一、细胞内钙离子分析（论文文献综述）
杨晓旭[1]（2021）在《多巴胺在肝纤维化发生发展机制中的作用研究》文中研究表明目的:肝纤维化是是慢性肝病共同的病理基础。目前研究认为肝星状细胞（HSCs）活化是肝纤维化致病机制的中心环节。研究证实HSCs活化需要自噬参与,但自噬的调控机制并不完全清楚。已有研究发现多巴胺可能参与抑制肝癌生长,预实验结果发现多巴胺刺激HSCs内Ca2+浓度的增加,而Ca2+作为细胞内重要的第二信使可以调控包括细胞自噬在内的众多细胞生物学行为。瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）可调控细胞内外Ca2+稳态,可能是多巴胺诱导HSCs胞内钙离子水平改变过程中的关键钙通道。本研究旨在探讨多巴胺调控HSCs活化的潜在机制,为以神经递质和离子通道为靶点的抗肝纤维化的靶向治疗提供突破口。方法:1.使用CCK-8检测细胞增殖,检测多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2、HSC-T6细胞增殖情况的变化。2.流式细胞技术检测细胞凋亡情况。检测多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2、HSC-T6凋亡情况的变化。3.细胞水平使用Western-Blot技术检测,多巴胺治疗前后,TGF-β1诱导LX-2、HSC-T6活化前后α-SMA的蛋白表达变化及自噬相关蛋白P62、LC3蛋白表达变化。4.运用自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,通过荧光显微镜观察比较多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2细胞时自噬流的变化。5.动态高速钙离子成像系统检测不同浓度多巴胺刺激对LX-2、HSC-T6的胞内钙离子水平的影响。检测TRPV1是否参与了多巴胺诱导的HSCs的钙变化,比较抑制TRPV1功能前后,多巴胺刺激HSCs时的钙变化。6.Western-Blot检测激活TRPV1功能后,LX-2、HSC-T6细胞α-SMA及自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达变化。7.自噬双标腺病毒感染LX-2后,观察激活TRPV1功能前后,TGF-β1对HSCs自噬流的影响。8.Western-Blot和自噬荧光检测加入SB-705498抑制TRPV1前后,多巴胺和TGF-β1共同作用对LX-2、HSC-T6细胞的α-SMA及自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达变化。9.构建过表达或干扰TRPV1的质粒载体感染LX-2细胞,Western-Blot验证过表达和干扰是否成功,进一步检测过表达或干扰TRPV1前后,多巴胺和TGF-β1共同作用于HSCs后α-SMA表达的变化影响。10.使用Western-Blot检测验证多巴胺预刺激前后,TGF-β1诱导LX-2、HSC-T6细胞活化后磷酸化SMAD3蛋白的变化;检测SB-705498抑制TRPV1功能前后,多巴胺和TGF-β1共同作用于LX-2、HSC-T6后磷酸化SMAD3蛋白的变化。11.临床标本使用HE染色,Masson染色验证肝纤维化程度,免疫组织化学技术验证TRPV1的表达和自噬相关蛋白表达及肝纤维化指标的表达变化。12.采用CCl4灌胃诱导构建小鼠肝纤维化模型,从体内实验证明多巴胺治疗减轻小鼠肝脏的纤维化程度、降低肝脏组织自噬基因的蛋白表达。结果:1.使用CCK-8进行HSCs增殖情况的检测,显示TGF-β1可以促进HSCs的增殖能力,结果具有统计意义（p<0.05）,加入多巴胺后,可以显着抑制TGF-β1诱导的HSCs细胞增殖,结果具有统计意义（p<0.05）。2.凋亡实验检测多巴胺治疗前后,TGF-β1对HSCs凋亡的影响没有变化（p>0.05）。3.Western-Blot显示TGF-β1可以诱导HSCs细胞α-SMA、自噬蛋白LC3表达增加,自噬底物p62的表达降低,且具有统计意义（p<0.05）;加入多巴胺后,TGF-β1诱导的相关蛋白改变被显着逆转,提示多巴胺可逆转HSCs的活化和自噬发生,差异具有统计学意义（p<0.05）。4.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞后,荧光显微镜结果显示TGF-β1可以诱导HSCs的自噬流增加,而多巴胺预刺激后,则有效抑制了TGF-β1诱导的HSCs的自噬流增加。5.（1）在2 m M外Ca2+环境下,多巴胺刺激HSCs胞内Ca2+上升,且多巴胺刺激呈浓度依赖性变化,结果具有统计学意义（p<0.05）。（2）在0 m M Ca2+环境下,多巴胺刺激未引起细胞内Ca2+浓度的变化。（3）在给予钙池依赖性钙通道阻断剂2-APB、钠钙交换器亚型1抑制剂KB-R7943作用HSCs细胞后,多巴胺刺激诱导的细胞内Ca2+浓度无变化。（4）给予TRP家族非特异性抑制剂SKF-69365后能显着抑制多巴胺诱导的HSCs内Ca2+浓度增高（p<0.05）。加入TRPV4抑制剂RN-1734后,多巴胺仍能刺激HSCs钙变化,但加入TRPV1抑制剂SB-705498后则明显抑制了多巴胺刺激的细胞钙增加。（5）TRPV1激动剂capsaicin可刺激HSCs的钙变化（p<0.05）。6.Western-Blot显示TRPV1激动剂capsaicin刺激HSCs后,可以抑制α-SMA和自噬LC3蛋白的增加,抑制P62的降低。结果具有统计意义（p<0.05）。7.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,荧光显微镜观察到TRPV1激动剂capsaicin预刺激后,可以抑制TGF-β1诱导增加的HSCs的自噬流。8.Western-Blot显示多巴胺与TGF-β1共刺激抑制了α-SMA、自噬蛋白LC3表达的上升,给予TRPV1抑制剂SB-705498后,该作用消失。9.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,多巴胺抑制了TGF-β1诱导增加的自噬流,抑制TRPV1功能后,多巴胺对自噬流的抑制作用消失。10.使用质粒感染LX-2细胞干扰和过表达TRPV1后,Western-Blot验证TRPV1干扰过表达成功,结果具有统计学意义（p<0.05）。（1）Western-Blot检测显示与空转组相比,TRPV1过表达后,促进了多巴胺下调α-SMA的作用。（2）TRPV1干扰后,多巴胺不能下调α-SMA的表达（p<0.05）。11.（1）Western-Blot检测证实TGF-β1诱导活化HSCs后,磷酸化的SMAD3表达明显上升,结果具有统计意义（p<0.05）;加入多巴胺后,明显抑制TGF-β1诱导的磷酸化SMAD3的增加,结果具有统计学意义（p<0.05）。（2）而给予TRPV1特异性抑制剂SB-705498后,多巴胺不能下调TGF-β1诱导增加的磷酸化SMAD3的表达,且具有统计学意义（p<0.05）。12.HE染色、Masson染色观察比较临床肝组织样本的胶原沉积状态,将肝组织切片依据病理结果,分成正常组和肝纤维化组。与正常肝组织相比,肝纤维化组自噬蛋白LC3、肝纤维化指标α-SMA的表达增高,TRPV1表达下降,且具有统计学意义（p<0.05）。13.小鼠肝纤维化模型建立成功,HE染色和Masson染色观察显示,与正常组相比,模型组肝纤维化严重程度及肝损害明显,而多巴胺治疗组明显改善了肝纤维化的严重程度。使用Western-Blot技术检测各组TRPV1、α-SMA、P62的表达,与正常组相比,模型组的α-SMA表达增高、P62和TRPV1下降,而治疗组的α-SMA表达明显降低、P62和TRPV1表达回升,结果具有统计学意义（p<0.05）。结论:多巴胺刺激后,TRPV1通道被激活,并介导细胞内钙活化,细胞内钙信号重构,抑制HSCs细胞发生自噬,进而抑制TGFβ/SMAD3通道介导的HSCs的活化。提示多巴胺及TRPV1可能作为治疗肝纤维化的重要药物靶点。
马迪[2]（2021）在《细胞间隙连接通道的传输行为研究》文中认为分子通信是纳米机器之间进行信息交流的重要通信技术,在环境、工业和医疗等领域具有广阔的应用前景。作为纳米机器间的重要通道,间隙连接（Gap Junction,GJ）随着分子通信技术的兴起在传输行为方面也得到了快速发展。然而,GJ传输行为模型仍然存在局限性,且分子通信细节难以描述;此外,外部刺激信号对GJ介导的分子通信过程的影响机制也尚不明确。针对以上问题,论文的主要工作如下:1)在GJ代谢耦联的行为方式下,以钙离子作为传输信号,针对目前建立的GJ模型忽视连接蛋白类型差异而存在局限性的问题,引入渗透率这一连接蛋白多样性参数,优化了GJ传输模型,改善了模型在连接通道方面具有特殊性的问题。实验结果表明,渗透率参数能够正确反映不同连接蛋白的传输差异,优化后的模型更契合实际生物场景。2)在已优化的GJ代谢耦联模型基础上,针对因模型具有特殊性使分子通信过程中的细节难以描述的问题,提出了基于GJ蛋白影响下的信道过滤机制。解释了过滤机制的基本原理,并设计了一种星型传输的过滤方案,利用优化后的模型,对所提出的方案进行了验证。实验结果表明,不同刺激强度和GJ蛋白的渗透率差异影响过滤的实现过程。3)在GJ电耦联的行为方式下,以心肌细胞为例,针对外部消极刺激（高糖）影响GJ介导的分子通信过程不明的问题,建立了外部消极刺激与GJ数量关系的数学模型,利用信息论知识推理分析,得到了连接蛋白个数变化影响信道容量和传输延迟的结论。实验结果表明,外部消极刺激使GJ个数降低,随之信道容量也逐渐降低,且传输延迟不断升高,最后利用已有生物实验佐证了模型的合理性。论文实现了对GJ代谢耦联行为模型的优化,完善了分子通信中过滤这一细节,丰富了现有分子通信理论,有助于提高药物靶向治疗的效率;建立了电耦联下消极刺激强度与GJ数量关系的数学模型,分析得到了外部刺激对信道容量和传输延迟的影响,模型有助于设计GJ通道的纳米器件。
金贵虹[3]（2021）在《乙醇诱导的肝肿瘤细胞H4-ⅡE发生内质网应激及细胞凋亡中钙离子浓度的变化研究》文中研究指明目的:观察不同乙醇浓度对H4-ⅡE细胞增殖抑制、随乙醇浓度变化的内质网应激相关蛋白含量变化、钙离子浓度变化以及细胞凋亡的影响,探讨乙醇对肝损伤的机制。方法:1.采用MTT法检测去使用不同浓度的乙醇进行处理后的大鼠H4-ⅡE细胞的生存率,分别用不同浓度乙醇刺激12h,24h和48h后,测定不同乙醇浓度和持续时间对H4-ⅡE细胞增殖的抑制作用,分为对照组和实验组（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L）;2.Fluo-3AM方法检测不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）刺激12小时后的大鼠H4-ⅡE细胞内钙离子浓度的变化;3.蛋白免疫印迹试验法检测在不同浓度乙醇作用于H4-ⅡE细胞12h后,Caspase-3、Caspase-7、Caspaase-12的表达情况;4.流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验结果采用SPSS分析后,以均数±标准差的形式表示,各组间通过单因素多水平的方差分析,P<0.05时,我们认为差异具有统计学意义。结果:1.采用MTT法检测乙醇对H4-ⅡE细胞生存率的抑制作用不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）分别作用12h、24h、48h后,与对照组相比,细胞增殖明显受抑制,说明乙醇可抑制H4-ⅡE细胞的增殖,且与乙醇浓度和刺激时间呈正相关（P<0.05）。2.Fluo-3AM法检测H4-ⅡE细胞经不同浓度乙醇刺激后细胞内钙离子变化在不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）处理12h后的H4-ⅡE细胞中检测细胞内Ca2+浓度,结果显示:随着乙醇浓度增加,细胞内的钙离子浓度随之增高,各组与对照组之间的差异性分析可知,0.2mol/L组与对照组有统计学意义（P<0.05）。3.观察不同乙醇浓度作用12h后的细胞内的Casapase-3、Caspase-7、Caspase-12蛋白表达情况提取不同浓度乙醇（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）干预12h后的H4-ⅡE细胞内蛋白,经蛋白定量分析后,用蛋白免疫印迹试验法检测各组样品中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-12的蛋白表达情况,结果显示:经不同浓度乙醇处理的Caspase-3蛋白表达情况随着乙醇浓度增加而增多,对照组与其它各组间差异均有统计学意义（P<0.05）;经不同浓度乙醇处理的Caspase-7的的蛋白表达情况随着乙醇浓度增加而增多,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）;经不同浓度乙醇处理的Caspase-12的蛋白表达情况随乙醇浓度增加而增多,与对照组相比,0.1mol/L、0.2mol/L组蛋白表达增加,结果有统计学意义（P<0.05）。4.流式细胞术观察细胞凋亡率实验组与对照组（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）相比明显减少,P<0.05,即早期凋亡、晚期凋亡及死亡细胞比例增多。也就是说细胞凋亡率随乙醇浓度的变化而变化,且呈正相关。结论:1.乙醇对大鼠肝细胞生长具有抑制作用,导致肝细胞内钙离子稳态失衡,发生内质网应激,且这与乙醇浓度和乙醇的持续作用时间有关;2.乙醇诱导细胞内质网应激及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-12的异常表达,导致细胞凋亡并引起肝细胞损伤;3.乙醇所致肝细胞损伤,与钙离子稳态失衡引起内质网应激有关,由此表明可通过调控细胞内钙离子浓度,治疗及预防酒精性肝损伤。
张培培[4]（2021）在《高钙诱导的心脏电交替及其致心律失常作用机制的研究》文中认为背景心脏电交替现象指在恒定心率下的心电图波形、振幅等呈周期性地交替变化,它是心脏机械功能障碍和电活动不稳定性的重要表现。心脏电交替与临床上某些心脏疾病关系密切,能增加恶性室性心律失常和心脏猝死（sudden cardiac death,SCD）的发生风险,尤其在广泛的病理条件下,包括缺血性心脏病、心力衰竭和心肌梗死等,更容易诱发致命性的心律失常。SCD的发生主要源于恶性室性心律失常,而心脏电交替是导致恶性室性心律失常发生已知的重要危险因素。已有大量的临床前瞻性研究证明心脏电交替、恶性室性心律失常和SCD的发生有直接的因果关系,但心脏电交替产生的具体机制到目前为止仍尚无定论。现在普遍认为,心脏电交替现象是室性心律失常发生的先兆,在心律失常底物的产生中起主要作用,并促进折返现象,最终导致持续性心律失常的发生。在细胞水平上,心脏交替指在恒定的刺激频率下,心肌收缩力、动作电位时程（action potential duration,APD）和细胞内钙离子释放的周期性、间歇性的交替变化。因此,了解细胞水平上心脏电交替的发生机制对阐明心脏电交替诱发心律失常的机理意义重大。T波交替（T-wave alternans,TWA）指心室动作电位复极过程中周期性的交替变化,其是心脏电交替的一种常见的特殊形式,与室性心律失常及SCD易感性增加有关。TWA可在多种临床情况下观察到,包括先天性或获得性长QT间期综合征和缺血性心脏病、肥厚型心肌病以及终末期心力衰竭等。在不同临床和实验条件下发现TWA促进室性心律失常的恶性发展,增加SCD的发生概率。这一现象提示TWA可能普遍存在SCD发生的病理生理过程中,表明心脏电交替在抗心律失常治疗中具有重要临床指导意义。虽然现有数据表明,致心律失常性的TWA是临床风险的重要标志,但TWA的分子机制尚未阐明,且TWA引发SCD的潜在作用机理仍不清楚。因此,更深入地理解心脏电交替致心律失常发生的基本机制对识别高危患者和开发新的抗心律失常的治疗方法是至关重要的。大量模拟和观察性实验研究发现心脏电交替与心肌细胞的膜电位和钙循环的不稳定性有关,由于这两个参数之间存在许多反馈途径,因此心脏电交替确切的细胞机制仍存在争议。近年来,细胞钙循环调节的不稳定性逐渐成为心脏电交替促心律失常发生机制的研究热点。除了多种细胞膜离子流（如L-型钙电流、钠钙交换电流、钙依赖型离子流等）参与胞内钙循环调节外,调节肌浆网钙释放和回收相关的蛋白在胞内钙稳态维持中也起着重要的作用。这一现象提示心脏电交替的形成涉及多个离子通道和相关调节蛋白综合作用的结果。因此,把抗交替性心律失常的研究和治疗主要集中在单一离子通道上会存在一定的局限性。尽管已做了大量的研究工作,仍需要更多的机制研究来帮助寻找新的治疗靶点并更好地设计抗心律失常的治疗方法。钙依赖型PKC（protein kisase C,PKC）参与心脏多种离子通道活动的调控,包括心肌细胞钙稳态的调节,同时其本身也受到钙的反馈调节。越来越多的证据表明,钙超载可增强和促进PKC的激活,与室性心律失常的发生密切相关。然而,钙依赖型PKC对致心律失常性的心脏电交替活动的作用未见报道,因此对PKC、心脏交替、室性心律失常三者之间关系的研究有助于阐明心脏电交替致心律失常的发生机制。本研究通过建立高钙诱导心脏交替的病理模型,并在此基础上进一步探究心脏电交替致心律失常发生的分子机制,从而为治疗心脏交替致心律失常的新途径提供科学依据。研究内容1.高钙诱导中层心室肌细胞交替的模型的建立目的:通过胞内高钙干预成功诱导出心肌细胞交替方法:急性酶解法获取单个的中层左心室肌细胞。应用全细胞膜片钳的电流钳模式记录细胞动作电位的变化;通过双重激发荧光光电倍增系统测量心肌细胞内钙瞬变的变化;通过可视化动缘探测系统持续记录中层心室肌细胞收缩幅度的情况。结果:在单个中层心室肌细胞中,通过增加细胞内游离钙离子浓度,成功地诱导出了动作电位时程交替（APD-ALT）。高钙诱导的APD-ALT不仅表现出了钙浓度依赖性,还具有频率依赖性,且细胞内高钙可以降低频率诱导APD-ALT发生的阈值。此外,在高钙（7.2 m M）灌流的心室肌细胞中,成功观察到胞内钙瞬变交替（Ca T-ALT）和肌小节收缩幅度的交替。结论:成功建立了高钙诱导心室肌细胞交替的模型,表明高钙干扰胞内钙稳态调节导致了心脏交替的发生。2.高钙诱导心肌细胞交替与L-型钙电流(L-type calcium currents,ICaL)和胞内钙离子浓度变化的关系目的:确定胞内高钙的条件下诱导的心肌细胞交替与ICaL与胞内钙离子变化的关系方法:应用全细胞膜片钳技术分别在电流钳和电压钳模式下记录高钙的条件下细胞动作电位变化和L-型钙电流变化,并观察给药前后高钙诱导的APD-ALT变化。结果:高钙诱导的动作电位时程交替（APD-ALT）在动作电位的平台期最明显,同时发现ICaL阻滞剂硝苯地平可以消除高钙诱导的APD-ALT。但是,在高钙干预前后并没有发现ICaL的交替变化,表明高钙的条件下APD-ALT的发生并不是由于高钙诱导ICaL交替变化所导致的。透膜的钙离子螯合剂BAPTA-AM也对高钙诱导的APD-ALT表现出了明显的抑制作用。此外,结果显示硝苯地平和BAPTA-AM还可以消除高钙诱导的钙瞬变交替和肌小节幅度交替。结论:高钙条件下不会发生ICaL交替,此时发生的心肌细胞电交替是由于心肌细胞钙循环障碍所致。通过使用硝苯地平抑制ICaL内流和钙离子螯合剂BAPTA-AM直接降低胞内钙浓度均可以消除高钙诱导的心肌细胞交替现象,表明高钙条件下ICaL和胞内钙离子的动态变化与心肌细胞交替的发生有很强的相关性。3.调节PKC活性对高钙诱导的心脏交替致心律失常发生的影响目的:证明PKC传导通路参与高钙诱导的致心律失常性的心脏交替的发生和发展方法:应用全细胞膜片钳记录在电流钳记录细胞动作电位;应用钙荧光指示剂（Fura-2/AM）负载细胞测定胞内钙瞬态（Ca T）动态变化。另外,采用生物心电图信号采集与分析系统观察灌流的离体心脏心电图的变化。此外,蛋白印迹法检测了离体心脏灌流后左心室肌组织PKCα蛋白表达情况。结果:高钙诱导的APD-ALT不仅可以被PKC抑制剂BIM完全消除,同时应用PKC另一种选择性抑制剂G?6976表现出了类似的抑制作用。此外,PKC激活剂PMA在正常钙浓度水平可以诱导出APD-ALT现象。另外,BIM有效地预防高钙灌流液灌流的单个中层心室肌细胞中的Ca T-ALT发生,并且显着降低高钙导致的胞内钙瞬变紊乱的发生率。在离体心脏灌流中,BIM不仅预防高钙诱发的心电图上T波交替的出现,而且还大大降低了室性心律失常包括室颤和室速的发生率。此外,BIM降低了经高钙预处理的离体心脏组织中的PKCα蛋白水平。结论:PKC的过度活化可以促进心肌细胞交替的发生,药理学抑制PKC的活性可以降低心脏交替性室性心律失常的发生,表明药源性地抑制PKC的激活可能成为抗心律失常研究和治疗的新靶点。研究意义:本研究首次建立了高钙诱导心脏交替的病理模型,并在此基础上进一步探究致心律失常性的心脏交替的机制。结果发现通过药理性调节钙依赖性PKC的活性可以预防和控制与致心律失常性心脏交替的发生,证明了钙依赖性PKC信号传导通路对致心律失常性心脏交替发生的过程中钙稳态的维持起到重要的调节作用。这一认识不仅为心脏交替形成的分子学机制提供了新见解,也为预防与钙循环调节障碍相关的促心律失常性心脏交替的发生奠定了药理基础。
陈莎[5]（2021）在《β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究》文中研究说明急性缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一,具有发病率高、致死率高、致残率高和复发率高的特点,但迄今为止,其病理生理机制还尚不完全清楚,还未找到其治疗行之有效的方法。因此,深入阐明急性缺血性脑卒中的发病机制,寻找治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物具有很高的经济意义和社会价值。大量研究表明脑缺血后细胞间隙谷氨酸过量释放引起兴奋性毒性在脑缺血刺激后神经元细胞死亡过程中起着非常的作用。过量释放的谷氨酸主要激活两种突触后膜受体,NMDARs和AMPARs。AMPARs亚基Glu A2抑制钙离子通透,决定了AMPARs对钙离子通透性,依据AMPARs是否含有Glu A2,将AMPARs分为CI-AMPARs和CP-AMPARs。脑缺血损伤后,大量钙离子经过通透性已改变的AMPARs进入相对脆弱的海马CA1区锥体神经元,使胞内钙超载,引发神经元细胞发生致死性反应。另外,AMPARs介导了中枢神经系统（CNS）绝大多数快兴奋性突触传递,在学习记忆和认知等方面具有重要作用。研究发现脑缺血后神经元细胞内钙离子内流增加还加剧了脑缺血后神经退行性病变进程。长时程增强（long term potentiation,LTP）和长时程抑制（long term depression,LTD）调控的突触可塑性被认为是学习和记忆的生理基础。近期文献报道,CI-AMPARs从突触外和/或细胞内向海马突触膜表面转运募集,因而改变钙离子流,影响突触胞膜上电流变化,调控LTP和LTD过程进而影响认知相关的学习记忆过程。但目前,CI-AMPARs在急性缺血性脑卒中后认知障碍中是否发挥作用还不清楚。内源性大麻系统最早被发现在调节神经行为功能中发挥重要作用,如成瘾,焦虑,摄食等,后来研究发现大麻系统在脑缺血再灌注和一些神经退行性疾病的病理生理机制中发挥重要作用。本课题组在前期工作中筛选到一与大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid receptor type 2,CB2）结合的CB2受体完全激动剂β-石竹烯（β-Caryophyllene,BCP）,初步发现其具有保护神经损伤和提高脑缺血动物的学习记忆能力,但其具体发挥作用的明确机制不详。鉴于有CB2受体激动剂可以调节啮齿类动物内侧前额叶皮质锥体神经元中Ca2+流,即CB2受体可能调节离子稳态和神经元兴奋性的文献报道,为此,我们推测CB2受体β-石竹烯（BCP）具有的保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用可能与其调节与钙离子通透性相关的CI-AMPARs膜转运相关。基于这一科学假说,我们以小鼠神经元细胞糖氧剥夺复氧模型OGD/R及小鼠急性缺血性脑卒中模型MCAO为研究对象,通过MTT增殖实验、流式凋亡检测、细胞形态学观察、神经行为学评分、转棒实验、TTC染色、H&E染色、MWM水迷宫、物体辨别实验、免疫荧光双标、流式检测钙离子流、膜片钳电生理技术等实验,并初步分析临床急性脑梗病人临床样本与临床资料,从细胞、动物和临床标本水平,在验证与分析CB2受体β-石竹烯（BCP）具有保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用基础之上,研究了BCP调节CI-AMPARs膜转运与保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的关系,并探讨了BCP调节CI-AMPARs膜转运的分子机制。研究方法与结果:1.β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）以小鼠神经元细胞HT-22为研究对象,建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,分组:Control组、Control+10μM BCP组（正常对照组）、OGD/R+5μM BCP组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+20μM BCP组,作用时间24h、48h及72h,运用MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,从细胞水平验证与分析,BCP对OGD/R模型作用的剂量依赖及时间依赖关系,实验结果在细胞水平明确BCP对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）具有保护作用。（2）（1）选用C57BL/6,雄性,6～8周龄小鼠,随机分为假手术组（sham组）、sham+BCP 72mg/kg组（正常对照组）、模型+溶剂组、模型+BCP 36mg/kg治疗组、模型+BCP 72mg/kg治疗组和模型+144mg/kg治疗组,每组6只C57BL/6小鼠,连续灌胃给药6天,第6天采用大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立急性缺血性脑卒中模型。（2）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分（Modified Neurological Severity Score:m NSS）和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测各组小鼠脑梗死体积,苏木精-伊红（H&E）染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,从动物水平验证与分析BCP具有保护急性缺血性脑卒中小鼠的作用,结果发现BCP有明显剂量依赖性保护急性缺血性脑卒中小鼠模型脑神经损伤的作用。（3）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验的空间定位航行实验、空间探索实验检测逃避潜伏期、经过目标平台的次数及目标现象活动时间,物体识别实验（Object Recognition Task,ORT）检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,验证与分析BCP保护急性缺血性脑卒中后学习记忆障碍,结果发现BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的逃避潜伏期、经过目标平台的次数、目标现象活动时间及物体识别指数,即BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的认知功能障碍。2.β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运（1）运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中CI-AMPARs关键蛋白AMPARs亚基Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,结果发现BCP可以促进氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加。（2）运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现OGD/R细胞模型中,细胞内钙离子流增多,而BCP处理的OGD/R细胞,细胞钙离子内流减少,即BCP可以抑制氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中钙离子内流。（3）收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,制作冰冻切片,应用免疫荧光双染共定位方法（共染突触标志物Synaptophysin及Glu A2）检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,结果发现急性缺血性脑卒中模型MCAO中Glu A2在神经突触膜表面聚集减少,而BCP给药后可以增加MCAO后Glu A2在神经突触膜表面的聚集表达,该研究结果提示,BCP可以促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加。（4）应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现BCP给药后可以缓解急性缺血性脑卒中MCAO模型AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率增加影响LTP和LTD进程。3.β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）采用ELISA技术、Western Blot技术检测氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型、急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中及BCP给药后,与神经保护和学习记忆过程、CI-AMPARs转运密切相关的c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,发现BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（2）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22,分为Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加和抑制钙离子内流的作用,即BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜转运是PKA依赖形式的。（3）C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,免疫荧光双染共定位方法检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现,PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加,可以逆转BCP抑制MCAO模型中AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率,即BCP促进MCAO动物模型中CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程是PKA依赖形式的。（4）Western Blotting同时监测（2）和（3）的各组中c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,证实BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（5）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22分组:Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型发挥保护作用。（6）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。TTC染色检测各组小鼠脑梗死体积,H&E染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对MCAO动物模型神经功能损伤的保护作用。（7）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验、物体识别实验检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程改善急性缺血性脑卒中后认知学习记忆障碍。（8）收集30例临床急性缺血性脑卒中病人取栓治疗前后血清样本,ELISA法检测c AMP的浓度变化,结合病人临床病例资料分析统计c AMP的浓度变化与治疗前后缺血性脑卒中临床指征的关系,发现急性缺血性脑卒中病人取栓后c AMP浓度上调。研究结果表明:（1）明确了BCP具有保护急性缺血性脑卒中神经损伤及卒中后认知功能障碍的作用;（2）首次发现BCP具有促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运的作用;（3）发现BCP可通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运抑制神经元细胞钙离子内流,调节神经突触可塑性发挥保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用。本研究结果为进一步阐明BCP在保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用和分子机制奠定基础,为寻找急性缺血性脑卒中治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物提供了新思路。
牛灵芝[6]（2021）在《氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:白内障是全球首位致盲眼病,是眼科的常见病、多发病,直接影响着人们的生活质量。晶状体上皮细胞的凋亡是白内障发生发展的重要病理基础,因此研究晶状体上皮细胞的凋亡机制对于预防和治疗白内障具有重要意义。目前已有大量的研究表明,晶状体上皮细胞凋亡受多种通路的调节,而氧化应激和内质网应激在其中发挥着重要的作用[1,2]。氯离子是生物体内含量最丰富的阴离子,存在于全身各组织细胞中。电压门控氯离子通道（voltage-gated chloride channel,ClC）是氯离子通道家族中的一员,而ClC-3氯离子通道是其中一个亚型,其广泛分布于哺乳动物的组织器官和各种细胞中,在维持细胞的容积平衡,调节细胞电活动、细胞增殖、凋亡等多种生理、病理过程中发挥重要作用。有研究证实ClC-3参与晶状体上皮细胞的增殖和迁移,与后发性白内障的发生密切相关,但它在晶状体上皮细胞凋亡中的作用尚未完全阐明。本研究以人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）为研究对象,通过使用氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙氨基）-苯甲酸（5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid,NPPB）,探讨氯离子通道对HLECs凋亡的影响及作用机制。利用过氧化氢和光照建立HLECs的细胞凋亡模型,进一步研究ClC-3在HLECs凋亡中的作用及其机制,以期为白内障的防治提供新的理论基础。方法:1.氯离子通道对HLECs凋亡的影响及作用机制。我们用不同浓度的NPPB作用于HLECs,使用酶标仪通过CCK-8检测不同浓度NPPB对HLECs活性的影响,并选择合适的浓度进行后续实验。将适宜浓度的NPPB作用于HLECs,通过荧光染色检测线粒体膜电位（JC-1）、细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的荧光强度,应用Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及cleaved caspase 3表达水平的变化,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、PERK、p-PERK、caspase 12表达水平的变化,评估HLECs中内质网应激的发生。应用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）作用于NPPB诱导的HLECs,使用酶标仪通过CCK-8检测不同浓度NAC和4-PBA对HLECs活性的影响,并选择合适的浓度进行后续实验。分别使用适宜浓度的NAC和4-PBA与50μM NPPB共同作用,检测细胞内氧化应激、凋亡及内质网应激的变化。2.分别建立氧化应激损伤HLECs模型和光损伤HLECs模型,检测细胞内氧化应激、凋亡、内质网应激的发生及ClC-3表达的变化。分别将HLECs暴露于不同时长的1500勒克斯可见光及不同浓度、不同时间的过氧化氢中,使用酶标仪通过CCK-8检测过氧化氢和光照对HLECs活性的影响,并选择适宜的浓度和时间进行后续实验。将HLECs暴露于适宜的过氧化氢和光照中,通过荧光染色检测JC-1、ROS的荧光强度,应用Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及cleaved caspase 3表达水平的变化,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、PERK、p-PERK、caspase 12表达水平的变化,评估HLECs中内质网应激的发生。通过免疫荧光检测ClC-3在HLECs中的表达及定位;通过Western Blot法检测在过氧化氢和光照作用下ClC-3蛋白质水平表达的变化。3.建立ClC-3过表达HLECs,探讨ClC-3在HLECs氧化应激损伤和光损伤模型中的作用及机制。分别构建过表达ClC-3的过氧化氢损伤和光损伤HLECs模型。通过荧光确定慢病毒的感染效率,通过q-PCR法和Western Blot法验证HLECs中ClC-3的过表达。通过荧光染色检测JC-1、ROS荧光强度及Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达水平的改变,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过荧光染色对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、PERK、p-PERK,评估HLECs中内质网应激的发生。调查在HLECs的氧化应激损伤和光损伤模型中,ClC-3与氧化应激、内质网应激及线粒体凋亡的关系。结果:1.氯离子通道阻滞剂NPPB抑制了HLECs的活性,且呈浓度依赖性。50μM NPPB能降低HLECs线粒体膜电位,上调细胞凋亡相关蛋白BAX和cleaved caspase3的表达,下调Bcl-2的表达,提示NPPB可以诱导HLECs线粒体途径的凋亡。NPPB可以引起细胞内ROS和钙离子增加,上调内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、p-PERK、caspase 12的表达;使用ROS清除剂NAC和内质网应激抑制剂4-PBA均能降低NPPB诱导的HLECs凋亡、氧化应激和内质网应激,提示氯离子通道可能通过氧化应激、内质网应激途径保护HLECs。2.建立光损伤HLECs模型和氧化应激损伤HLECs模型。在1500勒克斯可见光的作用下HLECs的细胞活性随时间延长逐渐下降;过氧化氢对细胞的作用呈时间、浓度依赖性。200μM过氧化氢和1500勒克斯可见光分别作用于HLECs 24小时后可导致细胞线粒体膜电位下降,上调BAX和cleaved caspase 3的表达,下调Bcl-2的表达,引起细胞内ROS和钙离子增加,上调内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、p-PERK、caspase 12的表达,提示光损伤HLECs模型和氧化应激损伤HLECs模型均与氧化应激、内质网应激导致的线粒体凋亡有关。免疫荧光染色证实HLECs中存在ClC-3蛋白的表达,且ClC-3定位于内质网等细胞质中。检测200μM过氧化氢及1500勒克斯可见光对HLECs作用24小时、48小时、72小时后ClC-3蛋白质水平的表达,发现200μM过氧化氢和1500勒克斯可见光作用于HLECs 24小时和48小时ClC-3的表达上调,而72小时,ClC-3的表达下降,且低于正常水平,这提示ClC-3可能参与HLECs的氧化应激损伤和光损伤过程,并对HLECs起保护作用。3.使用含有ClC-3 c DNA的慢病毒感染HLECs,构建稳定过表达ClC-3的HLECs,通过q-PCR和Western Blot验证ClC-3过表达的稳定转染HLECs构建成功。在过氧化氢和光照诱导的损伤模型中,与感染空载体的HLECs相比,ClC-3过表达能减少细胞内ROS的产生、钙离子的聚集,抑制内质网应激途径中的p-PERK、ATF6、JNK的表达,降低caspase 3的活化,使cleaved caspase 3表达减少,从而减少细胞线粒体途径的凋亡,这提示ClC-3能通过减少过氧化氢和光照诱导的细胞内氧化应激和内质网应激,抑制HLECs线粒体途径的凋亡。结论:1.氯离子通道阻滞剂NPPB能促进HLECs氧化应激、内质网应激及线粒体途径凋亡的发生,氯离子通道对晶状体上皮细胞具有保护作用。2.过氧化氢损伤和光损伤可以促进HLECs中ROS的生成和内质网应激的发生,促进细胞的凋亡,我们成功构建了光损伤和氧化应激损伤HLECs模型。3.在HLECs中存在ClC-3的表达,并定位于内质网等细胞质中;在氧化应激损伤和光损伤HLECs模型中,ClC-3的表达发生变化。4.ClC-3可通过抑制过氧化氢和光照诱导的氧化应激、内质网应激,减少线粒体途径的细胞凋亡,ClC-3对晶状体上皮细胞具有保护作用。
徐雪松[7]（2021）在《GPR37经调控Kupffer细胞M2型极化诱导老龄鼠供肝免疫耐受的机制研究》文中指出背景肝移植是目前治疗各种终末期肝病的唯一有效的手段。然而,供肝来源的缺乏仍然是限制临床肝移植开展的重要因素。目前,随着人口老龄化日趋严重,肝移植供体的年龄呈现增高趋势,老龄供肝已经成为一种重要的供肝来源。虽然老龄供肝的应用获得了初步认可,但探讨老龄供肝的术后管理,尤其是免疫耐受的维持,仍是临床肝移植手术亟待解决的难题。库普弗细胞（Kupffer cells,KCs）是体内最大的巨噬细胞群,也是肝内主要的吞噬细胞,其吞噬凋亡细胞后,由M1型向M2型偏移是诱导肝移植免疫耐受形成的重要机制,并且与细胞内钙离子浓度变化有关,这提示,钙离子流动改变可能是连接胞葬作用和细胞极性偏移的关键桥梁。新近研究发现,GPR37能够正性调节吞噬细胞的胞葬作用,同时影响巨噬细胞内钙离子浓度,但以细胞实验为主,尚未涉及肝移植免疫耐受方面,具体机制仍需进一步研究。因此,深入研究GPR37介导的胞葬作用在KCs M2极化中的作用,明确KCs在吞噬凋亡细胞后引起自身细胞极性向M2型偏移的机制,对于诱导老龄供肝肝移植后免疫耐受的形成有着重要的临床意义。第一部分过表达GPR37对老龄鼠供肝肝移植免疫耐受微环境形成的作用目的:经门静脉转染CD68标记的腺相关病毒,观察过表达GPR37对老龄大鼠肝移植后肝脏急性排斥反应程度、凋亡细胞清除能力、肝内KCs M2型极化水平等免疫耐受微环境指标的影响。方法:（1）根据改良后的“双袖套法”,以雄性Lewis大鼠为供体、雄性BN大鼠为受体,建立大鼠肝移植急性排斥模型;（2）按照供肝情况,随机分为4组（n=30只/组）:对照组（Ctrl group）;老龄供肝组（Aged group）;老龄对照组（AAV-Ctrl group）;GPR37过表达组（AAV-OE group）;（3）各组随机选择10只大鼠,用于肝脏和血液标本收集;10只用于组织蛋白提取;10只用于KCs的分离、培养;（4）运用Western blot,检测各组肝组织内、KCs中GPR37的表达水平;（5）运用免疫组化染色,检测各组肝组织内GPR37的表达水平;（6）运用免疫荧光染色,检测各组KCs中GPR37的表达;（7）运用HE染色法,检测各组大鼠肝组织病理改变,并对肝移植后急性排斥反应进行评分;（8）运用全自动生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST水平,对各组大鼠肝功能改变进行评估;（9）运用TUNEL染色,检测各组大鼠肝组织内凋亡细胞数量,以评估肝组织凋亡细胞清除能力;（10）运用免疫组化检测各组大鼠肝组织内CD163、i NOS阳性的KCs数量,以评估各组肝组织内KCs极化状态;（11）运用ELISA、RT-PCR检测各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10的表达水平,以评估炎症因子分泌谱改变;（12）给予细胞松弛素D处理后,运用TUNEL染色、免疫组化染色,检测各组肝组织内凋亡细胞数量、CD163、i NOS阳性的KCs数量,以评估GPR37介导的凋亡清除对KCs M2型极化的影响。结果:（1）Western blot结果显示,较对照组相比,老龄供肝组肝组织内GPR37表达显着下降;老龄供肝组供肝KCs内GPR37表达显着下降;（2）免疫组化结果显示,较对照组相比,老龄供肝组肝组织内GPR37表达显着下降;（3）免疫荧光结果显示,较对照组相比,老龄供肝组供肝KCs内GPR37表达显着下降;（4）HE染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝急性排斥样改变显着改善,且RAI评分显着下降;（5）全自动生化仪检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组血清内ALT、AST水平显着下降;（6）TUNEL染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝内TUNEL阳性的细胞数量显着下降,提示凋亡细胞减少;（7）免疫组化结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组供肝内i NOS阳性的KCs数量显着下降、CD163阳性的KCs数量显着增加,提示KCs M2型极化程度升高;（8）ELISA、RT-PCR检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组血清中IL-6、TNF-α表达水平显着下降、IL-10表达水平显着增高;（9）给予细胞松弛素D处理后,TUNEL染色结果显示,老龄过表达组肝组织内TUNEL阳性的细胞数量显着增加;（10）给予细胞松弛素D处理后,免疫组化结果显示,老龄过表达组肝组织内i NOS阳性的KCs数量显着增加、CD163阳性的KCs数量显着下降。结论:（1）老龄大鼠供肝来源的KCs中GPR37表达显着降低;（2）过表达老龄大鼠来源的KCs中GPR37,改善了肝移植后急性排斥反应程度、减轻了肝移植后肝组织内细胞凋亡水平、促进了肝组织内KCs M2型极化;（3）GPR37过表达引起的凋亡细胞减少和KCs M2型极化升高与胞葬作用有关。第二部分过表达GPR37对老龄鼠供肝Kupffer细胞M2型极化的机制研究目的:建立KCs-凋亡细胞共培养体系,从体外实验水平,进一步探讨GPR37经胞葬作用的途径促进KCs M2型极化的具体机制。方法:（1）根据改良的“三步法”,即:Ⅳ型胶原酶消化、梯度离心、选择性贴壁的方法,分离、培养肝组织KCs;（2）按照KCs来源,分为4组（n=30只/组）:对照组（Ctrl group）;老龄供肝组（Aged group）;老龄对照组（AAV-Ctrl group）;GPR37过表达组（AAV-OE group）;（3）分离脾脏T淋巴细胞,并以H2O2处理,诱导T细胞凋亡,按照1:10的比例,建立KCs-凋亡细胞共培养体系;（4）运用Western blot,检测各组KCs中caspase3、c-casepase3、Bax、Bid、CD163、CD206、i NOS、CD86的表达水平;（5）运用免疫荧光染色,检测各组KCs中PKH26、F4/80的共定位情况,CD163、F4/80的共定位情况;（6）运用Fluo-4AM标记的钙离子探针,检测各组KCs中钙离子浓度;（7）运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;（8）给予IPI-549或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况;（9）给予GSK2141795或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况;（10）给予Stattic或DSMO处理后,运用Western blot检测各组KCs中PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT的表达水平;运用免疫荧光染色检测各组KCs中STAT3入核程度,CD163、F4/80共定位情况。结果:（1）Western blot结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组T细胞内c-casepase3、Bax、Bid表达显着下降;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组T细胞内c-casepase3、Bax、Bid表达显着增高;（2）免疫荧光结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内PKH26、F4/80共定位表达显着增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内PKH26、F4/80共定位表达显着下降;（3）Western blot结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内i NOS、CD86表达显着下降,CD206、CD163表达显着升高;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内i NOS、CD86表达显着升高,CD206、CD163表达显着下降;（4）免疫荧光结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内CD163、F4/80共定位表达显着增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内CD163、F4/80共定位表达显着下降;（5）Fluo-4AM染色结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内钙离子浓度显着增加;在阻断胞葬作用后,老龄过表达组KCs内钙离子浓度显着下降;（6）Western blot检测结果显示,较老龄供肝组相比,老龄过表达组KCs内PI3K、p-AKT、p-STAT的表达显着增加;在BAPTA-AM阻断钙离子流动后,老龄过表达组KCs内PI3K、p-AKT、p-STAT的表达显着下降;（7）Western blot检测结果显示,抑制PI3K活性后,老龄过表达组KCs内p-AKT、p-STAT的表达显着下降;免疫荧光结果显示,抑制PI3K表达后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降;（8）Western blot检测结果显示,抑制AKT磷酸化后,老龄过表达组KCs内p-AKT、p-STAT的表达显着下降;免疫荧光结果显示,抑制AKT磷酸化后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降;（9）Western blot检测结果显示,抑制p-STAT3磷酸化后,老龄过表达组KCs内p-STAT的表达显着下降;免疫荧光结果显示,抑制p-STAT3磷酸化后,老龄过表达组KCs内STAT3入核程度下降,CD163、F4/80共定位程度下降。结论:（1）GPR37介导的KCs胞葬功能增强是其发挥凋亡清除作用所必需的,并且有利于M2型极化的增加;（2）钙依赖性的PI3K-AKT-STAT3信号通路在吞噬过程中表现出活性增强,进而促进了KCs M2极化。
王钊[8]（2021）在《多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究》文中认为研究背景:神经型布鲁杆菌病是布鲁杆菌病的一种危及生命的并发症。由于布鲁杆菌在小胶质细胞内质网（Endoplasmic Reticulum,ER）中复制、增殖,进而引起患者持续的慢性感染。布鲁杆菌可通过抑制小胶质细胞内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）,进一步抑制其ER相关凋亡。那么,诱导布鲁杆菌感染的小胶质细胞凋亡则会限制细菌在胞内存活。多西环素（Doxycycline,Dox）可以通过触发ERS诱导细胞凋亡,但其潜在机制未知。目的:先用布鲁杆菌S2株侵染人小胶质细胞克隆3（Human Microglia Clone 3,HMC3）,以明确布鲁杆菌S2株抑制HMC3细胞凋亡的机制。在此基础上,通过多西环素干预布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞,进一步阐明多西环素诱导感染的HMC3细胞凋亡机制,以期寻找神经型布鲁杆菌病药物治疗的新靶点。方法:首先,我们用不同MOI的布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞不同时间,通过Western Blot测定细胞p-IRE1,p-JNK,cleaved Caspase-12,p-p53与cleaved Caspase-3蛋白水平;用RT-q PCR测定IRE1,JNK,Caspase-12,p53与Caspase-3 m RNA表达;采用流式细胞术测定并分析细胞凋亡水平。在此基础上,我们用泛素化修饰蛋白质组学技术筛选出泛素化修饰降低的蛋白——钙网蛋白（Calreticulin,CALR）。接下来,我们通过慢病毒转染技术成功构建了CALR过表达细胞株HMC3-CALR和CALR敲减细胞株HMC3-sh-CALR。然后,我们用布鲁杆菌S2株分别侵染各组细胞,采用Western Blot法与RT-q PCR法分别对CALR,IRE1/Caspase-3及JNK/p53信号通路关键蛋白与m RNA进行测定;通过ER染色观察各组细胞ER;用细胞免疫荧光技术检测p-JNK蛋白核转运;通过流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。最后,我们用上述同样的方法研究了多西环素对布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞CALR,IRE1/Caspase-3及JNK/p53信号通路的作用。结果:（1）MOI为50的布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞2 h能降低细胞p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,亦能抑制IRE1,Caspase-12,Caspase-3,JNK与p53 m RNA表达,但使CALR蛋白与m RNA水平均增加,同时降低HMC3细胞凋亡率。（2）CALR能降低p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,抑制p-JNK蛋白核转运,进而降低HMC3细胞凋亡率。（3）布鲁杆菌S2株通过增加CALR蛋白与m RNA水平,进一步降低各细胞株p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-9,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,亦抑制IRE1,Caspase-12,Caspase-9,Caspase-3,JNK与p53m RNA表达及p-JNK蛋白核转运,进而降低HMC3细胞凋亡率。（4）多西环素干预布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞之结果均与布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞的结果相反,且多西环素均能促进布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞ER损伤,增加细胞内钙离子含量,使HMC3细胞凋亡率增加。结论:（1）CALR通过抑制p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK及p-p53蛋白水平,减轻HMC3细胞ERS,抑制HMC3细胞凋亡。（2）布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平,抑制JNK/p53及IRE1/Caspase-3信号通路,减轻细胞ERS,抑制HMC3细胞凋亡。（3）多西环素通过降低CALR水平,活化JNK/p53及IRE1/Caspase-3信号通路,激活细胞ERS,诱导布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞凋亡。（4）CALR,JNK/p53与IRE1/Caspase-3信号通路可作为神经型布鲁杆菌病药物治疗的候选靶点。
李承博[9]（2021）在《肝素磁性纳米粒对于急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率影响的研究》文中认为目的:肝肾综合征（HRS）是在肝衰竭基础上出现的功能性肾衰竭,是晚期肝病较为常见的严重并发症之一,重症肝炎、肝硬化者合并HRS的一般预后极差,病死率高达约70%。尽管临床上对已发生HRS的病人积极地采取扩容、收缩血管等治疗措施,但绝大部分病人肾功能仍然无法改善[1]。肝硬化的患者HRS的发展预示着预后差,如不进行肝移植,通常肾功能衰竭进行性加重,导致死亡[2]。目前认为,HRS是肾脏循环体系中血管收缩系统被激活的结果[3]。RASMCs的功能状态直接影响肾入球小动脉的舒缩。细胞胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高与肾小球系膜细胞（GMCs,glomerular mesangial cells）及大鼠动脉平滑肌细胞（Rat arterial smooth muscle cells,RASMCs）收缩密切相关。严重肝损伤发生时,患者体内收缩血管的活性物质明显增加[4,5]。这些物质具有能够引起许多组织细胞内三磷酸肌醇（IP3）增加,与IP3Rs结合,使细胞内钙释放,进而导致肾动脉平滑肌细胞、肾小球系膜细胞收缩。通过阻断剂可以抑制上述反应,而肝素是一种易于获得的,价格低廉的临床常用药物,它能够竞争性地阻断IP3诱发的钙离子释放[6,7],但是肝素也存在诸多的不良反应,出血,多由过量所致。其膜通透性较差,需要较大的用量方能起到治疗作用,因此限制了其在相关方面的临床应用。如果能够通过药物载体将肝素仅仅作用于靶向部位,减少不良反应,则可为临床上能够开展靶向治疗肝肾综合征提供可能。四氧化三铁纳米粒子是一种价格低廉的纳米粒,化学性质比较稳定,由于毒性很小、可进行表面包被,是目前应用最广泛的磁性纳米材料[8,9]。研究发现,肝素可以与经过表面修饰的表面含有氨基及羧基的纳米粒子相连接[10-12]。Kyoung Ah Min等人发现通过将甘氨酸吸附于磁性纳米粒表面,然后通过聚合甘氨酸与肝素的电荷吸附反应将肝素吸附于纳米粒子上,在磁场的作用下,其通过细胞膜及聚酯膜的能力增加了100倍。[13]如果能通过载药系统,靶向的将肝素转运至肾脏,并能改善其膜通透性,使得其更容易进入细胞内,阻断IP3Rs诱发的钙离子释放,抑制血管收缩,则可减少肝素用量,增加疗效,减少副作用的发生,增加耐受性又可以达到阻断肝衰竭大鼠TNFα诱导的IP3Rs表达通路,从而对肝肾综合征起到治疗效果。材料与方法:1、材料1)实验对象大鼠肾小球系膜细胞（RGMC,HBZY-1）,为CCTCC,中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection）获取。SPF级别雄性SD大鼠,体重140 g±5 g,购自辽宁长生生物技术有限公司,动物合格证号:SCXK（辽）-2015-0001。2)主要试剂DMEM高糖培养液、标准胎牛血清,Hyclone公司;Alzet-mini-Osmotic pumps Model 2001,Durect公司;再生纤维素透析袋MWCO1000,联合碳化公司;HEPES,Solarbio公司;一次性水系针头过滤器,sartorius公司;免疫沉淀试剂盒,Millipore公司;羧基化Fe3O4磁性纳米粒试剂盒,美国Ocean Nano Tech公司;肝素,上海麦克莱公司（Shanghai Macklin Biochemical Co.LTD）;肝素抗II因子活性检测试剂盒,法国HYPHEN Bio Med,MTS试剂盒,promega公司;琼脂糖,sunshine Bio公司;Trizol试剂,Invitrogen公司;D-Gal N（D氨基半乳糖）、LPS（脂多糖）、FITC标记菊粉（FITC-Inulin）、DMSO,Sigma公司;Real-time PCR引物合成,Takara公司;逆转录试剂盒Ex Script TM RT Reagent Kit、PCR试剂盒SYBR（?）premix EX Taq TM（Ta Ka Ra）,Takara公司;OCT冷冻切片标本包埋剂,SAKURA公司;Fura-2AM,苏木素伊红染色试剂盒,Beyotime公司;大鼠ET-1,上海丰寿实业有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒,Pierce公司;Enhanced chemiluminescence（ECL）试剂盒,IP3R1抗体,Cell Signaling Technology公司;兔抗人β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购至Santa Cruz公司;Pierce公司。2、方法1)羧基化Fe3O4磁性纳米粒与肝素根据EDC/NSH催化反应方案完成载药反应,1%琼脂糖凝胶电泳比较反应前后载药纳米粒电泳情况。2)TEM观察载药前后纳米粒形态委托青岛科标技术研发中心。3)载药前后磁性纳米粒红外光谱（FTIR）委托上海微谱化工技术服务有限公司检测。4)通过抗II因子活性法测间接测定肝素纳米粒载药率。5)MTS法研究磁性纳米粒及载药纳米粒对HBZY-1细胞增殖率的影响。6)经细胞与普通纳米粒,肝素纳米粒共培养,通过检测细胞内铁含量明确纳米粒入胞效率。7)应用western blot研究载药纳米粒对HBZY-1中IP3R1蛋白的表达影响。8)应用realtime PCR检测载药纳米粒作用后HBZY-1中IP3R1 mRNA情况。9)通过细胞内钙测定研究载药纳米粒对HBZY-1内Ca2+释放的影响。10)构建急性肝衰竭肾损伤动物模型:给药造模前5天将含有FITC-Inulin的微渗透泵植入大鼠腹腔,每侧一枚,并于肾区皮下植入汝铁硼永磁铁（1.1T）。5天后体重恢复的大鼠进行肝衰竭造模（生理组除外）,造模剂量D-Gal N 800 mg/kg+LPS32μg/kg,给药体积均为5 ml/kg。随即将大鼠随机分5组,每组10支,并按不同分组尾静脉给药,死亡大鼠无法采血,仅仅计算死亡时间。11)HE染色法染色肝脏组织及肾组织,光镜下观察肝病理改变;观察肾脏组织结是否发生结构性改变,证明肝衰竭及功能性肾衰竭存在。12)检测血清肌酐（Cr）,丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、钾离子（K+）、钠离子（Na+）及氯离子（Cl-）。13)应用荧光酶标仪检测血清荧光强度,根据公式GFR=R/[Iss][16]计算GFR,GFR1(ml·min-1);GFR2=GFR1/BW（BW为大鼠体重kg）;GFR3 ml·min-1·g KBW-1,GFR3=GFR1/KW（KW为大鼠双肾重量g）,观察Hep-MNP,肝素等药物对急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率的影响。14)提取肾小球,通过肾小球菊粉容积测量（GIS）方法,测量ET-1作用前后肾小球容积变化（GIS1/GIS2）,间接反映肾小球血管收缩情况。15)提取肾小球,通过肾小球内钙测定,检测ET-1作用前后肾小球内钙水平,通过肾小球内钙升高倍数反映肾小球内钙释放情况。16)Western blot、Real-time PCR方法检测各组大鼠肾小球IP3R1蛋白及其mRNA的表达情况。结果:1、羧基化磁性纳米粒（Fe3O4-COOH,MNP）与肝素通过EDC/NHS催化反应:反应产物Hep-MNP与MNP相比,琼脂糖凝胶电泳均可见明显拖尾,0.5小时后距离明显。反应产物放于磁力架中分离,24小时后可见通过磁性分离作用可以实现Heparin-MNP与上清液的分离。2、通过TEM观察载药前后纳米粒形态结构:MNP直径约15 nm,分散分布,无明显凝聚现象,Hep-MNP直径约为15～18 nm,分散分布,分布情况较MNP有改变,凝聚情况不明显。3、FTIR方法验证反应产物:与MNP的FTIR谱图相比,Hep-MNP的FTIR谱图出现了肝素的部分特征峰。4、磁性纳米粒的载药率:载药反应产物MNP与肝素比值约为每毫克载药能力约8.02单位,抗凝活性每毫克纳米粒的抗凝作用于3.08单位肝素抗凝作用相当。5、MTS法进行Hep-MNP及肝素（几种浓度肝素）,MNP对HBZY-1细胞增殖率影响的研究:与生理盐水对照组相比Hep-MNP,MNP 1单位每毫升,5单位每毫升两个剂量组HBZY-1细胞增殖活性均无明显降低（P>0.05）。6、经过对于对细胞内铁含量的测定发现肝素包被可以加快纳米粒入胞速度,磁场可以加速MNP及Hep-MNP。7、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞IP3R1蛋白表达的影响:Hep-MNP、肝素及MNP组IP3R1蛋白表达水平与NS+TNF组比较无明显差异（P>0.05）,较生理盐水组明显升高（P<0.01）。8、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞IP3R1 mRNA表达的影响:Hep-MNP、肝素及MNP组IP3R1 mRNA水平与NS+TNF组比较无明显差异（P>0.05）,较生理盐水组明显升高（P<0.01）。9、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞内钙离子释放的影响:肝素及Hep-MNP能够抑制细胞内钙离子的释放（P<0.05）。而MNP与对照组无差别（P>0.05）。10、各组死亡率差别无统计学意义。11、肝脏及肾脏形态学及组织病理检查结果:D-Gal N/LPS联合给药造模后12h肝脏明显充血肿大,呈暗红色或蓝紫色龟裂花斑样,可见弥漫出血点,肝叶粘连,切面有暗红色淤血溢出,质地极脆,易碎,部分切开包膜后无法保持自身形态。各实验分组大鼠的肾脏略增大,色泽细腻红润,表面光滑,质地软。肾体积增大,光镜下观察肾结构未见明显异常。12、血清生化学指标检测结果:血清生化检测结果显示,G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组及G/L+Hep-MNP组在造模12h后,ALT、AST与生理组比较明显升高（P<0.05）,G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin组、G/L+Hep-MNP组Cr较生理组升高（P<0.05）,其中G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组降低（P<0.05）。G/L+MNP组Cr值与NS组相比无明显差异（P>0.05）,各组之间K+,Na+,Cl-未见明显统计学差异（P>0.05）。13、各组大鼠GFR:G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组及G/L+Hep-MNP组较生理组显着降低（P<0.05）;G/L+Hep-MNP组及G/L+heparin素组GFR1、GFR2、GFR3有改善（P<0.05）,相比G/L+heparin组有所改善,但无统计学意义（P>0.05（0.10））。14、比较各组ET-1刺激后肾小球内钙浓度升高倍数比,反应血管活性物质作用后肾小球细胞内该释放:G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组较生理组显着肾小球内钙浓度较基线升高倍数比与生理组（1.34±0.126）相比明显升高（2.41±0.55,P<0.05;2.11±0.44,P<0.05,1.82±0.58,P<0.05）,G/L+Hep-MNP组与生理组相比变化不大（1.44±0.18,P>0.05）,G/L+Heparin组及G/L+Hep-MNP组较G/L+NS组及G/L+MNP组肾小球内钙浓度升高倍数比明显降低（P<0.05）。Hep-MNP组较肝素组相比改善更明显（P<0.05）。15、比较各组ET-1作用后及作用前GIS变化（GIS2/GIS1）间接反映肾小球血管收缩/舒张情况:NS组及MNP组GIS变化与生理组相比明显升高（P<0.05）,G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组GIS变化较G/L+MNP组及NS组明显降低（P<0.05）,G/L+MNP与G/L+NS组比较没有明显差异（P>0.05）。G/L+heparin组与G/L+Hep-MNP组对比没有差异（P>0.05）。16、G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组IP3R1mRNA表达比生理组明显升高（2.31±0.14,P<0.05;2.24±0.10,P<0.05）。4组比较无明显差异（P>0.05）。17、G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin及G/L+Hep-MNP组IP3R1蛋白表达比生理组明显升高(P<0.05=。各组间没有明显差异（P>0.05）。结论:1、可以通过EDC/NHS催化反应成功构建磁性纳米粒载药体系,载药纳米粒无明显细胞毒性及抑制细胞增殖作用,且增强膜通透能力;2、Hep-MNP中每毫克纳米粒可以携带约8单位肝素,抗凝活性相当于每毫克纳米粒3单位肝素水平。对于IP3R1 mRNA及蛋白表达无明显影响,但是可以影响钙离子释放,降低细胞内钙浓度;3、急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率较生理盐水组明显降低,肌酐明显升高,而Hep-MNP及肝素可以明显改善急性肝衰竭大鼠的GFR及肌酐水平。
赵欣楠[10]（2021）在《羟氯喹对抗核糖体P蛋白抗体引起神经细胞损伤的影响及其机制研究》文中研究说明系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种以发热、面部蝶形红斑等为主要临床表现的慢性自身免疫性疾病,可累及多种组织和器官,其中神经系统受累被称为神经精神性狼疮（neuropsychiatric SLE,NPSLE）,是SLE预后不良的重要原因之一。目前,NPSLE的病因和发病机制尚不十分明确,且治疗效果有限。因此,探究NPSLE的发病机制,寻找有效的治疗方法是风湿病学面临的重要课题。SLE患者血清中存在的抗核糖体P蛋白（anti-ribosomal P,Anti-P）抗体目前被认为与NPSLE密切相关。Anti-P抗体可以与神经元和小鼠神经母细胞瘤（neuroblastoma-2a,N2a）细胞表面的神经元表面P抗原（neuronal surface P antigen,NSPA）结合,继而引起细胞内钙离子浓度升高,诱发细胞凋亡。但Anti-P抗体对神经细胞其他功能损伤的相关报道较少,且Anti-P抗体引起细胞内钙离子浓度升高的途径也不明确。羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）是一种抗疟药,在临床中已经广泛的应用于SLE的治疗,但HCQ对NPSLE的预防和治疗作用尚不明确。本研究通过体外实验揭示了Anti-P抗体对神经细胞的损伤作用以及HCQ是否可以缓解Anti-P抗体造成的损伤,同时也对HCQ缓解神经损伤可能存在的作用机制进行了初步的探讨。此外,鉴于N2a细胞具有神经细胞的特征,且细胞系成分均一,本研究采用N2a细胞系作为神经元的体外研究对象。具体研究内容分为以下几部分:第一部分抗核糖体P蛋白抗体与N2a细胞结合对细胞功能及活性的影响目的:明确Anti-P抗体对N2a神经细胞的损伤作用方法:应用100μg/mL的Anti-P IgG和健康对照者的血清IgG分别刺激N2a细胞,进行免疫荧光染色,在含钙及不含钙的细胞外液环境下分别应用共聚焦显微镜进行钙离子成像检测细胞内钙离子浓度,试剂盒检测ATP的释放水平;应用100μg/mL和200μg/mL的Anti-P IgG和健康对照者的血清IgG分别刺激N2a细胞,CCK-8实验和台盼蓝染色分别检测N2a细胞的活性和增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.Anti-P IgG与N2a细胞在细胞膜上特异性结合。2.Anti-P IgG升高N2a细胞内的钙离子水平。3.Anti-P IgG可以增加细胞内的钙库释放,并促进细胞外的钙离子内流。4.Anti-P IgG促进N2a细胞释放ATP。5.Anti-P IgG降低N2a细胞的增殖能力和活性。6.Anti-P IgG促进N2a细胞凋亡。结论:Anti-P抗体可以和N2a细胞特异性结合,二者的结合通过促进细胞内钙释放及细胞外钙内流增加细胞内Ca2+浓度,促进细胞释放ATP,诱导N2a细胞损伤。提示Anti-P抗体可以损伤神经细胞功能,具有神经毒性。第二部分:硫酸羟氯喹对Anti-P IgG引起N2a细胞损伤的保护作用目的:探究羟氯喹对Anti-P IgG引起N2a细胞损伤是否有缓解作用。方法:应用不同浓度（5、10、15、20μg/mL）的HCQ分别处理细胞,CCK-8实验及台盼蓝染色检测细胞活性及增殖能力;应用200μg/mL的Anti-P IgG、健康对照者的血清IgG以及同时应用5/10μg/mL HCQ和200μg/mL Anti-P IgG分别刺激N2a细胞,钙离子成像检测细胞内钙离子浓度,试剂盒检测ATP的释放水平,CCK-8实验和台盼蓝染色检测细胞活性和增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.HCQ在一定浓度范围内对N2a细胞不具有细胞毒性。2.HCQ抑制Anti-P IgG引起的N2a细胞内钙信号增强。3.HCQ抑制Anti-P IgG引起的N2a细胞ATP释放增多。4.HCQ缓解Anti-P IgG对N2a细胞增殖能力和活性的抑制作用。5.HCQ减少Anti-P IgG引起的N2a细胞凋亡。结论:一定浓度的HCQ可以缓解Anti-P抗体引起的N2a细胞内钙离子增多以及细胞释放ATP增多,进而减轻Anti-P抗体造成的N2a细胞损伤。提示HCQ可能存在神经保护作用。第三部分:HCQ对N2a细胞保护作用的机制研究目的:探讨HCQ对N2a细胞发挥保护作用的机制。方法:健康对照者IgG、Anti-P IgG、HCQ联合Anti-P IgG分别处理N2a细胞,Western Blot检测凋亡相关蛋白（Bax、caspase-3、Bcl-2）的表达情况;HCQ和无血清培养液分别预处理N2a细胞后于无钙细胞外液环境下加入Anti-P IgG,然后EDTA螯合钙离子后于细胞外液中加入Ca Cl2溶液,持续监测细胞内钙离子浓度变化;健康对照者IgG、Anti-P IgG、HCQ联合Anti-P IgG分别处理N2a细胞,Western Blot检测1,4,5-三磷酸肌醇受体（inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R）的表达情况,免疫荧光染色和免疫共沉淀实验检测Bcl-2与IP3R的结合情况;分别用HCQ联合Anti-P IgG、Venetoclax联合HCQ以及Anti-P IgG处理N2a细胞,流式细胞术检测细胞内钙离子浓度,CCK-8实验检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.HCQ可以调节凋亡蛋白的表达。2.HCQ减少Anti-P IgG引起的细胞内钙离子释放,不影响细胞外钙离子内流。3.HCQ不影响IP3R的表达。4.HCQ增加Bcl-2与IP3R的结合。5.抑制Bcl-2表达逆转HCQ对钙信号的影响及其神经保护作用。结论:HCQ可以调节N2a细胞内的凋亡通路蛋白,通过增加Bcl-2与IP3R的结合来缓解Anti-P抗体引起N2a细胞内钙信号强,从而发挥其神经保护作用。
二、细胞内钙离子分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞内钙离子分析（论文提纲范文）
（1）多巴胺在肝纤维化发生发展机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 综述 神经递质在消化系统疾病中的病理生理作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）细胞间隙连接通道的传输行为研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 国外研究现状 |
| 1.2.2 国内研究现状 |
| 1.2.3 总结 |
| 1.3 论文主要研究内容与结构安排 |
| 1.3.1 论文主要研究内容 |
| 1.3.2 论文结构安排 |
| 第2章 分子通信与间隙连接的基础理论 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 分子通信 |
| 2.2.1 分子通信的定义及特征 |
| 2.2.2 分子通信与传统通信的对比 |
| 2.2.3 分子通信的应用 |
| 2.3 间隙连接 |
| 2.3.1 间隙连接蛋白结构及分布 |
| 2.3.2 间隙连接通道属性 |
| 2.3.3 间隙连接通信行为 |
| 2.3.4 间隙连接通信与疾病 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于钙信号的间隙连接代谢耦联行为 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 钙信号传导模型 |
| 3.2.1 钙信号发送过程 |
| 3.2.2 钙信号传输过程 |
| 3.2.3 钙信号接收过程 |
| 3.3 间隙连接代谢耦联模型设计 |
| 3.4 仿真结果与分析 |
| 3.4.1 发送结果 |
| 3.4.2 传输结果 |
| 3.4.3 接收结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 间隙连接介导的过滤机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 过滤机制的生物过程与物理模型 |
| 4.3 过滤机制设计方案 |
| 4.4 仿真结果与分析 |
| 4.5 过滤机制的应用 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 基于动作电位的间隙连接电耦联行为 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 消极刺激下间隙连接电耦联模型 |
| 5.2.1 动作电位模型 |
| 5.2.2 消极刺激下间隙连接模型设计 |
| 5.2.3 信道容量模型 |
| 5.3 仿真结果与分析 |
| 5.4 实验验证 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）乙醇诱导的肝肿瘤细胞H4-ⅡE发生内质网应激及细胞凋亡中钙离子浓度的变化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂及药物 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 MTT法检测细胞生存率 |
| 3.2 Fluo-3AM法检测细胞内钙离子浓度变化 |
| 3.3 Western-blot法检测细胞内Caspase-3、Caspase-7、Caspase-12 表达情况 |
| 3.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活性 |
| 4.2 细胞内钙离子变化与内质网应激的关系 |
| 4.3 Caspase家族与内质网应激 |
| 4.4 流式细胞术检测内质网应激对细胞凋亡的影响 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述:内质网应激在酒精性肝病诱导的细胞凋亡中的作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）高钙诱导的心脏电交替及其致心律失常作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验使用的溶液配方与试剂 |
| 2.1.1 药品与试剂 |
| 2.1.2 溶液配方 |
| 2.2 伦理学批准 |
| 2.3 新西兰大白兔左心室中层心室肌细胞的急性分离与收集 |
| 2.4 肌细胞动作电位与离子通道电流的记录方法 |
| 2.4.1 动作电位的记录 |
| 2.4.2 L-型钙电流的记录 |
| 2.5 左心室中层肌细胞钙瞬变的记录方法 |
| 2.6 中层心室肌细胞肌小节收缩的测量 |
| 2.7 离体心脏器官水平生物电记录方法 |
| 2.8 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.8.1 左心室中层心肌组织准备工作 |
| 2.8.2 左心室中层心肌组织总蛋白提取与蛋白定量 |
| 2.8.3 左心室中层心肌组织PKCα蛋白表达水平 |
| 2.9 实验数据的统计与分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 钙循环失调与高钙诱导的左心室中层肌细胞交替的关系 |
| 3.1.1 0.1%Ethanol和 0.1%DMSO对 APD的影响作用 |
| 3.1.2 左心室中层肌细胞内高钙对动作电位时程的影响 |
| 3.1.3 I_(CaL)抑制剂硝苯地平抑制胞内高钙诱导的动作电位时程交替 |
| 3.1.4 左心室中层肌细胞中胞内高钙对L-型钙电流变化的影响 |
| 3.1.5 钙螯合剂BAPTA-AM抑制胞内高钙诱导的动作电位时程交替 |
| 3.1.6 左心室肌中层细胞高钙可以诱导出胞内钙瞬变交替 |
| 3.1.7 高钙可以诱导出左心室中层肌细胞肌小节收缩幅度交替变化 |
| 3.2 调节PKC活性对与钙循环障碍相关的心脏交替的作用 |
| 3.2.1 PKC抑制剂对心室肌细胞高钙诱导的动作电位时程交替的影响 |
| 3.2.2 PKC激动剂PMA对动作电位时程的影响 |
| 3.2.3 PKC抑制剂BIM对高钙诱导的胞内钙瞬变交替的作用 |
| 3.2.4 离体心脏水平BIM对高钙诱导T波交替和室性心律失常的作用 |
| 3.2.5 BIM降低高钙处理的离体心脏中左心室肌组织PKCα的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 综述 心脏电交替及其诱发心律失常的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
（5）β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 AMPARs转运调节与突触可塑性之间的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（6）氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 细胞凋亡 |
| 1.1.2 氧化应激 |
| 1.1.3 内质网应激 |
| 1.1.4 氧化应激与内质网应激的关系 |
| 1.2 CLC-3 在细胞中的作用 |
| 1.2.1 C1C-3 在细胞凋亡中的作用机制 |
| 1.2.2 C1C-3 在细胞增殖中的作用机制 |
| 1.2.3 C1C-3 在细胞迁移和侵袭中的作用机制 |
| 1.3 总结 |
| 第2章 NPPB对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 晶状体上皮细胞的常规培养、传代、冻存及计数 |
| 2.2.2 CCK-8 检测细胞存活率 |
| 2.2.3 ROS的测定 |
| 2.2.4 线粒体膜电位检测(JC-1)法检测细胞早期凋亡 |
| 2.2.5 细胞内钙离子的测定 |
| 2.2.6 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 NPPB对 HLECs活性的影响 |
| 2.3.2 NPPB对 HLECs凋亡的影响 |
| 2.3.3 NPPB对 HLECs内 ROS含量的影响 |
| 2.3.4 NPPB对 HLECs内质网应激的影响 |
| 2.3.5 NAC和4-PBA对 NPPB诱导的HLECs凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 氧化应激损伤及光损伤对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8 检测细胞存活率 |
| 3.2.2 ROS的测定 |
| 3.2.3 JC-1 检测细胞早期凋亡 |
| 3.2.4 细胞内钙离子的测定 |
| 3.2.5 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 3.2.6 细胞的免疫荧光 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 氧化应激损伤和光损伤对HLECs活性的影响 |
| 3.3.2 氧化应激损伤和光损伤对HLECs凋亡的影响 |
| 3.3.3 氧化应激损伤和光损伤对HLECs内 ROS含量的影响 |
| 3.3.4 氧化应激损伤和光损伤对HLECs内质网应激的影响 |
| 3.3.5 ClC-3在HLECs 中的定位及氧化应激损伤和光损伤对HLECs 中 ClC-3 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 CLC-3 过表达对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 验仪器 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒介导的ClC-3 过表达HLECs的构建及验证 |
| 4.2.2 ROS的测定 |
| 4.2.3 JC-1 法检测细胞早期凋亡 |
| 4.2.4 细胞内钙离子的测定 |
| 4.2.5 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 4.2.6 引物设计、提取RNA样本、测定RNA浓度、RNA逆转录及q-PCR法检测细胞内ClC-3 m RNA的表达 |
| 4.2.7 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 慢病毒感染HLECs最适浓度的测定及转染效率的验证 |
| 4.3.2 氧化应激损伤和光损伤对ClC-3 过表达HLECs稳定转染细胞凋亡的影响 |
| 4.3.3 氧化应激损伤和光损伤对ClC-3 过表达HLECs内 ROS含量的影响 |
| 4.3.4 氧化应激损伤和光损伤对 ClC-3 过表达 HLECs 内质网应激的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）GPR37经调控Kupffer细胞M2型极化诱导老龄鼠供肝免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 过表达GPR37对老龄大鼠供肝肝移植免疫耐受微环境形成的作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 过表达GPR37 对老龄鼠供肝Kupffer细胞M2 型极化的机制研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胞葬作用介导的死亡细胞清除在肝脏炎症性疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 参与的科研项目 |
（8）多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞后内质网相关泛素化蛋白筛选 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.STR基因型检测证实细胞为HMC3细胞 |
| 2.柯兹洛夫斯基染色证实菌株为布鲁杆菌 |
| 3.布鲁杆菌S2株对p-IRE1,cleaved Caspase-12及cleaved Caspase-3蛋白水平的影响 |
| 4.布鲁杆菌S2株对IRE1,Caspase-12及Caspase-3 mRNA表达水平的影响 |
| 5.布鲁杆菌S2株对HMC3细胞ER的影响 |
| 6.布鲁杆菌S2株影响p-JNK与p-p53蛋白水平 |
| 7.布鲁杆菌S2株影响JNK与p53 mRNA表达水平 |
| 8.布鲁杆菌S2株对HMC3细胞凋亡的影响 |
| 9.泛素化修饰鉴定总览 |
| 10.差异泛素化修饰蛋白的GO注释分类 |
| 11.差异泛素化修饰蛋白的亚细胞定位分类 |
| 12.差异泛素化修饰蛋白的COG/KOG功能分类 |
| 13.差异泛素化修饰蛋白的GO功能富集分析 |
| 14.差异泛素化修饰蛋白的KEGG通路富集分析 |
| 15.CALR泛素化修饰下调及验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制HMC3细胞凋亡 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.过表达及干扰载体图谱 |
| 2.各HMC3细胞株CALR蛋白及mRNA表达验证 |
| 3.CALR抑制p-IRE1,cleaved Caspase-12及cleaved Caspase-3蛋白水平 |
| 4.CALR维持ER结构及细胞内钙离子含量稳定 |
| 5.CALR抑制p-JNK与p-p53蛋白水平 |
| 6.CALR抑制p-JNK蛋白核转运 |
| 7.CALR抑制HMC3细胞凋亡 |
| 8.布鲁杆菌S2株增加HMC3细胞CALR水平 |
| 9.布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 10.布鲁杆菌S2株抑制IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 11.布鲁杆菌S2株对ER及细胞内钙离子含量的影响 |
| 12.布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制JNK/p53 信号通路 |
| 13.布鲁杆菌S2株抑制ASK1,MEK4,JNK及 p53 mRNA表达 |
| 14.布鲁杆菌S2株抑制p-JNK蛋白核转运 |
| 15.布鲁杆菌S2株抑制HMC3细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 多西环素通过降低CALR水平诱导布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞凋亡 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.多西环素对HMC3细胞CALR水平的影响 |
| 2.多西环素对HMC3细胞存活率及凋亡的影响 |
| 3.多西环素降低HMC3细胞CALR水平 |
| 4.多西环素通过降低CALR水平激活IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 5.多西环素促进IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 6.多西环素损伤HMC3细胞ER并增加细胞内钙离子含量 |
| 7.多西环素通过降低CALR水平激活JNK/p53信号通路 |
| 8.多西环素促进ASK1,MEK4,JNK及 p53 mRNA表达 |
| 9.多西环素促进HMC3细胞p-JNK蛋白核转运 |
| 10.多西环素诱导HMC3细胞凋亡 |
| 11.多西环素降低布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞CALR水平 |
| 12.多西环素激活布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 13.多西环素促进感染细胞IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 14.多西环素损伤感染细胞的ER并增加细胞内钙离子含量 |
| 15.多西环素激活布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞JNK/p53信号通路 |
| 16.多西环素促进感染细胞ASK1,MEK4,JNK及p53 mRNA表达 |
| 17.多西环素促进布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞p-JNK蛋白核转运 |
| 18.多西环素促进布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 内质网应激介导的小胶质细胞凋亡在中枢神经系统炎症中的作用 |
| 1.小胶质细胞 |
| 1.1 小胶质细胞功能 |
| 1.2 小胶质细胞促炎信号 |
| 1.3 Caspases家族介导的凋亡与小胶质细胞活化 |
| 2.ER与ERS |
| 2.1 ER及其功能 |
| 2.2 ERS及其信号转导 |
| 3.小胶质细胞ERS凋亡与CNS炎症 |
| 3.1 神经退行性疾病相关的认知障碍 |
| 3.2 创伤性脑损伤 |
| 3.3 蛛网膜下腔出血 |
| 4.展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 攻读博士学位期间参与研究和申报的课题 |
| 个人简介 |
| 一般情况 |
| 学习与工作经历 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
| 1、开题报告专家小组成员 |
| 2、中期考核组成员 |
| 3、学位论文答辩委员会成员 |
（9）肝素磁性纳米粒对于急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:载药纳米粒体系的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验器材 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 载药肝素MNP共轭反应 |
| 2.2.2 透射电子显微镜(TEM)观察Hep-MNP及MNP的形态及分布 |
| 2.2.3 Hep-MNP及MNP的傅里叶红外光谱(FTIR) |
| 2.2.4 载药量测定:发色底物法测定上清液肝素抗凝活性及纳米粒的抗凝活性 |
| 2.2.5 应用MTS法检测磁性纳米粒处理后细胞增殖活性 |
| 2.2.6 MNP及Hep-MNP磁场下及非磁场下的入胞实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 羧基化Fe_3O_4磁性纳米粒对肝素载药 |
| 3.2 通过TEM观察载药前后纳米粒形态结构 |
| 3.3 FTIR方法验证反应产物 |
| 3.4 磁性纳米粒的载药率 |
| 3.5 MTS法进行Hep-MNP及肝素,MNP对细胞增殖率影响的研究 |
| 3.6 通过细胞内铁含量的测定 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:体外实验:载药纳米粒对体外细胞IP3R1的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂配制 |
| 2.1.3 主要实验器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 应用realtime PCR研究Hep-MNP及肝素作用后IP3R1 mRNA情况 |
| 2.2.2 应用Western Blot研究载药纳米粒对RGMCs IP3R1蛋白的表达影响 |
| 2.2.3 不同浓度肝素对RGMCs钙离子浓度影响的比较 |
| 2.2.4 不同浓度Hep-MNP及肝素对RGMCs钙离子浓度影响的比较 |
| 2.2.5 内皮素(ET-1)作用后RGMCs内钙离子浓度的测定 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用realtime PCR研究Hep-MNP,MNP及肝素对RGMCs(HBZY-1)细胞IP3R1 mRNA表达的影响 |
| 3.2 应用westernblot研究Hep-MNP及肝素等药物对RGMCs细胞IP3R1蛋白的表达影响 |
| 3.3 不同浓度肝素对RGMCs钙离子浓度影响的比较 |
| 3.4 不同浓度Hep-MNP与不同浓度肝素对RGMCs细胞钙离子浓度影响的比较 |
| 3.5 内皮素(ET-1)作用后细胞内钙离子浓度的测定 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:载肝素磁性纳米粒对急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率影响的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 植入微渗泵 |
| 2.2.3 动物分组及肝衰模型建立 |
| 2.2.4 血清FITC-Inulin测定及GRF计算 |
| 2.2.5 血清生物化学检查 |
| 2.2.6 肝肾组织病理 |
| 2.2.7 提取肾小球 |
| 2.2.8 肾小球菊粉容积测量(GIS) |
| 2.2.9 肾小球内钙浓度测量 |
| 2.2.10 Real-Time PCR检测IP3R1mRNA相对含量 |
| 2.2.11 Western Blot检测IP3R1蛋白的相对含量 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般状况及生存率 |
| 3.2 肝脏及肾脏大体形态学改变 |
| 3.3 肝脏及肾脏组织学病理结果及纳米粒代谢 |
| 3.4 血清生化学指标检测结果 |
| 3.5 各组大鼠GFR |
| 3.6 肾小球内钙浓度测量 |
| 3.7 肾小球菊粉容积测量(GIS) |
| 3.8 应用realtimePCR研究Hep-MNP对大鼠肾小球IP3R1 mRNA表达的影响 |
| 3.9 应用western blot研究Hep-MNP对大鼠肾小球IP3R1蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新点自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 纳米粒与靶向用药研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）羟氯喹对抗核糖体P蛋白抗体引起神经细胞损伤的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 抗核糖体P蛋白抗体与N2a细胞结合对细胞功能及活性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 Anti-P IgG抗体的纯化 |
| 2.3.3 免疫荧光染色 |
| 2.3.4 钙离子成像 |
| 2.3.5 ATP检测 |
| 2.3.6 CCK-8 法检测细胞活性及台盼蓝细胞计数实验 |
| 2.3.7 细胞凋亡检测(流式细胞术) |
| 2.3.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Anti-P IgG与 N2a细胞在细胞膜上特异性结合 |
| 3.2 Anti-P IgG升高N2a细胞内的Ca~(2+)水平 |
| 3.3 Anti-P IgG可以增加细胞内的钙库释放,并促进细胞外的Ca~(2+)内流 |
| 3.4 Anti-P IgG促进N2a细胞释放ATP |
| 3.5 Anti-P IgG降低N2a细胞的增殖能力和活性 |
| 3.6 Anti-P IgG促进N2a细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 硫酸羟氯喹对Anti-P IgG引起N2a细胞损伤的保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙离子成像 |
| 2.3.2 ATP检测 |
| 2.3.3 CCK-8 法检测细胞活性及台盼蓝细胞计数实验 |
| 2.3.4 细胞凋亡检测(流式细胞术) |
| 2.3.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCQ在一定浓度范围内对N2a细胞不具有细胞毒性 |
| 3.2 HCQ抑制Anti-P IgG引起的N2a细胞内钙信号增强 |
| 3.3 HCQ抑制Anti-P IgG引起的N2a细胞ATP释放增多 |
| 3.4 HCQ缓解Anti-P IgG对 N2a细胞增殖能力和活性的抑制作用 |
| 3.5 HCQ减少Anti-P IgG引起的N2a细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 HCQ对N2a细胞保护作用的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 Bcl-2 抑制剂浓度及处理时间的选择 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 钙离子成像 |
| 2.4.2 蛋白印迹实验(Western blot) |
| 2.4.3 免疫荧光染色 |
| 2.4.4 免疫共沉淀 |
| 2.4.5 细胞内钙信号检测(流式细胞术) |
| 2.4.6 CCK-8 法检测细胞活性 |
| 2.4.7 细胞凋亡检测(流式细胞术) |
| 2.4.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCQ可以调节凋亡蛋白的表达 |
| 3.2 HCQ减少Anti-P IgG引起的细胞内Ca~(2+)释放,不影响细胞外Ca~(2+)内流 |
| 3.3 HCQ不影响IP3R的表达 |
| 3.4 HCQ增加Bcl-2与IP3R的结合 |
| 3.5 抑制Bcl-2 表达逆转HCQ对钙信号的影响及其神经保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 自身抗体与系统性红斑狼疮相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、细胞内钙离子分析（论文参考文献）
- [1]多巴胺在肝纤维化发生发展机制中的作用研究[D]. 杨晓旭. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]细胞间隙连接通道的传输行为研究[D]. 马迪. 长春理工大学, 2021(02)
- [3]乙醇诱导的肝肿瘤细胞H4-ⅡE发生内质网应激及细胞凋亡中钙离子浓度的变化研究[D]. 金贵虹. 延边大学, 2021(02)
- [4]高钙诱导的心脏电交替及其致心律失常作用机制的研究[D]. 张培培. 武汉科技大学, 2021(01)
- [5]β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究[D]. 陈莎. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用[D]. 牛灵芝. 吉林大学, 2021(01)
- [7]GPR37经调控Kupffer细胞M2型极化诱导老龄鼠供肝免疫耐受的机制研究[D]. 徐雪松. 重庆医科大学, 2021
- [8]多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究[D]. 王钊. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [9]肝素磁性纳米粒对于急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率影响的研究[D]. 李承博. 中国医科大学, 2021(02)
- [10]羟氯喹对抗核糖体P蛋白抗体引起神经细胞损伤的影响及其机制研究[D]. 赵欣楠. 中国医科大学, 2021(02)