已皮质化;空白组骨缺损未被修复,骨断裂部分已经被骨皮质封闭,形成半圆形骨缺损区。（10）X线检查PDPBB复合血管内皮细胞组2周支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较宽,周围有新生骨痂生成;4-8周骨痂逐渐增多,12周时支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较前明显减淡,但支架材料大体形态依然存在。PDPBB复合脂肪干细胞组2周骨缺损周围骨痂开始生成,12周组织工程骨骨密度与正常骨质相比已基本相同;PDPBB复合联合培养细胞组4周-12周骨缺损周围骨痂生成随时间延长逐渐增加,8周已经骨性联合,骨缝已经消失;12周骨密度明显增加,骨形态已经基本恢复正常;单纯PDPBB组12周时支架材料骨密度较前减轻,与正常骨质对比明显;空白组8周和12周图像骨缺损面积减小,骨皮质已经封闭缺损端,仅剩下半圆或三角形缺损。（11）组织血检查新生骨形成混合细胞组最多,复合血管内皮细胞组次之,单纯PDPBB组较少,混合细胞组与各细胞组之间差异有显着差异（P＜0.01）;复合血管内皮细胞组与复合ADSCs比较有统计学意义（P＜0.05）;和单纯PDPBB组比较差异有显着差异（P＜0.01）。结论:（1）大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为成熟血管内皮细胞。（2）新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞;脂肪干细胞培养胎牛血清培养含有大量的血管内皮细胞。（3）血管内皮细胞和脂肪干细胞体外培养下,细胞相互促进增殖;血管内皮细胞能在体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞方向分化,1∶1比例细胞联合培养可以达到最好效果。（4）纤维粘连蛋白能促进细胞在PDPB支架材料上的增殖。（5）1∶1混合细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单种细胞,10天为最佳移植时机。（6）联合培养细胞组异位成骨能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力;各复合细胞组织工程骨机体内未引起明显免疫排斥反应。（7）组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成。（8）联合培养细胞组修复骨缺损能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力。

刘斌钰,马晓红,李宁毅,樊功为,金晓明,袁荣涛^[6]（2008）在《煅烧骨的生物相容性及细胞相容性评价》文中指出背景:煅烧骨的主要成分是高纯度的羟基磷灰石,其钙磷比值接近于人骨,且制作方法简单,价格低廉,受到广泛关注。目的:观察煅烧骨的生物相容性及其与骨髓间充质干细胞的细胞相容性,为组织工程骨重建颌骨缺损奠定一定基础。设计、时间及地点:观察性实验,2008-04在青岛大学医学院中心实验室及口腔研究室完成。材料:成年牛长骨骨骺端在箱式电阻炉内煅烧成煅烧骨。方法:将煅烧骨与第3代已经诱导的骨髓间充质干细胞复合,倒置显微镜和扫描电镜观察细胞相容性;应用溶血试验、凝血试验、急性毒性试验及皮下植入试验观察煅烧骨的生物相容性。主要观察指标:煅烧骨的孔隙率和超微结构;煅烧骨的生物相容性及其与骨髓间充质干细胞的细胞相容性。结果:煅烧后的松质骨块呈白色,其骨小梁结构完整,骨小梁的间隙为相互连通的孔隙,孔径主要在190～750μm,孔隙率为（80.39±1.40）%。骨髓间充质干细胞接种到煅烧骨后,倒置显微镜显示接种即刻细胞即充满煅烧骨网孔,24h可见大量细胞黏附于支架上,7d后细胞分泌大量细胞外基质,细胞与基质分界不清;扫描电镜显示接种1d可见少量细胞黏附与煅烧骨上,细胞多个伪足向四周伸出,接种7d可见大量细胞与胶原纤维覆盖于支架上,基本包埋支架。生物相容性试验显示煅烧骨无溶血现象,不引起凝血功能改变,无毒,皮下植入后动物伤口无感染、化脓,植入材料无排出现象,取材时见材料周围肌肉颜色、质地正常。结论:煅烧骨经高温煅烧后,可以彻底消除其抗原性,不会产生免疫排斥反应,细胞、组织、血液相容性及生物安全性好,可作为颌骨组织工程支架。

任军,王东,江朵^[7]（2008）在《兔骨髓源成骨细胞与多孔支架复合的实验研究》文中研究说明目的通过对兔骨髓基质干细胞的培养及诱导分化,并将细胞与新型复合型生物多孔支架联合培养,观察兔骨髓源成骨细胞在多孔支架表面的黏附及生长情况。方法兔骨髓基质干细胞经诱导分化为成骨细胞。将成骨细胞与处理过的多孔支架复合,在扫描电镜下观察细胞在支架表面的贴附情况。结果细胞接种后,在材料表面生长形态正常,属性与特征明显。结论新型复合型生物多孔支架与兔骨髓源成骨细胞具有良好的结合能力,可以进一步进行体内试验。

任军^[8]（2008）在《新型复合型生物多孔支架生物学性能评价》文中研究指明目的:本实验是通过对新型复合型生物多孔支架进行体内、体外生物安全性试验研究,评价其细胞毒性、组织相容性,为确保该材料临床应用的安全性提供有价值的理论依据。方法: （1）采用扫描电镜对新型复合型生物多孔支架进行表面形态观察。（2）细胞毒性试验:采用L929系小鼠成纤维细胞株进行传代培养,当细胞数量达到种植要求时,分别在新型复合型生物多孔支架的浸提液,聚乙烯浸提液（阴性对照）,0.64%苯酚溶液（阳性对照）中进行培养。观察细胞形态,并用MTT法测定细胞毒性。（3）全身急性毒性试验:采用健康昆明系小鼠30只,18～24g,雌雄不限,10只为一个实验组。经动物尾静脉注射相应药液（10ml/kg,即0.2ml/只）,即新型复合型生物多孔支架的浸提液、生理盐水、0.64%苯酚溶液。注射后24h、48h、72h称量体重变化,并观察一般状态,毒性表现及死亡情况。（4）溶血试验,本实验以支架材料作为实验材料;以聚乙烯作为阴性对照;以聚氯乙烯作为阳性对照,相应处理后分别加入稀释新鲜抗凝兔血,在分光光度计上,测取各材料的光密度值,计算出各自的溶血率。（5）兔成骨细胞的培养及与支架材料的联合培养:取新西兰大白兔2只,快速负压抽取兔股骨骨髓2m1,培养骨髓基质干细胞,并对其进行成骨诱导,促使骨髓基质干细胞分化为成骨细胞;对成骨细胞进行鉴定后,将新型复合型生物多孔支架与成骨细胞联合培养后,进行扫描电镜观察。结果: （1）新型复合型生物多孔支架表面形貌观察:其结构类似于生物活体的松质骨构架,它有利于骨组织的长入和材料自身的生物降解。（2）细胞毒性试验:支架材料细胞毒性一直为0～1级,说明支架材料无明显细胞毒性。（3）全身急性毒性试验:支架材料组和阴性对照组数据无统计学差异,二者与阳性对照组存在显着性差异。（4）溶血试验:支架组和阴性对照组数据无统计学差异,二者与阳性对照组存在显着性差异。支架材料的溶血率为3.199%,体外实验不引起溶血反应。（5）兔成骨细胞与支架材料的联合培养:扫描电镜下可见附着于材料表面和孔隙的细胞数量较多,并向孔隙深部长入,细胞突起增多,细胞跨越于孔隙中,细胞形态以球形为主,表面有丰富的绒毛状突起,细胞间有伪足样突起相连。结论:通过对新型复合型生物多孔支架进行一系列的生物学性能检测,表明了该支架具有良好的生物相容性,是一种很好的骨组织工程产品。

王根林^[9]（2008）在《可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究》文中认为第一部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在SD大鼠体内降解的实验观察【目的】制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite,SF/HA）复合人工骨材料,并将该材料植入生物体内降解,以了解SF/HA在动物体内的降解速率及机体对SF/HA的组织学反应,为后续成骨实验提供可靠的参考数据。【方法】以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板,以家蚕丝素短纤维为增强材料,以NaCl为致孔剂,采用等静压的方法制备4种SF/HA复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组,测定4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石在0.5h、2h、6h、12h及24h不同时间点的吸水率。将4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石植入SD大鼠背部皮下,进行体内降解观察。实验组分别于术后2、6、12、16、20及24周取材,对照组分别于术后2、12及24周取材,进行大体观察及组织学检查。【结果】丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同,制备的4种SF/HA人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下:SF/HA3、SF/HA4>SF/HA2、SF/HA1 >HA。HA、SF/HA1及SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解;SF/HA3 20～24周降解完毕;SF/HA4 12～16周降解完毕;各种材料周围组织未见明显变性坏死等。【结论】SF/HA1平均孔径为6.5μm,最大孔径也只有15μm,不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4虽然孔径、孔隙率满足要求,但力学强度较低,压缩强度只有1.59MPa,在水中很快散开,也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中,我们剔除这两种材料,将对SF/HA3及SF/HA2两种材料进行体外细胞相容性研究。第二部分兔骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究【目的】体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）,并向成骨方向诱导培养,为SF/HA相容性提供检测细胞及为SF/HA组织工程化骨提供适宜的种子细胞。【方法】抽取新西兰白兔的骨髓5ml,通过密度梯度离心法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。第2代细胞用含1×10-8g/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠及50μg/l L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;采用MTT法测定细胞增殖情况;使用碱性磷酸酶染色及Von Kossa钙结节染色等方法,鉴定其成骨性能。【结果】BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性,证实其有成骨潜能。【结论】可以通过体外分离纯化兔BMSCs,在一定条件下能够向成骨方向诱导分化,并能使细胞保持较高的成骨活性,适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。第三部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究【目的】以成骨诱导的BMSCs作为检测细胞,与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养,检测SF/HA的细胞相容性。【方法】将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SF/HA2及SF/HA3材料上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以MTT法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。【结果】扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SF/HA2及SF/HA3上能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTT法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。材料浸提液细胞毒性试验显示,细胞毒性分级均为0～Ⅰ级,两种SF/HA浸提液对细胞生长基本无毒性作用。【结论】SF/HA2与SF/HA3对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,具有构建组织工程化骨的可行性。第四部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究【目的】探讨SF/HA2及SF/HA3体内异位成骨的能力,并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性,为SF/HA修复节段性骨缺损提供实验依据。【方法】将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞,以5×107/ml的密度接种到SF/HA2,作为实验组1;接种到SF/HA3,作为实验组2,并于3～5d后植入兔背部肌肉中。植入单纯SF/HA2与SF/HA3,作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型,观察组织相容性。于术后第4、8、12周,每次随机选取5只兔处死后取材,大体观察及HE染色组织学观察,并进行骨组织形态计量学分析,定量比较各组新骨形成情况。【结果】实验组术后4、8、12周均有新骨形成,随着时间延长,新骨生成量增多;骨组织形态计量学分析显示,实验组1优于实验组2（P<0.05）;对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。【结论】肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示,两种SF/HA具有良好的组织相容性。SF/HA3与SF/HA2复合细胞后构建的组织工程化骨,具有良好的异位成骨能力,可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看,SF/HA3更适合于作为人工骨材料,将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。第五部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究【目的】探索SF/HA3组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。【方法】在本实验中将SF/HA3更名为SF/HA,与诱导的兔BMSCs复合,构建组织工程化骨。麻醉生效后,充分显露兔左侧桡骨中上段,造成15mm节段骨缺损。实验组植入SF/HA+BMSCs复合物,实验对照组植入SF/HA材料,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第4、8、12及16周行X线摄片及16周时行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色及Masson染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周及16周时各组动物的骨修复情况。【结果】实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,新骨生成有统计学差异（P<0.05）,实验组优于实验对照组优于空白对照组;大体观察及放射学检查证实:实验组兔桡骨缺损完全愈合;实验组对照组缺损处少部分骨愈合;空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。【结论】SF/HA与BMSCs复合,降解速率适宜,能较快被骨组织取代,具有相当于自体骨的骨缺损修复能力,基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用,单独用于节段性骨缺损修复作用有限。

雷荣昌^[10]（2006）在《异种松质骨支架构建组织工程骨实验研究》文中进行了进一步梳理在骨组织工程中，支架材料的选择是关键，它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适应、结合和修复。生物衍生材料具有类似于人骨的天然三维微孔结构而有利于成骨细胞的粘附和增殖及骨组织的重建，已成为骨组织工程支架材料的研究重点。猪-人异种移植是目前公认解决供器官严重短缺的可能途径之一，以去细胞猪主动脉瓣、去细胞猪真皮为支架的组织工程研究已见文献报道。鉴于此，本实验采用物理化学方法处理猪松质骨，对其结构特征、细胞生物相容性、体内移植免疫及体内成骨效率进行实验研究，为其临床运用提供实验依据。 第一章 异种松质骨支架的制备及结构特征观察 [目的]：研究猪松质骨支架结构特征。[方法]：采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架，扫描电子显微镜（SEM）观察材料的结构、图象分析测量孔径、液体静力称重法测量材料的孔隙率，DDW-100型万能实验机进行材料抗压测试。[结果]：猪松质骨支架外观呈乳白色、透光、无异味，维持原有形态并有一定的强度；骨块呈蜂窝状多孔结构，表面孔隙与深层孔隙相连通；扫描电镜观察材料表现为三维多孔网状结构，孔隙相互连通；孔径为387.54±21.60gm，孔隙率为78.26±2.01％，最大抗压强度和抗压力分别为25MPa和12Nu。[结论]：猪松质骨支架具有骨组织工程支架材料结构特征。 第二章 松质骨支架与成骨细胞生物相容性的实验研究 目的：观察松质骨支架对成骨细胞的粘附、生长、增殖的影响，为骨组织工程支架的选择提供实验依据。方法：采用percoll梯度离

二、骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究（论文提纲范文）

（1）CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究（论文提纲范文）

（2）骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨（论文提纲范文）

（3）表面修饰煅烧骨的制备及其在体外体内的成骨实验研究（论文提纲范文）

（4）复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的应用（论文提纲范文）

（5）脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌骨缺损研究（论文提纲范文）

（6）煅烧骨的生物相容性及细胞相容性评价（论文提纲范文）

（8）新型复合型生物多孔支架生物学性能评价（论文提纲范文）

（9）可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究（论文提纲范文）

（10）异种松质骨支架构建组织工程骨实验研究（论文提纲范文）

四、骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究（论文参考文献）

• [1]CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究[D]. 王松. 福建医科大学, 2019(07)
• [2]骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨[J]. 杨川博,何惠宇,崔杰,马文渊,杨楠. 中国组织工程研究, 2013(16)
• [3]表面修饰煅烧骨的制备及其在体外体内的成骨实验研究[D]. 李景峰. 华中科技大学, 2012(05)
• [4]复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的应用[J]. 刘斌钰,樊功为,李宁毅,金晓明,袁荣涛,陈立强. 中国组织工程研究与临床康复, 2009(29)
• [5]脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌骨缺损研究[D]. 王福科. 昆明医学院, 2009(10)
• [6]煅烧骨的生物相容性及细胞相容性评价[J]. 刘斌钰,马晓红,李宁毅,樊功为,金晓明,袁荣涛. 中国组织工程研究与临床康复, 2008(41)
• [7]兔骨髓源成骨细胞与多孔支架复合的实验研究[J]. 任军,王东,江朵. 基层医学论坛, 2008(16)
• [8]新型复合型生物多孔支架生物学性能评价[D]. 任军. 山西医科大学, 2008(06)
• [9]可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究[D]. 王根林. 苏州大学, 2008(04)
• [10]异种松质骨支架构建组织工程骨实验研究[D]. 雷荣昌. 中南大学, 2006(01)

标签：成骨细胞论文;  骨缺损论文;  血管支架论文;  矿化作用论文;  生物技术论文;