一、CD28在多发性硬化患者CD8~+淋巴细胞的表达（论文文献综述）
宁召臣,王晓彤,熊化保[1]（2021）在《B/T淋巴细胞弱化因子在免疫调控和免疫相关疾病中的作用》文中提出B/T淋巴细胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator, BTLA）是免疫调控中重要的检查点分子之一。BTLA属于CD28超家族,其蛋白质结构类似于程序性细胞死亡受体-1 （programmed cell death-1, PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 （cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4）。BTLA主要在B细胞和T细胞中表达,也被发现存在于其它一些先天免疫细胞,例如树突状细胞和单核细胞中。到目前为止,疱疹病毒入侵介质（herpesvirus entry mediator, HVEM）是在人类细胞中发现的BTLA的唯一配体。HVEM属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）超家族,其与BTLA的相互作用直接连接了CD28和TNFR两大家族。BTLA与HVEM的结合通常介导免疫抑制效应,并在维持免疫耐受方面发挥重要作用。然而近年来研究发现,BTLA/HVEM通路除了提供负调控信号以外,还能促进T细胞的存活,这种双重信号系统的存在使得BTLA介导的免疫调控更加精细和复杂。越来越多的研究表明,BTLA参与并影响了T细胞、B细胞及树突状细胞等介导的免疫调控,并因此在多种免疫相关疾病,例如炎症、肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病中发挥重要作用。本文以国内外最新研究进展为基础,就BTLA在免疫调控及免疫相关疾病中的作用进行综述。
耿陈露[2]（2021）在《来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究》文中认为T细胞是抗肿瘤免疫反应的重要组成部分,是肿瘤免疫治疗的主要作用对象。充分激活T细胞需要TCR（T cell receptor）识别MHC（Major histocompatibility complex）呈递的抗原多肽产生抗原信号,还需要一系列共刺激信号。T细胞表面的CD28共刺激受体与B7配体相互作用,激活下游共刺激信号,促进T细胞的激活和效应细胞功能,这对充分激活T细胞抗肿瘤免疫反应至关重要。但在人体衰老过程和部分实体瘤中,CD8+T细胞表面的CD28蛋白表达会逐渐缺失,CD28的缺失会导致T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1（Programmed death-1/programmed death-ligand 1）免疫检查点抑制剂失效。来那度胺（lenalidomide）是一种免疫调节药物（Immunomodulatory drugs,IMi Ds）,可以在缺少CD28和B7相互作用的情况下共刺激T细胞,但来那度胺能否在实体瘤中通过共刺激CD28-T细胞弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1抗体治疗失效并没有得到阐述。我们构建了CrbnI391V基因敲入小鼠模型,在小鼠中模拟来那度胺对人源T细胞的共刺激作用,用于探讨来那度胺的共刺激作用对实体瘤免疫治疗的意义。我们的研究结果表明,在CD28缺失的CrbnI391V小鼠中,来那度胺共刺激CD28-CD8+T细胞,增强T细胞免疫反应,可以抑制肿瘤生长并弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。在结直肠癌病人的肿瘤样本中,来那度胺可以共刺激CD28-CD8+T细胞,并增强这群T细胞对PD-1抗体的响应。在分子机制层面,已知来那度胺可以在T细胞中靶向CRL4CRBN E3泛素连接酶导致转录因子IKZF1（Ikaros）和IKZF3（Aiolos）泛素化降解,上调白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）。我们进一步揭示来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,而来那度胺在Cd28-/-CrbnI391V小鼠中恢复PD-1抗体的肿瘤抑制效果需要IL-2和Notch信号的参与。这些结果提示,来那度胺有望在肿瘤中浸润有大量CD28-CD8+T细胞的实体瘤病人中增强PD-1抗体的疗效,这一发现对实体瘤的免疫治疗具有一定的临床指导意义。我们尝试进一步挖掘来那度胺的共刺激作用在实体瘤中的治疗潜力。为此,我们通过体内CRISPR文库筛选系统性地寻找能够增强结肠癌细胞对来那度胺治疗敏感性的基因突变,并发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺的治疗更加敏感。这为充分发挥来那度胺在结肠癌中的免疫治疗潜力提供了潜在的生物标志物和联合治疗靶点。最后,我们利用Cd28-/-CrbnI391V小鼠CD8+T细胞筛选了一些来那度胺类似物,并发现了两个全新的化合物可以高效地共刺激CD8+T细胞,将来可用于进一步肿瘤免疫治疗的研究。创新点:1.明确来那度胺可以在体内和体外共刺激CD28-CD8+T细胞,有望弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足。2.发现来那度胺有可能弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。3.发现来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,并确定了这是来那度胺共刺激CD8+T细胞的分子机制之一。4.通过CRISPR文库筛选发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺治疗更加敏感。
林杉[3]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中研究指明研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
丁黎莉[4]（2021）在《白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是胰酶在体内异常激活所导致的局部或全身性炎症反应。促炎免疫与抗炎免疫系统失衡是促进疾病进展的重要机制。髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell,MDSC）是骨髓来源的调节性免疫细胞,可通过精氨酸酶（Arginase）-1、活性氧（reactive oxygen species,ROS）、免疫抑制性受体（immune receptors,IRs）等机制发挥免疫抑制作用。含免疫球蛋白和ITIM基序的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Lg and ITIM domains,TIGIT）作为一种新型的IRs,对T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）的功能产生一定影响。但是TIGIT在AP中T细胞上表达的变化及其作用目前尚无报道。白介素（interleukin,IL）-37是新发现的抗炎因子,可通过诱导调节性免疫细胞表型转化等方式发挥抗炎作用。我们在预实验中发现AP患者血浆中IL-37升高。本研究通过分析AP患者体内MDSC、IL-37的变化,结合体外实验进一步阐释IL-37通过影响MDSC的抑制功能,影响AP的发生发展的作用及其机制,为AP的治疗提供新的思路。研究方法:（1）应用流式细胞分析法（flow cytometry,FCM）测定患者及健康对照组（healthy control,HC）中HLADR-CD11b+MDSC及其亚群CD66b+CD14-粒细胞样及CD66b-CD14+单核细胞样MDSC比例与数目,并分析与APACHE II评分、C-反应蛋白、住院天数（length of stay,LOS）的相关性。应用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色测定T细胞增殖法分析HC来源与重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）来源的MDSC的抑制功能。应用FCM进一步分析及来源的Arg-1、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及MDSC表面CD155的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）表达有无差异。（2）应用FCM测定HC及AP患者外周血中CD3+T细胞及其亚群CD4+、CD8+T细胞比例、数量。测定HC与来AP来源的CD3+T细胞及其亚群CD4+、CD8+T细胞中的IFN-γ的比例及细胞表面TIGIT的差异。分析CD3+T细胞及其亚群细胞表面TIGIT表达与IFN-γ的表达、细胞增殖能力之间的关系。（3）应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定HC、AP患者血浆IL-37浓度,并检测其与APACHE II评分、MDSC之间的相关性。体外分析IL-37处理组与未处理组的MDSC的比例、Arg-1、ROS及MDSC表面CD155的表达变化。将IL-37处理的与未处理的MDSC细胞分别与T细胞共培养,检测各孔细胞增殖率。将HC及SAP来源的MDSC与TIGIT+及TIGIT-细胞分别共培养,检测各组细胞的增殖率变化,揭示抑制细胞可能机制。研究结果:（1）AP患者外周血中MDSC细胞及其亚群G-MDSC、M-MDSC在外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中比例及绝对计数增加,且与APACHE II评分、C-反应蛋白正相关。SAP患者来源的MDSC对CD3+T细胞抑制作用增强。SAP来源的MDSC较HC组的Arg-1、ROS、CD155表达升高。（2）AP患者外周血中CD3+T细胞及其CD4+、CD8+亚群在PBMC中比例及数量减少,且各T细胞亚群IFN-γ分泌减少。AP患者外周血T细胞表面TIGIT表达比例较HC组降低。TIGIT+T细胞较TIGIT-T细胞IFN-γ分泌增多,细胞增殖能力增强。（3）AP患者血浆中IL-37浓度较HC升高,与MDSC呈负性相关。IL-37在体外不能诱导PBMC中细胞向MDSC转化,但是可以增强MDSC对T细胞的抑制作用。IL-37在体外降低MDSC的ROS、CD155的表达,对Arg-1表达强度无影响。阻断ROS降低MDSC表面CD155的表达。MDSC对TIGIT+T细胞具有抑制功能,而对TIGIT-T细胞无抑制功能。研究结论:本研究发现MDSC在AP患者体内增多,且MDSC抑制功能增强,且与疾病严重程度正相关,MDSC对T细胞的抑制作用可能是通过CD155/TIGIT途径实现的。AP患者外周血中IL-37因子升高,IL-37增强MDSC对T细胞的抑制作用,其增强作用机制尚不明确。本研究为探究AP的发病机制提供了新的思路,为阻止AP进展为SAP提供了新的理论依据。
徐清浪[5]（2021）在《慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义》文中指出目的:通过分析外周血T淋巴细胞亚群在慢性HBV感染患者不同临床阶段的水平特征与各临床指标之间的关系,同时对免疫耐受期、e抗原阳性患者进行随访,评估T淋巴细胞亚群对免疫状态、打破免疫耐受及发生e抗原转换的诊断效能,探讨T淋巴细胞亚群在慢性HBV感染患者中的分布特征及其临床意义。方法:入组2018年12月～2020年12月在南昌大学第一附属医院感染科就诊及住院慢性HBV感染患者共231例,收集基本资料及各临床指标值,分别根据免疫状态、HBV-DNA载量、HBs Ag定量水平进行分组,观察T淋巴细胞亚群与各临床指标间的关系及评估免疫状态的诊断效能;同时对55例免疫耐受期慢性HBV感染患者及132例HBe Ag（+）阳性患者进行随访,观察T淋巴细胞亚群对打破免疫耐受、发生e抗原血清学转换的诊断效能及抗病毒前后慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化。结果:1、HBV感染后免疫耐受组与非免疫耐受组CD3+、CD4+、CD8+细胞绝对值及CD4/CD8比值均低于健康体检组,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫耐受组CD3+、CD4+细胞绝对值、CD4+细胞比例及CD4/CD8比值均低于非免疫耐受组,差异有统计学意义（P<0.05）。2、慢性HBV感染患者外周血CD3+、CD4+细胞绝对值及比例、CD4/CD8比例随着HBV载量升高呈逐渐下降趋势,CD8+细胞绝对值及比例逐渐明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。3、慢性HBV感染患者HBs Ag定量高载量组CD3+、CD4+细胞绝对值均低于低、中HBs Ag载量组,差异有统计学意义（P<0.05）。低载量组CD4/CD8比值大于中载量组,差异有统计学意义（P<0.05）。4、HBV-DNA与CD3+细胞绝对值及比例、CD4+细胞比例、CD4/CD8比值存在负相关关系,相关系数分别为-0.407、-0.438、-0.516、-0.703,与CD8+细胞比例存在正相关关系,相关系数为0.511。HBs Ag与CD3+细胞绝对值、CD4+细胞绝对值存在负相关关系,相关系数分别为-0.431、-0.429。ALT与CD8+细胞绝对值及比例存在负相关关系,相关系数分别为-0.418、-0.439。TBi L与CD3+细胞绝对值及比例、CD4+细胞绝对值及比例、CD8+细胞绝对值及比例存在负相关关系,相关系数分别为-0.443、-0.531、-0.572、-0.515、-0.453、-0.412。WBC计数与CD3+细胞绝对值、CD4+细胞绝对值、CD8+细胞绝对值存在正相关关系,相关系数分别为0.486、0.438、0.409。5、抗病毒治疗后,慢性HBV感染患者CD3+细胞绝对值与比例、CD4+细胞绝对值与比例、CD8+细胞绝对值较抗病毒前明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。6、CD4+细胞绝对值、CD4+细胞比例、CD4/CD8比值对评估免疫状态的检验效能曲线下面积分别为0.774、0.827、0.721。7、CD3+、CD4+、CD8+细胞数量与CD4/CD8比值对打破免疫耐受状态的检验效能曲线下面积分别为0.831、0.892、0.802、0.837。8、CD3+、CD4+、CD8+细胞数量对发生e抗原转换的检效能曲线下面积分别为0.858、0.872、0.735。结论:1、HBV感染后,普遍存在细胞免疫功能下降及免疫紊乱现象,这一现象在免疫耐受期患者当中表现得更为明显,且随着慢乙肝疾病重症化,机体细胞免疫功能可能出现下降甚至衰竭现象。2、HBV-DNA载量、HBs Ag定量水平与外周血T淋巴细胞亚群之间存在密切关系,HBV-DNA、HBs Ag载量越高,对患者细胞免疫功能的抑制作用越强,而抗病毒治疗可显着改善HBV-DNA对患者细胞免疫功能的抑制作用。3、CD4+细胞绝对值数量、比例及CD4/CD8比值对HBV感染患者免疫状态有较好的评估效应,CD3+、CD4+、CD8+细胞数量与CD4/CD8比值对预测免疫耐受期患者打破免疫耐受状态有一定的参考价值,临床上可动态检测外周血T淋巴细胞辅助评估患者免疫状态及打破免疫耐受可能性。4、检测CD3+、CD4+、CD8+细胞数量对预测发生e抗原血清学转换有一定的参考意义。
李会敏[6]（2021）在《髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展》文中研究说明研究背景和目的:原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy,PMN）是一种 Th2 免疫反应导致的以肾小球病变为主要病理改变的自身免疫性疾病,是引起成人肾病综合征的常见病因。大多数PMN病例（约85%）是由磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor,PLA2R）抗体介导的,而其余的与包含7A的血栓蛋白1型结构域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7A）或不明机制相关。Th17细胞通过介导基本炎症级联作用在肾脏自身免疫中发挥关键作用,能促进自身抗体的形成,这是大多数肾脏自身免疫性疾病的关键,增强组织炎症,并对肾实质细胞有直接影响,然而Th17细胞是否参与PMN的发生发展目前尚不清楚。髓系抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）是一群免疫抑制细胞,研究发现狼疮肾炎患者中MDSC可促进Th17分化和疾病进展,但在PMN中MDSC的变化及与Th2和Th17细胞的相互作用至今尚无研究。本研究旨在揭示PMN中MDSC与Th2和Th17免疫反应的关系,为PMN的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:（1）PMN患者肾脏组织石蜡和冰冻切片染色,光镜下观察肾组织病理改变;IF检测肾小球基底膜免疫复合物沉积情况;多色免疫组化（multiplex immunohistochemistry,IHC）检测IL-4、CD3和CD11b抗体在肾组织定位和表达强度;应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测PMN患者和HC血浆中抗PLA2R抗体的含量及对疾病诊断的灵敏度和特异性。（2）应用FCM和ELISA方法分别检测了 HC和PMN患者中CD4+IL-4+（Th2）和 CD4+IFN-γ+（Th1）细胞比例及相关细胞因子 IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和IFN-γ的水平,并分析Th2细胞比例与疾病活动度的相关性及Th1/Th2比例变化;同时检测了 HC和PMN患者中调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的比例变化。（3）采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定健康对照组（healthy control,HC）和PMN患者外周血中MDSC及其亚群的比例与数目;并分析了 PMN患者的MDSC 比例和数量与疾病活动度和外周血Th2细胞比例的相关性。（4）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,加入CFSE标记;同时流式分选纯化各自相应的MDSC细胞,将MDSC和初始CD4+T应用CD3和CD28抗体共刺激培养3天,流式检测比较HC和PMN患者的MDSC的抑制功能。（5）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th2细胞的极化体系,分别加入MDSC和（或）Arg-1和iNOS抑制剂及IL-6和IL-10因子,通过FCM方法比较CD4+IL-4+（Th2）细胞的变化。（6）免疫荧光染色法（immunofluorescence,IF）检测PMN患者肾组织中IL-17+细胞和CD11b+细胞的共定位;FCM和ELISA分别检测HC和PMN患者中Th17细胞比例及相关细胞因子IL-17A水平,并分别分析了两者与疾病活动度的相关性;（7）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th17细胞的极化体系,加入MDSC和（或）Arg-1抑制剂,通过FCM和ELISA方法比较CD4+IL-17A+（Th17）细胞和培养上清中IL-17A的变化;（8）ELISA检测HC和PMN患者血浆中Arg-1的含量变化,分析PMN患者中Arg-1含量与疾病活动度和MDSC数量的相关性;流式分选PMN患者的MDSC并加入IL-6或IL-10因子共同培养,利用实时荧光定量核酸扩增技术（real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测 IL-6 和 IL-10 对 MDSC 中 Arg-1 mRNA表达的影响。（9）应用重组人Ⅳ型胶原蛋白α3链的非胶原（NC）结构域（Non-collagenous（NC）domains of the α3 chain of recombinant human type Ⅳ collagen,rh-α3（IV）NC1）蛋白免疫DBA/1小鼠,构建PMN小鼠模型,并给予吉西他滨（gemcitabine,GEM）去除MDSC,检测小鼠外周血、脾脏和淋巴结中MDSC、Th2、Th17、Th1和Treg细胞的变化;ELISA法检测小鼠尿白蛋白、尿肌酐及血清尿素氮的水平;qRT-PCR检测小鼠脾脏、淋巴结和肾脏组织Th2和Th17相应细胞因子IL-13和IL-17A及相关转录因子GATA3、RORγt和RORα的mRNA表达情况;IF染色检测肾组织内IgG沉积;光镜下观察模型小鼠肾脏病理改变;电镜下观察模型小鼠肾脏的超微结构变化。研究结果:（1）PMN患者外周血Th2细胞及相关因子增加并与疾病活动度正相关;（2）PMN患者外周血中MDSC及其亚群数量显着增加,抑制功能增强,但与疾病活动度正相关;（3）体外实验证实MDSC抑制Th2细胞分化,IL-6和IL-10增强MDSC抑制能力。（4）PMN患者外周血Th17细胞及其相关因子增加并与疾病活动度正相关;（5）PMN患者外周血中MDSC、Arg-1、IL-17三者存在相关性;（6）体外实验证实人MDSC通过产生Arg-1促进Th17细胞分化,并且PMN来源的MDSC有更强的促Th17分化作用且可被Arg-1抑制剂（nor-NOHA）终止;（7）PMN患者血浆中Arg-1含量增加,IL-6和IL-10可以促进MDSC分泌 Arg-1。（8）应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型;PMN小鼠外周血中MDSC、Th17和Th2细胞比例随着免疫时间延长增加;而Th1和Treg细胞比例随着免疫时间延长呈下降趋势;（9）去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤;（10）去除MDSC降低Th17和Th2细胞比例及相关转录因子的表达;但增加Th1和Treg细胞比例。结论:MDSC在PMN中显着增加,MDSC可能主要通过增强Th17反应促进PMN疾病进展。Th17的分化依赖于MDSC分泌的Arg-1。PMN小鼠模型证实去除MDSC可能主要通过减弱Th17免疫反应减轻小鼠肾脏损伤。
湛梦茹[7]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中研究说明背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
韩盼盼[8]（2021）在《低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究》文中研究说明第一部分:低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary Immune Thrombocytopenia,ITP）是一种病因未明的获得性自身免疫性出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。由于长期接受激素等药物治疗并伴随高出血风险等原因,慢性ITP患者身体乏力,情绪焦虑,兴趣丧失,其生活质量甚至不如癌症患者。ITP发病机制尚未完全阐明,主要原因是患者对自身血小板抗原免疫失耐受,体液免疫和细胞免疫紊乱介导血小板破坏过多和/或血小板生成不足。免疫耐受是机体对自身抗原不产生反应,而对其他抗原发挥免疫应答能力,重建并维持免疫耐受是自身免疫性疾病的重要治疗策略。近年来,虽有血小板生成素受体激动剂、利妥昔单抗等新药出现,但仍有约1/3的患者对各种治疗反应不佳。因此,深入研究ITP免疫失耐受的机制、探寻重建免疫耐受的策略对于ITP的诊治、改善患者生活质量和预后具有重要意义。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）在介导免疫耐受,维持免疫稳态,控制自身免疫疾病及抑制过度免疫反应中发挥关键作用。大量研究结果表明,ITP患者体内Treg细胞的数量和功能较正常人显着下降,导致自身反应性效应性T（Teff）细胞过度增殖和激活。通过恢复Treg细胞的功能,抑制Th1和Th17细胞的增殖,恢复ITP患者的免疫耐受,是目前ITP特异性治疗方案的重要机制。地西他滨是DNA甲基化转移酶抑制剂,主要用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。地西他滨去甲基化可促进巨核细胞成熟和血小板释放,因此在升高血小板方面具有显着疗效。课题组前期实验室研究证实低剂量地西他滨能够有效改善ITP患者血浆诱导的巨核细胞成熟、凋亡障碍及血小板生成不足。在此基础上,课题组牵头组织的多中心前瞻性临床研究证实,低剂量地西他滨治疗难治性ITP患者耐受性良好,总有效率约50%,部分患者获得超过1年的长期疗效。然而,低剂量地西他滨促进巨核细胞成熟和血小板生成的作用无法完全解释ITP患者获得长期疗效的原因和机制。近年来,有研究报道地西他滨在诱导和维持自身免疫耐受中发挥重要作用。同种异体小鼠骨髓单个核细胞多次输注诱导免疫耐受的基础上,联合地西他滨可显着增加Treg细胞数量、抑制CD4+T细胞增殖、提高小鼠皮肤移植成功嵌合率。我们猜想地西他滨在ITP中能够通过诱导Treg细胞生成,增强Treg细胞抑制功能,恢复Treg细胞和Teff细胞的平衡,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究低剂量地西他滨在体内和体外对ITP中Treg细胞生成和功能的影响,探明地西他滨是否通过Treg细胞重新平衡CD4+T细胞亚群。（2）阐明干预STAT3等关键分子对地西他滨诱导Treg细胞生成和功能的影响,进一步验证地西他滨的作用靶点和通路。（3）揭示地西他滨在ITP治疗中获得长期疗效的原因,为地西他滨用于ITP患者的治疗提供准确详实的数据,为ITP患者的诊治提供新靶点和新策略。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者及年龄、性别匹配的健康对照者的外周血样本。同时收集地西他滨治疗前、后ITP患者的外周血样本。（2）构建主动ITP小鼠模型:用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将CD61敲除小鼠的脾脏细胞输注给辐照后的联合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD4+T细胞。加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入不同浓度地西他滨（0,1 nM,10nM,100nM,1μM,10μM）孵育72小时。（4）流式细胞术检测:地西他滨处理后Annexin-V和PI染色检测PBMCs的凋亡水平,并检测 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞,CD4+IFN-γ+Th1 细胞,CD4+IL4+Th2细胞,CD4+IFN-γ-IL17+Th17 细胞和 CD4+IFN-γ-IL22+Th22 细胞的数量。（5）Treg细胞抑制功能实验:磁珠分选CD4+CD25-Teffs细胞,加入CFSE染色后,与分选的CD4+CD25+CD127-Treg细胞按照比例为4:1的比例共培养。6天后,流式细胞术检测CD4+T细胞增殖。（6）靶向去除Treg细胞:免疫磁珠从CD61敲除小鼠的脾细胞中删除CD4+CD25+Treg细胞后输注给SCID小鼠、或给SCID小鼠腹腔注射单克隆抗小鼠CD25（IL-2Rα）抗体来耗尽Treg细胞。（7）细胞因子检测:使用V-PLEX人促炎Panel 1试剂盒与V-PLEX人IL17A试剂盒检测ITP患者治疗前后的血清样品中的11种细胞因子,使用ELISA检测TGF-β水平。（8）转录组测序:提取地西他滨治疗前和治疗后的ITP患者PBMCs样本中的RNA,并在Illumina Hiseq平台上测序。（9）蛋白免疫印记（Western blot）:收集ITP患者治疗前后的PBMCs样本,检测AKT和STAT3蛋白水平的改变。（10）STAT3和AKT抑制实验:在体外细胞培养实验及ITP主动模型中应用STAT3和AKT抑制剂,检测其STAT3和AKT抑制剂对地西他滨治疗的影响。研究结果:（1）低剂量地西他滨促进Treg细胞的体外分化并增强其免疫抑制功能在体外研究中,低剂量地西他滨（10 nM和100 nM）显着提高了 ITP患者PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例,而未改变CD4+T细胞的百分比。通过分选CD4+T细胞排除其他细胞干扰,低剂量地西他滨（100 nM）仍显着增加了 ITP中Treg细胞的数量。我们分选ITP患者和健康对照组的CD4+CD25+CD127-Treg细胞与自身Teff细胞共孵育,100nM地西他滨可以显着提高Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制功能。地西他滨本身对Teff细胞增殖无明显影响。这些结果表明,低剂量地西他滨在ITP中显着增强了 Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨改善主动模型ITP小鼠血小板减少并促进脾脏Treg细胞扩增我们通过建立ITP主动模型来研究地西他滨的体内作用。照射和脾细胞输注7天后,小鼠血小板计数明显下降。与对照组相比,0.03 mg/kg的地西他滨组在第21天和28天血小板显着增加。给药3周后,流式细胞术分析显示,地西他滨处理组小鼠脾脏CD4+T细胞中Treg细胞的数量显着增加。同时,与对照相比,地西他滨组CD4+T细胞中Th1、Th17细胞明显减少,而Th22细胞无明显差异。（3）靶向去除Treg细胞能够部分抵消低剂量地西他滨的治疗作用通过脾细胞输注前磁珠分选删除的Treg细胞或注射抗-CD25抗体耗尽主动模型ITP小鼠中的Treg细胞来靶向去除Treg细胞,我们发现低剂量地西他滨在ITP小鼠中提高血小板计数的作用明显减弱。同时,靶向去除Treg细胞后,低剂量地西他滨对ITP模型小鼠的脾Th1、Th7细胞也无明显影响（4）低剂量地西他滨恢复ITP患者CD4+T细胞亚群的平衡通过分析纳入低剂量地西他滨临床实验ITP患者的外周血样本,我们发现地西他滨治疗后,患者体内CD4+T细胞中Treg细胞数量显着增加。同时,地西他滨显着降低了 ITP患者CD4+T细胞群中Th1和Th17细胞的比例。我们还观察到地西他滨治疗后,ITP患者的Treg细胞的抑制功能明显增强。（5）低剂量地西他滨对ITP患者T细胞分化相关细胞因子的影响通过对ITP患者在地西他滨治疗前后的外周血清分析,我们发现低剂量地西他滨显着降低了 ITP患者血清中TNF-α、IFN-y、IL-17a、IL-6、IL-8和IL-12的水平,而TGF-β与IL-2水平在地西他滨治疗后显着升高。血清IL-1β、IL-4、IL-10和IL-13水平在治疗前后无显着差异。（6）转录组测序分析ITP患者地西他滨治疗后基因表达变化为了评估低剂量地西他滨对ITP患者基因表达的影响,我们对4例治疗有效和3例治疗无效ITP患者进行了转录组测序分析。结果显示,有效患者在地西他滨治疗后共有301个基因有显着表达差异。治疗无效患者在地西他滨治疗后有43个基因表达水平发生明显变化。根据KEGG分析,治疗有效患者的表达差异基因与IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、Th17细胞分化通路、Jak-STAT信号通路等相关。（7）低剂量地西他滨通过抑制STAT3调节Treg细胞Western blot分析ITP患者地西他滨治疗后PBMCs的蛋白水平变化发现,与治疗前相比,STAT3磷酸化水平明显降低。在体外培养中,ITP患者和健康对照组CD4+T细胞中Treg细胞比例在STAT3抑制剂+地西他滨组与STAT3抑制剂组无明显差异。在ITP小鼠研究中,STAT3抑制剂+地西他滨组的小鼠的血小板计数与STAT3抑制剂组的没有显着差异。研究结论:（1）低剂量地西他滨可以增加ITP患者PBMCs中Treg细胞的数量并增强Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨通过调节脾脏Treg细胞从而显着提高ITP主动模型小鼠的血小板数目,恢复CD4+Th细胞亚群比例。（3）低剂量地西他滨恢复ITP患者的CD4+T细胞比例和Treg细胞抑制功能,并通过抑制STAT3调节ITP患者Treg数量和功能,从而恢复ITP患者的免疫耐受。第二部分:低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低和出血为特征的获得性自身免疫性疾病。目前,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,免疫异常介导机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,并导致巨核细胞的发育和成熟障碍,血小板生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。在血小板自身抗体基础上,异常的T细胞免疫,特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTLs）在ITP的发病机制中发挥重要作用。研究发现,CTLs可以通过直接杀伤自身血小板和诱导血小板凋亡参与ITP的发病。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）是CD28/CTLA-4家族成员之一,主要表达在外周血活化的T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和树突状细胞上。PD-1与其配体PD-L1结合,可以启动T细胞程序性死亡,在减少自身反应性T细胞增殖和降低CTLs对靶细胞的细胞毒性方面具有至关重要的作用。前期研究发现,ITP患者外周血单个核细胞（PBMCs）和CD4+T细胞中PD-1和PD-L1的表达减低,PD-L1-Fc重组融合蛋白通过激活PD-1/PD-L1通路增加了 ITP中T细胞的凋亡,抑制了 T细胞的激活和增殖。这些结果表明PD-1通路在ITP的发病机制中发挥重要作用,但是PD-1/PD-L1通路是否参与了 CTLs对血小板的杀伤尚无明确的研究。地西他滨是特异的DNA去甲基化药物（hypomethylating agent,HMA）,广泛应用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。研究发现,低剂量地西他滨可以通过去甲基化作用促进巨核细胞成熟和血小板释放。此外,在治疗MDS的过程中,去甲基化药物可以导致PD-1 CpG岛去甲基化和PD-1表达增加。我们猜测低剂量地西他滨通过调节ITP病人的PD-1抑制CTLs细胞毒性,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究PD-1在ITP中的表达及甲基化水平及其在ITP发病中的作用机制。（2）探究PD-1/PD-L1通路在抑制CTLs毒性及恢复ITP免疫耐受中的作用。（3）探究低剂量地西他滨对PD-1甲基化和表达的调控作用,阐明地西他滨对CTLs杀伤血小板的影响以及对ITP的治疗价值。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者65例及年龄、性别匹配的健康对照者43例的外周血。（2）构建主动ITP小鼠模型;用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将后者的脾脏细胞输给辐照后的联合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD8+T细胞。加入rh-IL-2、anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入地西他滨、PD-L1-Fc或抗人PD-1抗体孵育72小时。（4）流式细胞术检测:通过流式细胞术检测CD4+T、CD8+T细胞和血小板表面PD-1和PD-L1的表达。（5）荧光定量PCR（q-PCR）:检测ITP患者和健康对照PD-1的mRNA表达水平。（6）CTL诱导的血小板凋亡检测:健康对照血小板与CD8+T细胞按照106/mL:105/mL的比例混合,加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养,体外共培养4小时。应用线粒体膜电位检测试剂盒（Mitochondria Staining Kit）检测血小板调亡。（7）DNA甲基化测序:检测PD-1基因启动子区甲基化水平。（8）蛋白免疫印记（Western blot）:检测ITP患者地西他滨处理后的CD8+T细胞PI3k/AKT通路的的变化。研究结果:（1）PD-1和PD-L1在ITP患者CD8+T细胞中表达降低ITP患者PBMCs中PD-1的mRNA表达水平与健康对照组无显着差异。流式分析发现ITP患者外周血中CD8+T细胞和CD4+T细胞上的PD-1及PD-L1的表达明显低于健康对照组。ITP患者血小板上PD-L1表达水平与健康对照组无差异。此外,通过相关性分析发现ITP患者CD8+T细胞上的PD-1和PD-L1表达与血小板计数无关。（2）PD-L1-Fc抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤在CD8+T细胞培养体系中加入PD-L1-Fc融合蛋白后,我们发现PD-L1-Fc融合蛋白可显着降低ITP患者CTLs介导的血小板凋亡。而PD-L1-FC自身对血小板的凋亡无明显作用。这些结果提示PD-L-Fc融合蛋白能显着抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤。（3）ITP患者CD8+T细胞中PD-1甲基化水平增高通过DNA甲基化测序,我们发现ITP患者的PD-1启动子CpG甲基化比例显着高于健康对照组。因此,ITP患者CD8+T细胞的低PD-1水平有可能由于CD8+T细胞中PD-1的基因启动子区的甲基化水平升高导致的。（4）低剂量地西他滨显着增加CD8+T细胞PD-1表达在CD8+T细胞培养体系中加入100nM地西他滨孵育72小时后,我们发现地西他滨显着提高了 ITP患者CD8+T细胞的PD-1表达。为了评估我们的体外结果在体内可重复性,我们建立了 ITP主动模型。在第21天和28天,地西他滨治疗组小鼠的血小板计数显着升高。与对照组相比,地西他滨处理ITP小鼠脾脏CD8+T细胞的PD-1表达水平升高。此外,ITP患者在接受地西他滨治疗后血小板计数显着增加,同时CD8+T细胞PD-1表达显着增加。（5）低剂量地西他滨显着降低ITP中PD-1启动子甲基化ITP患者的CD8+T细胞用100 nM地西他滨培养。DNA甲基化测序检测PD-1基因甲基化。与对照组相比,处理后的细胞甲基化CpG残基显着降低。（6）低剂量地西他滨有效抑制ITP中CTLs介导的血小板凋亡低剂量地西他滨处理的CTLs和血小板共培养体系中,CTLs介导的血小板凋亡显着减少。我们进一步检测了接受地西他滨治疗的ITP患者CTLs细胞毒性,发现在地西他滨给药12周后,CTLs介导的血小板凋亡明显降低。（7）低剂量地西他滨抑制PI3K和AKT的磷酸化Western blot检测100nM地西他滨培养的CD8+T细胞裂解液中总PI3K和AKT的表达水平,发现并无明显变化。然而,低剂量地西他滨显着下调了 PI3K和AKT的磷酸化水平。（8）阻断PD-1可部分抵消地西他滨对CTLs介导的血小板凋亡的抑制作用为了确定地西他滨的作用机制是否依赖于PD-1通路,我们进行了体外和体内的PD-1阻断试验。体外实验发现,CTLs介导的血小板凋亡在地西他滨+抗人PD-1组和对照组之间没有显着差异。在ITP小鼠中,地西他滨+抗鼠PD-1组的血小板计数与对照组小鼠没有明显差异。这些结果表明地西他滨对CTLs杀伤功能的抑制作用可部分被阻断PD-1所抵消。研究结论:（1）PD-1在CD8+T细胞的甲基化水平升高及表达降低在ITP的发病机制中起作用。通过激活PD-1/PD-L1通路可抑制CTLs介导的血小板的凋亡。（2）低剂量地西他滨能够恢复ITP患者CD8+T细胞PD-1的表达并降低CD8+T细胞PD-1启动子区甲基化水平。（3）低剂量地西他滨通过上调PD-1通路抑制CTLs介导的血小板的凋亡,恢复ITP患者免疫耐受。
王姝文[9]（2021）在《ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究》文中研究指明第一部分:免疫性血小板减少症中骨髓T细胞的转录组图谱构建及亚群特征研究研究背景:免疫性血小板减少症（ITP）是一种自身免疫介导的血小板减少综合征。临床表现以无明显诱因的皮肤黏膜出血为主,也可发生内脏出血甚至颅内出血,严重者危及生命。迄今为止,仍有约30%-40%的患者治疗无效或短期内复发,进展为慢性或难治性ITP。因此深入研究ITP的病理生理机制、开发新的靶向治疗方式具有重要的临床意义。ITP的发生机制主要包括血小板破坏增多和/或生成减少,近年来有越来越多的研究关注T细胞功能失衡在ITP发生发展中的作用。血小板易受CD8+T细胞免疫监视作用的影响,当效应性CD8+T细胞识别血小板所表达的I类主要组织相容性复合物（MHC I）呈递的同源肽时,可脱颗粒并诱导靶细胞凋亡。此外,CD4+T细胞也参与ITP的免疫失耐受过程,其中,CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）数量减少、功能减弱是引起ITP自身免疫耐受缺陷的重要机制之一。目前,虽已有关于部分T细胞在ITP发病机制中作用的研究,但更多种类的T细胞亚群在ITP中的作用仍有待进一步深入探索。骨髓是重要的免疫反应器官,是血小板生成及破坏的关键场所之一。在自身免疫病、肿瘤等疾病发生时,免疫细胞聚集于骨髓并参与到机体致病反应中。其中,初始T细胞（TN）归巢于骨髓,在抗原刺激下分化为效应和记忆T细胞以发挥功能。值得注意的是,近年来发现一群可长期特异性驻留于骨髓的T细胞亚群,称为骨髓驻留记忆T细胞（TRM）。另外,骨髓中也存在Treg、黏膜相关恒定T细胞（MAIT）等T细胞亚群,它们在免疫应答中也具有不可替代的作用:骨髓Treg有助于维持自身耐受,在骨髓移植后,Treg对造血干细胞的植入和移植物抗宿主病的控制有积极作用;MAIT的溶细胞潜力以及MHC相关蛋白1的普遍表达和单态性,提示其可能成为自身免疫病的潜在治疗靶点,但目前相关研究仍较少。因此,解析骨髓T细胞的分群及功能有助于探索ITP等自身免疫病的致病机制及新的治疗方法。单细胞转录组测序（scRNA-seq）可以在单细胞水平上进行RNA提取、扩增、测序等操作,最终得到单个细胞的转录本信息。与群体水平的RNA测序不同,在单细胞水平上对基因表达进行分析可以更好地描述机体各项反应的发生过程,以及更精确地描述某些数量较少或构成较为复杂的细胞群体的特征。近年来,scRNA-seq在解析自身免疫病的发生机制、耐药途径和治疗靶点等方面有越来越多的应用。如对原发性干燥综合征患者外周血单核细胞的scRNA-seq分析显示,在患者中有两个T细胞亚群的比例显着增高,其特异性扩增参与疾病的发生;利用scRNA-seq对处于非肥胖型自身免疫性糖尿病各个阶段小鼠的胰岛细胞进行测序分析,提供了定义自身免疫性糖尿病分期的单细胞图谱。但目前仍缺少针对ITP致病机制或治疗方式的单细胞组学研究。研究目的:1.收集ITP患者及健康对照者骨髓样本,基于单细胞测序技术,构建骨髓T细胞在单细胞水平上的转录组图谱。2.探究ITP骨髓中,与自身免疫性疾病相关的多个T细胞亚群的特征及作用机制,为揭示ITP的发病机制及发现新的治疗靶点提供单细胞精度的依据。研究方法:1.病例和对照:收集初诊原发性ITP患者及健康供者骨髓样本,每例约3mL。2.分离骨髓单个核细胞（BMMCs）:使用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓样本中的BMMCs并使用台盼蓝检测细胞活性。3.分选骨髓T细胞:利用流式细胞分选仪分选BMMCs中的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞,分选后合并备用。4.制备油滴包裹的凝胶珠（GEMs）:配置GEMs制备反应体系,运行Chromium Controller的Chromium Chip A程序并使用PCR仪进行GEMs逆转录。5.扩增及纯化cDNA:回收GEMs逆转录产物,使用PCR仪进行cDNA的扩增,并用SPRIselect试剂盒纯化扩增后的cDNA。6.构建5’测序文库:进行cDNA片段化并用SPRIselect试剂盒纯化,完成接头连接和连接后的纯化,然后选择适当的Sample Index进行PCR并使用Agilent生物分析仪检测文库质量。7.单细胞上机测序:使用Illumina NovaSeq测序仪进行5’ Gene Expression文库和 Chromium Single Cell V（D）J 富集文库测序。8.流式细胞术检测骨髓TRM:通过检测细胞表面标志物CD3、CD8、CD69、CD45RA和CD45RO,分析骨髓中CD4+TRM和CD8+TRM分别占CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。9.数据分析9.1 数据处理:使用Cell Ranger软件将测序产生的fastq测序数据比对到参考基因组上进行基因表达定量,生成细胞-基因表达矩阵。9.2 数据质控及标准化:对数据进行质控与过滤,并进行标准化处理。9.3 数据合并及去批次效应:使用Seurat结合Harmony算法整合各样本的数据并校正样本的批次效应。9.4 细胞的聚类分析及注释:使用Seurat对细胞进行无监督聚类及分群,根据特征基因的表达对各亚群进行注释。9.5 基因本体（GO）分析:利用GO数据库,在细胞组分、分子功能、生物过程三个层面上对数据进行富集分析。9.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析:基于KEGG数据库对各亚群差异表达的基因进行富集分析。9.7 基因集富集分析（GSEA）:使用GSEA对基因集进行进一步富集分析。NES 绝对值>1,nominal p-value<0.05,FDR q-value<0.25 的通路下的基因集有意义。9.8 免疫组库V（D）J分析:应用scRepertoire对T细胞免疫组库进行可视化分析,内容包括CDR3区核苷酸长度、不同抗原受体序列丰度及文库的多样性和克隆性等。9.9 流式细胞术数据分析:使用Kaluza软件对流式细胞分析仪所采集的数据进行分析,并将整理后的数据导入SPSS 26.0和GraphPad Prism 7中进行统计学分析。研究结果:1.样本信息:研究纳入了 4例ITP患者及2例健康对照者。ITP患者均为初诊ITP,未使用过大剂量激素、丙种球蛋白等治疗自身免疫性疾病的药物。2.单细胞测序数据质量评估及质控:各样本中单细胞中位基因数平均为1190,单个细胞的 Fraction Reads 均大于 92%,Valid Barcodes 均大于 82%。3.骨髓来源T细胞的无监督聚类分群:根据特征基因的表达对各群进行注释,得到CD4+效应记忆T细胞/驻留记忆T细胞（TEM/TRM）、CD4+中央记忆T细胞（TCM）、CD4+细胞毒性 T 细胞（CTL）、CD4+TN、CD8+TN、CD8+TEM/TRM、CD8+CTL、Treg、MAIT等共1 1个T细胞亚群,ITP组、健康对照组及两者合并组的分群较为一致。4.骨髓来源T细胞的V（D）J分析:使用Chao和ACE指数进行克隆型多样性分析的结果显示,健康对照者相对ITP患者具有更高的丰富度,提示ITP患者存在疾病相关克隆扩增。5.ITP中骨髓MAIT单细胞转录组特征:ITP患者骨髓中MAIT与正常对照相比,富集的上调基因主要包括干扰素通路相关基因IFI44L、IFI6、IFITM1和调节细胞毒性及溶细胞作用的基因CTSW等。富集的下调基因主要包括维持细胞静止的基因BTG2、细胞周期相关基因YPEL5等。多个差异表达的基因与CTLA4、PD1等免疫检查点相关。此外,KEGG分析显示ITP中MAIT上调的基因与I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病等自身免疫病相关。6.ITP中骨髓Treg单细胞转录组特征:ITP患者的Treg存在与MAIT相似的干扰素通路相关基因的上调,其他表达上调的基因包括动力蛋白基因DYNLTI等。而ITP组下调的基因包括趋化因子或细胞粘附相关基因,核质运输相关基因等。说明除干扰素通路异常外,在ITP患者中还可能存在Treg的趋化、粘附、转运功能异常。7.ITP中骨髓TN单细胞转录组特征:与MAIT及Treg相似,ITP患者CD4+TN的上调基因富集到I型干扰素通路及抗病毒/固有免疫应答过程。下调基因主要包括调节细胞周期及静止的基因LBH、BTG2,并且下调基因还富集到了激素应答相关通路。与CD4+TN相似的是,ITP患者CD8+TN中也存在IFI44L、CTSW基因表达的上调和BTG2表达的下调。不同的是,ITP CD8+TN下调的基因还有自噬调节基因等。此外,CD8+TN在基因富集分析中也表现出与CD4+TN相似的基因富集通路,但存在更多与氧化应激相关的基因的下调,这部分的结果显示ITP中CD4+和CD8+TN既在干扰素通路及激素应答方面呈现出相似的特征,又在自噬及氧化应激方面有不同的特点。8.骨髓来源部分T细胞的进一步分群及注释:我们提取了第一次分群后的经典记忆性T细胞及效应性T细胞亚群,将其分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两类,并在此基础上进行了更高分辨率条件下的聚类分群。CD4+T细胞注释后得到 CD4+TCM-1、CD4+TcM-2、CD4+TEM、CD4+TRM等共 7 个亚群,其中CD4+TCM-1比CD4+TCM-2表现出更强的与TN的关联性。CD8+T细胞在第二次分群及注释后得到 CD8+TCM-1、CD8+TCM-2、CD8+TEM、CD8+TRM等共9个亚群,其中CD8+TCM-1与TN的关联性大于CD8+TCM-2。9.ITP患者骨髓TRM比例及单细胞转录组特征:单细胞测序和后续的流式细胞术验证结果都显示出ITP患者骨髓中的CD4+TRM占CD4+T细胞的比例和CD8+TRM占CD8+T细胞的比例较健康对照组增加。CD4+TRM相较总体CD4+记忆及效应T细胞亚群高表达的基因主要富集在T细胞活化、淋巴细胞增殖相关的基因通路。ITP患者CD4+TRM与正常对照者比较,富集的上调基因主要包括调节细胞活化或分化的基因、抗原递呈相关基因等。而下调基因富集在激素反应性及凋亡相关通路。我们还发现ITP患者中的CD8+TRM存在促活化/分化基因以及趋化因子相关基因的上调。上调的基因ID2、MAP3K8还与免疫检查点信号传导相关。这部分的结果提示,TRM亚群与总体记忆及效应T细胞相比,高表达的基因主要富集在T细胞活化及淋巴细胞增殖相关通路;ITP患者TRM与健康对照者相比,显示出细胞活化相关基因的上调及凋亡相关基因的下调。10.ITP患者骨髓CD8+CTL-1及CD8+TCM-1的单细胞转录组特征:CD8+CTL-1和CD8+TCM-1亚群相对于总体CD8+记忆及效应T细胞高表达的基因,在T细胞活化及分化通路上有更明显的富集。CD8+CTL-1中,ITP患者与正常对照者相比高表达促活化或分化的基因MAP3K8、PIK3R1等;富集分析结果显示出与T细胞毒性相关的通路显着富集。ITP患者CD8+TCM-1亚群的ID2、ZFP36基因表达上调;而下调的基因在凋亡通路有所富集,并且与激素治疗反应性有关。KEGG分析提示这两个亚群与I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病的相关性较健康对照组都明显增强。结论:构建了骨髓T细胞在单细胞水平上的转录组图谱,ITP组、健康对照组及两者合并组的分群及注释结果均较为一致。在ITP骨髓中,CD4+TN、CD8+TN、Treg、MAIT亚群上调的基因均显示出在干扰素通路上的富集,这4个亚群在ITP中发挥作用的途径与Ⅰ型、Ⅱ型干扰素相关。骨髓中部分T细胞亚群显示出较高的活化水平,TRM、CD8+CTL-1和CD8+TCM-1细胞,相较总体记忆性及效应性T细胞亚群,所高表达的基因主要富集在T细胞活化相关通路。第二部分:T细胞免疫检查点单核苷酸多态性与免疫性血小板减少症相关性研究研究背景:ITP是临床最常见的出血性疾病之一,以血小板计数减少和出血风险增加为特征。ITP是一种获得性自身免疫病,主要病理特点为血小板破坏增多和/或血小板生成减少,其发病机制涉及T细胞的过度活化,对于细胞介导的细胞毒性作用和IgG的生成至关重要。因此,进一步探讨ITP患者的T细胞异常有助于深入揭示ITP的发生和发展机制。免疫检查点分子包括共刺激分子和共抑制分子,是调节T细胞介导的免疫应答、决定T细胞功能和命运的关键机制之一。共刺激和共抑制信号,也称为“第二信号”,可调节T细胞受体（TCR）和MHC结合所提供的“第一信号”,并协同决定适应性T细胞免疫的结果。共刺激分子表达过高和/或共抑制分子表达不足可能引起机体自我耐受性下降,促进自身反应性T细胞的生成或引起自身反应性T细胞逃避中枢和外周耐受,导致自身免疫病的发生。T细胞的共刺激分子包括CD28、可诱导T细胞共刺激分子（ICOS）、肿瘤坏死因子超家族成员4（TNFSF4）和DNAX辅助因子1（DNAM1）等;而共抑制分子包括T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）、程序性死亡蛋白1（PD1）和淋巴细胞活化基因3（LAG3）等。其中,CD28和CTLA4与抗原递呈细胞表面的配体（CD80和CD86）相互作用,分别向T细胞引入刺激和抑制信号。而PD1是B7/CD28家族的一种新的共抑制成员,与PDL1结合抑制T细胞活化。因此,共刺激和共抑制信号可能导致自身免疫性疾病中T细胞的过度活化。单核苷酸多态性（SNP）是人类最常见的遗传变异类型。遗传学研究揭示,编码免疫检查点分子的基因的多态性与几种自身免疫病的易感性有关。CD28 rs1980422的CC基因型与类风湿关节炎（RA）中类风湿因子和抗瓜氨酸蛋白抗体有关,而 ICOS rs6726035、PD1 rs36084323、DNAM1 rs763361 和 TIM3 rs10515746的多态性也作为RA发生的相关因素。CTLA4rs231779的TT基因型增加患Graves病的风险。此外,多发性硬化（MS）患者LAG3 rs870849中TT基因型的分布与健康对照组相比有所不同。在系统性红斑狼疮（SLE）中,TNFSF4 rs2205960的次要等位基因的频率与自身抗体的产生相关。尽管多个SNP位点已被报道与机体免疫异常有关,但很少有研究关注ITP中免疫检查点基因的单核苷酸多态性。免疫检查点基因的单核苷酸多态性是否是ITP的保护性或危性险因素,以及这些SNP位点是否与ITP的易感性、严重程度、激素治疗敏感性或难治性相关,目前仍有待探索。研究目的:1.探究T细胞免疫检查点相关SNP位点的多态性在ITP患者及健康对照人群中的分布情况。2.探究免疫检查点基因单核苷酸多态性与ITP易感性、严重程度、难治性、激素治疗敏感性的关联及在其中的作用,揭示从T细胞免疫检查点入手治疗ITP的可能靶点。研究方法:1.病例和正常对照:收集ITP患者及健康对照者样本,对于ITP患者,按严重程度、难治性和糖皮质激素治疗敏感性进一步分层。2.基因组DNA提取:采用Ficoll密度梯度离心法分离样本中外周血单个核细胞（PBMCs）,并从中提取基因组DNA。3.选择SNP位点及基因分型:共选择8个SNP位点（TIM3 rs10515746,CD28 rs1980422,TNFSF4 rs2205960,CTLA4 rs231779,PDI rs36084323,ICOS rs6726035,DNAM1 rs763361,LAG3 rs870849）,使用 MassARRAY 系统进行基因分型。4.流式细胞术:通过检测细胞表面标志物CD3、CD4和CD28,分析CD4+T淋巴细胞中CD28的表达量。5.免疫磁珠分选:使用CD4+T细胞磁珠从PBMCs中分选CD4+T细胞,分选后检测CD4+T细胞纯度。6.实时定量PCR:提取上述CD4+T细胞的RNA,反转录获取cDNA,采用Light Cycler 480Ⅱ Real-Time PCR 系统进行定量 PCR,检测 CD28 的表达。7.统计分析:首先进行哈迪-温伯格平衡（HWE）检验,然后使用SPSS 26.0软件统计并分析数据;同时,利用GMDR0.9软件进行广义多因素降维（GMDR）分析,以解析基因-基因间的相互作用。研究结果:1.研究人群:ITP患者（307例）及健康对照者（295例）间在年龄结构、性别分布方面没有统计学差异（p>0.05）。使用对照组数据进行计算后,被检测的 8 个 SNP 均符合 HWE（p>0.24）。2.与ITP易感性相关的SNPs:使用4种遗传模型分析8个免疫检查点相关SNPs与ITP易感性的关系,包括显性模型、隐性模型、共显性模型和等位基因模型。共显性模型下的CD28 rs1980422的多态性与ITP易感性的关联最为显着（p=0.002）,且经过错误检出率（FDR）校正后仍具有相关性。对于CD28rs1980422,在共显性和显性模型下,CT和CC/CT基因型与ITP易感性显着相关（分别为p=0.006和p=0.016）。在共显性模型下的联合分析发现,TIM3 rs10515746的杂合基因型CA和CD28 rs1980422的杂合基因型CT使ITP发病风险明显增加（OR>l,p<0.05）。此外,使用显性模型的联合分析显示,与主要等位基因的纯合子相比,TIM3 rs10515746的CA/AA基因型和CD28 rs1980422的CC/CT基因型显着增加了 ITP的发生风险。采用GMDR方法进一步研究SNPs影响ITP易感性的多因素交互作用,证明TIM3 rs10515746、CD28 rs1980422 和 ICOS rs6726035 这 3 个 SNP 位点对 ITP 易感性表现出交互作用。3.与ITP严重程度相关的SNPs:PD1 rs36084323的TT基因型和T等位基因与ITP严重程度显着相关（p<0.05）。在等位基因模型下,LAG3 rs870849的T等位基因与ITP严重程度间有统计学意义（p<0.05）。等位基因模型的联合分析发现,携带PD1 rs36084323的T等位基因的ITP患者发生重度ITP的风险增加 1.649倍（OR=1.649,95%CI=1.186-2.291,p=0.003）;相反的是,LAG3 rs870849的T等位基因使重度ITP的发生风险降低（OR=0.506,95%CI=0.312-0.818,p=0.005）。4.与糖皮质激素治疗敏感性相关的SNPs:对于DNAM1 rs763361,在共显性和隐性模型的分析中都呈现出与糖皮质激素治疗敏感性显着相关（分别为p=0.016和p=0.030）。在等位基因模型下,糖皮质激素敏感组和耐药组之间的ICOS rs6726035等位基因频率存在显着差异（p=0.015）。DNAMl rs763361的T等位基因使糖皮质激素耐药风险增加1.939倍（OR=1.939,95%CI=1.278-2.942,p=0.002）;相反,ICOS rs6726035的T等位基因具有保护作用（OR=0.538,95%CI=0.366-0.791,p=0.002）。5.与ITP难治性相关的SNPs:PD1 rs36084323的基因型分布与ITP难治性显着相关（p<0.05）。共显性和显性模型下发现PD1 rs36084323的基因型分布在难治组与非难治组之间存在统计学差异（分别为p=0.030和p=0.034）。此外,在显性模型下,携带rs36084323的TT/CT基因型的患者发生难治性ITP 的风险是 CC 基因型患者的 8.889 倍（OR=8.889,95%CI=1.183-66.771,p=0.034）。6.CD28 rs1980422多态性与CD28表达相关:分析来自CD28 rs1980422位点为CT或TT基因型的ITP患者的CD4+T细胞中CD28+细胞的比例及CD28的平均荧光强度（MFI）,发现CD28rs1980422位点为CT基因型的ITP患者,CD28蛋白表达水平高于TT基因型患者（p=0.006）。另外,与TT基因型相比,CT基因型患者的CD28在mRNA水平的表达也增加（p=0.028）。结论:T细胞免疫检查点相关的6个SNP位点（TIM3 rs10515746,CD28rs1980422,PD1 rs36084323,ICOS rs6726035,DNAM1 rs763361,LAG3 rs870849）在 ITP患者和健康对照人群中的基因型和/或等位基因频率分布有所不同;这些SNP位点与ITP的易感性、严重程度、难治性或糖皮质激素治疗敏感性有关。CD28 rs1980422位点为CT基因型的ITP患者,CD28在蛋白及mRNA水平的表达均高于TT基因型ITP患者。研究所得到的6个SNP位点有望成为ITP发生发展及治疗效果的预测因子,也为ITP的免疫治疗提供了新的靶点。
杜圣红[10]（2021）在《免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究》文中研究表明原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种由于自身免疫紊乱导致的出血性疾病,临床表现主要为无症状性血小板减少、皮肤粘膜出血、月经量过多、内脏出血,严重者可出现颅内出血,出血风险随年龄增大而增加,约占临床出血性疾病的30%。ITP发病机制复杂,主要包括以下几方面:1.体液免疫异常,机体免疫系统对自身抗原失耐受,产生多种抗血小板抗体,自身抗体与血小板膜糖蛋白结合,通过结合巨噬细胞表面的Fcy受体（Fc gamma receptors,FcγRs）使血小板被巨噬细胞吞噬破坏;2.细胞免疫异常,反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞过度增殖活化,辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2、Th17/调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）亚群比例失衡,分泌多种细胞炎性因子,造成机体免疫紊乱;3.骨髓巨核细胞成熟障碍及破坏增加导致血小板生成减少等等均参与了ITP的发病。ITP的一线治疗为糖皮质激素和免疫球蛋白,激素的诸多副作用严重降低了患者的生活质量,并且约有15-20%的患者一线治疗无效。尽管有多种二线治疗药物,如CD20单克隆抗体、促血小板生成素受体激动剂（Thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA）、重组人促血小板生成素（Recombinant humanthrombopoietin,TPO）、脾切除等,仍有约 1/3的患者对上述治疗反应不佳,发展为难治性ITP,这部分患者长期承受疾病和经济压力。因此,进一步深入探究ITP发病机制,为难治性ITP患者寻找新的治疗靶点意义重大。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径。在蛋白质转录翻译、细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡以及免疫应答等过程中发挥重要作用。该系统由泛素、泛素活化酶、泛素连接酶、泛素结合酶、去泛素化酶以及26S蛋白酶体组成。26S蛋白酶体由19S的帽子和20S蛋白酶体共同组成。20S蛋白酶体是一个由四个环组成的桶形复合体,两个外环由α亚基组成,两个内环由β亚基组成,形成中央蛋白水解室。β环由β1,β2,β5三个亚单位组成,是20S蛋白酶体的催化活性中心,它们在所有细胞中组成型表达。当细胞受到干扰素（Interferon,IFN）-γ、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-a、炎症反应和氧化应激等刺激后,β1,β2,β5分别被β1i[low molecular mass polypeptide（LMP）2]、β2i[multicatalytic endopeptidase complex-like（MECL）-1]和β5i（LMP7）取代,形成免疫蛋白酶体。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更高的糜蛋白酶样活性和更强的处理、呈递抗原的能力。越来越多的证据表明,免疫蛋白酶体与适应性免疫反应有关,在多种自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用,选择性抑制免疫蛋白酶体亚单位可以改善类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、糖尿病和桥本甲状腺炎等小鼠模型的临床症状。免疫蛋白酶体抑制剂可以防止肾移植后慢性抗体介导的同种异体移植物排斥反应。应用选择性免疫蛋白酶体抑制剂可以靶向治疗具有高免疫蛋白酶体表达水平的细胞,如恶性肿瘤细胞。因此,免疫蛋白酶体抑制剂的临床应用可以降低蛋白酶体抑制的副作用,并改善未来的治疗选择。免疫蛋白酶体的功能研究最初聚焦在抗原加工处理上,它能高效产生有利于与MHC-I类分子结合的抗原肽,被CD8+T细胞识别。随着研究的深入,免疫蛋白酶体更多的功能被报道出来,包括调节T细胞存活、分化、增殖,以及影响相关细胞因子的产生,如白介素（interleukin,IL）-6、IFN-γ、TNF-α、IL-23。然而,免疫蛋白酶体在ITP中的作用及机制尚无相关报道。本研究旨在探讨免疫蛋白酶体亚单位在ITP患者中的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验探讨免疫蛋白酶体抑制剂在ITP治疗中的作用。第一部分免疫蛋白酶体抑制剂对ITP患者的单核/巨噬系统及CD4+T细胞的作用机制研究研究背景:免疫蛋白酶体是蛋白酶体的一种特殊类别,主要表达在造血来源的细胞中,此外,其他非造血来源的细胞当受到IFN-γ、TNF-α等刺激后也可诱导表达免疫蛋白酶体。免疫蛋白酶体具有水解作用的亚基是LMP2、LMP10、LMP7,分别具有类半胱氨酸天冬酶活性、胰蛋白酶活性、糜蛋白酶活性。免疫蛋白酶体能够通过介导蛋白质水解发挥多种功能,如参与调节内在固有免疫和适应性免疫、有效的拮抗氧化应激、清除氧化损害蛋白、保护细胞功能等。随着研究的深入,发现适量的免疫蛋白酶体对于机体具有保护作用,然而过量的免疫蛋白酶体可能对细胞产生危害,导致一些自身免疫性疾病和肿瘤疾病的发生。研究表明,系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症、多发性硬化症等患者的血清或者动物模型的免疫蛋白酶体亚单位表达增加,通过应用相应亚单位抑制剂或者敲除相关基因可改善上述疾病的症状。然而ITP患者免疫蛋白酶体各亚单位表达情况尚不清楚。既往实验证实,免疫蛋白酶体除了处理MHC类限制性表达的蛋白质外,还参与Th细胞分化的调节,通过抑制LMP7或敲除LMP7基因可以抑制Th1和Th17的分化,同时增强Treg细胞的产生。此外,研究发现选择性抑制免疫蛋白酶体对促炎细胞因子的产生有负性调节作用。然而,免疫蛋白酶体抑制剂在ITP中的作用机制尚有待研究。研究目的:1.检测ITP患者及健康人群外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）内免疫蛋白酶体亚基LMP2和LMP7的表达情况。2.探究免疫蛋白酶体抑制剂对纠正ITP免疫细胞功能异常的作用及机制。研究方法:1.纳入ITP患者33例,健康正常对照30例,分别收集外周血10mL,分离PBMCs,利用酶联免疫标记（enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA）测定ITP患者及正常对照LMP2、LMP7的表达,实时定量反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测ITP患者及正常对照PBMCs中LMP2、LMP7的mRNA的相对表达水平。2.磁珠分选ITP患者外周血CD14+细胞,分别加入ML604440（LMP2抑制剂）、ONX-0914（LMP2和LMP7共同抑制剂）或DMSO处理24小时,流式细胞术检测CD16（FcγRⅢ）、CD64（FcγRI）的表达水平。3.巨噬细胞的吞噬功能:磁珠分选ITP患者外周血CD14+细胞,将ML604440或ONX-0914处理后的巨噬细胞与anti-CD41抗体包被的CMFDA（5-chloromethylfluorescein diacetate）标记的血小板共同孵育1小时,利用流式技术测定被吞噬的血小板的平均荧光强度（Mean fluorescent intensity,MFI）,并计算各处理组的吞噬指数。4.体外培养ITP患者PBMCs,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理10h,流式细胞术检测CD69的表达水平;药物处理72h,流式细胞术检测CD25的表达水平。5.磁珠分选ITP患者外周血CD4+细胞,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理72h,流式细胞术检测细胞内IFN-r、IL-17的表达水平。6.体外培养ITP患者PBMCs,分别加入ML604440、ONX-0914或DMSO处理72h,收集细胞裂解蛋白,利用Western-blot检测p-STAT1,STAT1,p-STAT3,STAT3蛋白表达情况。研究结果:1.ITP患者与正常对照相比,免疫蛋白酶体亚单位存在异常表达。1.1 在蛋白水平,ELISA结果显示ITP患者LMP2表达高于正常对照,LMP7表达在两类人群中无明显差异;1.2 在mRNA水平,ITP患者LMP2基因表达水平高于正常对照,LMP7表达水平在两类人群中无明显差异。2.ONX-0914降低ITP患者单核细胞表面激活型Fcγ受体的表达2.1 ONX-0914能够显着降低CD16表达,ML604440对于CD16表达无明显作用;2.2 ONX-0914和ML604440均未影响CD64的表达。3.ONX-0914抑制巨噬细胞吞噬血小板:ONX-0914处理后的巨噬细胞对于血小板的吞噬能力低于对照组,ML604440对于巨噬细胞的吞噬作用无明显影响。4.ONX-0914抑制T细胞活化水平:与对照组和ML604440处理组相比,ONX-0914能够降低T细胞早期活化指标（CD69）和晚期活化指标（CD25）的表达。5.ONX-0914抑制Th1亚群的分化5.1在体外培养条件下,与对照组和ML604440处理组相比,ONX-0914能够显着降低ITP患者的CD4+T细胞向Th1分化5.2 ONX-0914对于Th17亚群分化无明显影响。6.ONX-0914通过降低p-STAT1表达抑制Th1亚群的分化研究结论:1.ITP患者与正常对照相比,免疫蛋白酶体亚单位存在异常表达;2.利用ONX-0914共同抑制LMP2和LMP7可以降低ITP患者单核细胞表面FcγRⅢ（CD16）表达,抑制巨噬细胞吞噬作用,抑制T活化,抑制Th1亚群分化从而促进免疫耐受。第二部分免疫蛋白酶体抑制剂对I TP被动模型的治疗作用及机制研究研究背景及目的:通过第一部分的研究,我们发现免疫蛋白酶体亚单位在ITP患者中存在异常表达,通过体外细胞实验,发现LMP2和LMP7共同抑制剂ONX-0914可以降低激活型FcyR表达,抑制T活化,抑制Th1亚群分化,从而促进免疫耐受。为进一步研究免疫蛋白酶体抑制剂对ITP动物模型是否具有治疗作用,我们构建了ITP被动小鼠模型,给予免疫蛋白酶体抑制剂治疗,通过检测ITP小鼠血小板水平,脾脏单核细胞、肝脏单核细胞表面FcyR表达情况,脾脏M2型巨噬细胞表达以及T细胞的活化水平,进一步探究免疫蛋白酶体抑制剂对ITP的治疗作用并阐明其机制。研究方法:1.通过向C57/BL6小鼠腹腔注射抗CD41抗体构建ITP被动小鼠模型,随机分为对照组、ML604440治疗组、ONX-0914治疗组,对照组给予磷酸缓冲盐溶液（PBS）腹腔注射,治疗组分别给予ML604440（10mg/kg）、ONX-0914（10mg/kg）腹腔注射。隔天检测1次小鼠血常规。2.药物处理ITP小鼠7天后,分离小鼠脾脏细胞和肝脏细胞,利用流式细胞技术检测各组小鼠脾脏单核细胞和肝脏单核细胞表面FcyR表达情况;3.利用免疫荧光技术检测小鼠脾脏M2型巨噬细胞（F4/80+CD163+）表达情况;4.通过眼内眦取小鼠外周血,分离小鼠PBMCs,通过流式细胞技术检测CD4+T细胞表面CD25表达水平;分离小鼠胸腺细胞,检测CD4+T细胞表面CD25表达水平。研究结果:1.与对照组和ML604440治疗组相比,ONX-0914显着提高了 ITP被动模型小鼠外周血血小板水平;2.ONX-0914降低了脾脏单核细胞和肝脏单核细胞表面CD64表达;3.ONX-0914增加了脾脏M2型巨噬细胞表达;4.ONX-0914降低了小鼠外周血和胸腺CD4+T细胞活化水平。研究结论:ONX-0914对于ITP被动模型小鼠具有显着的治疗作用,可抑制单核细胞表面CD64表达,增加M2型巨噬细胞比例,抑制CD4+T细胞活化,从而促进免疫耐受,有望成为ITP患者新的治疗方案。
二、CD28在多发性硬化患者CD8~+淋巴细胞的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD28在多发性硬化患者CD8~+淋巴细胞的表达（论文提纲范文）
（1）B/T淋巴细胞弱化因子在免疫调控和免疫相关疾病中的作用（论文提纲范文）
| 1 B/T淋巴细胞弱化因子在免疫细胞中的作用 |
| 1.1 BTLA与T细胞 |
| 1.2 BTLA与B细胞 |
| 1.3 BTLA与树突状细胞 |
| 2 B/T淋巴细胞弱化因子在免疫相关疾病中的作用 |
| 2.1 BTLA与炎症 |
| 2.2 BTLA与肿瘤 |
| 2.3 BTLA与感染性疾病 |
| 2.4 BTLA与自身免疫性疾病 |
| 3 问题与展望 |
（2）来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 Abbreviations |
| 1 引言 |
| 1.1 肿瘤免疫循环与免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤免疫循环是肿瘤免疫治疗的基础 |
| 1.1.2 肿瘤免疫循环失调限制免疫治疗效果 |
| 1.2 CD28调控抗肿瘤免疫反应和PD-1/PD-L1抗体治疗效果 |
| 1.2.1 CD28共刺激信号促进CD8~+T细胞的激活和效应细胞功能 |
| 1.2.2 CD28共刺激受体的缺失削弱抗肿瘤免疫反应 |
| 1.2.3 CD28共刺激受体的缺失导致PD-1/PD-L1抗体治疗失效 |
| 1.3 来那度胺的发现与发展 |
| 1.3.1 来那度胺的发现过程 |
| 1.3.2 来那度胺具有广谱的抗肿瘤潜力 |
| 1.4 来那度胺对T细胞的共刺激作用 |
| 1.4.1 来那度胺直接杀伤MM和MDS细胞的分子机制 |
| 1.4.2 来那度胺的抗血管生成作用 |
| 1.4.3 来那度胺增强NK细胞免疫反应 |
| 1.4.4 来那度胺具有共刺激T细胞的作用 |
| 1.4.5 来那度胺共刺激T细胞具有免疫治疗潜力 |
| 1.5 CRBN的I391V突变使得小鼠细胞响应来那度胺 |
| 1.6 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3共刺激T细胞 |
| 1.6.1 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3上调IL-2表达 |
| 1.6.2 IKZF1和IKZF3调控T细胞激活 |
| 1.7 本课题拟解决的科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 质粒和感受态细胞 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 常用的溶液配制 |
| 2.1.7 小鼠基因型鉴定引物以及Q-PCR引物 |
| 2.1.8 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 2.2.2 MC38-OVA和B16F10-OVA细胞的构建 |
| 2.2.3 细胞培养常用技术 |
| 2.2.4 小鼠T细胞分离和激活实验 |
| 2.2.5 小鼠T细胞杀伤实验 |
| 2.2.6 在小鼠CD8~+T细胞中敲除Ikzf1和Ikzf3 |
| 2.2.7 小鼠肿瘤模型构建与给药处理 |
| 2.2.8 通过流式细胞术分析脾脏细胞中以及肿瘤中浸润的淋巴细胞 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.10 蛋白热位移实验 |
| 2.2.11 RNA测序以及数据分析 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.13 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2.14 CRISPR文库筛选 |
| 2.2.15 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 来那度胺在体外共刺激Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.1.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 3.1.2 来那度胺促进Crbn~(I391V)小鼠T细胞激活与增殖 |
| 3.1.3 来那度胺增强Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 |
| 3.2 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.2.1 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.2.2 来那度胺抑制MC38-OVA肿瘤生长是由CD8~+T细胞介导的 |
| 3.2.3 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内促进T细胞激活、增殖和分化 |
| 3.3 来那度胺共刺激CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.3.1 来那度胺在CD8~+T细胞中引起的转录组变化与CD28 共刺激信号类似. |
| 3.3.2 来那度胺共刺激缺少CD28受体的Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.3.3 来那度胺共刺激结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.4 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.4.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.4.2 来那度胺部分弥补CD28 缺失造成的T细胞激活、增殖和分化的缺陷 |
| 3.5 来那度胺逆转CD28缺陷导致的PD-1抗体治疗失效 |
| 3.5.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内恢复PD-1抗体的疗效 |
| 3.5.2 来那度胺联合PD-1抗体促进结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞增殖 |
| 3.6 来那度胺通过上调IL-2分泌和调控细胞内在信号共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.6.1 免疫调节药物共刺激CD8~+T细胞与其降解IKZF1和IKZF3的效率相关 |
| 3.6.2 敲除Ikzf1或Ikzf3促进小鼠CD8~+T细胞激活 |
| 3.6.3 来那度胺上调Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞中的IL-2信号 |
| 3.6.4 来那度胺部分通过上调IL-2 分泌共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.7 来那度胺上调CD8~+T细胞中部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.1 来那度胺通过不依赖于IL-2的方式上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.2 在Jurkat T细胞中敲除IKZF1或IKZF3上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.8 上调Notch靶基因表达是来那度胺共刺激CD8~+T细胞的关键分子机制之一 |
| 3.9 阻断IL-2和Notch信号抑制来那度胺与PD-1抗体联合治疗效果 |
| 3.9.1 IL-2 抗体联合Notch抑制剂阻断来那度胺与PD-1抗体在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内的联合治疗效果 |
| 3.9.2 IL-2 抗体联合Notch抑制剂减弱来那度胺联合PD-1抗体促进T细胞激活和分化的能力 |
| 3.10 通过CRISPR文库筛选寻找增强MC38-OVA肿瘤对来那度胺敏感性的基因突变 |
| 3.10.1 CRISPR文库筛选的实验流程和筛选过程中的肿瘤生长变化 |
| 3.10.2 对CRISPR文库筛选的NGS数据进行MAGe CK分析 |
| 3.11 利用Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞筛选具有共刺激T细胞潜力的化合物 |
| 4 结论与意义 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（3）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 急性胰腺炎 |
| 1.1.1 急性胰腺炎概述 |
| 1.1.2 AP的发病机制 |
| 1.2 调节性免疫细胞 |
| 1.2.1 调节性T细胞 |
| 1.2.2 调节性B细胞 |
| 1.2.3 调节性NK细胞 |
| 1.2.4 调节性DC细胞 |
| 1.2.5 调节性巨噬细胞 |
| 1.3 髓源性抑制细胞 |
| 1.3.1 髓源性抑制细胞概述 |
| 1.3.2 MDSC的产生与分化 |
| 1.3.3 MDSC的功能 |
| 1.3.4 影响MDSC功能的因素 |
| 1.3.5 MDSC与疾病 |
| 1.4 TIGIT |
| 1.4.1 耗竭性T细胞概述 |
| 1.4.2 TIGIT概况 |
| 1.4.3 TIGIT在肿瘤中的研究 |
| 1.4.4 TIGIT在移植中的研究 |
| 1.4.5 TIGIT在感染性疾病中的研究 |
| 1.4.6 TIGIT在自身免疫性疾病中的研究 |
| 1.5 IL-37 |
| 1.5.1 IL-37 的调控作用 |
| 1.5.2 IL-37 在疾病中的作用 |
| 1.6 MDSC与 TIGIT的关系及其调控机制 |
| 1.7 展望 |
| 第2章 AP患者中MDSC数量及功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂耗材 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验对象 |
| 2.3.2 样本采集与保存 |
| 2.3.3 梯度密度离心法分离PBMC |
| 2.3.4 细胞计数 |
| 2.3.5 细胞表面染色 |
| 2.3.6 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.7 细胞内染色 |
| 2.3.8 流式分选MDSC细胞 |
| 2.3.9 磁珠分选CD3~+T 细胞 |
| 2.3.10 MDSC抑制实验 |
| 2.3.11 抑制实验检测 |
| 2.3.12 ROS染色 |
| 2.3.13 统计学方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HC、MAP、SAP患者一般信息及临床特点 |
| 2.4.2 MAP、SAP患者外周血中MDSC细胞升高 |
| 2.4.3 SAP患者腹腔积液中MDSC细胞比例较外周血升高 |
| 2.4.4 AP患者外周血中MDSC升高与疾病严重程度相关 |
| 2.4.5 G-MDSC和 M-MDSC与疾病严重程度相关性分析 |
| 2.4.6 SAP患者外周血中MDSC对 T细胞的抑制作用更强 |
| 2.4.7 AP患者与健康对照外周血中 MDSC中 Arg-1、ROS分析 |
| 2.4.8 AP患者与健康对照外周血中MDSC表面CD155 表达分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 TIGIT在 AP患者外周血中表达及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象、入选标准、排除标准及疾病严重程度分级标准 |
| 3.3.2 样本采集与保存 |
| 3.3.3 外周血PBMC的获取 |
| 3.3.4 细胞计数 |
| 3.3.5 细胞表面染色 |
| 3.3.6 PBMC体外刺激实验 |
| 3.3.7 细胞内染色 |
| 3.3.8 流式分选CD3~+TIGIT~+、CD3~+TIGIT~-细胞 |
| 3.3.9 细胞增殖实验 |
| 3.3.10 细胞增殖实验检测 |
| 3.3.11 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AP外周血中CD3~+ T 细胞及CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+ T细胞百分比及数量减少 |
| 3.4.2 AP外周血中CD3~+ T 细胞及CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+ T细胞表面TIGIT表达下降 |
| 3.4.3 SAP患者外周血中CD3~+ T 细胞及其亚群CD4~+、CD8~+ T细胞功能检测 |
| 3.4.4 TIGIT~+T 细胞增殖能力较TIGIT~-T 细胞增殖能力强 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 IL-37 通过影响 CD155 表达影响 MDSC对 T细胞的抑制功能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象、入选标准、排除标准及疾病严重程度分级标准 |
| 4.3.2 样本采集与保存 |
| 4.3.3 外周血PBMC的获取 |
| 4.3.4 细胞计数 |
| 4.3.5 细胞表面染色 |
| 4.3.6 PBMC体外刺激实验 |
| 4.3.7 细胞内染色 |
| 4.3.8 流式分选MDSC细胞及CD3~+TIGIT~+、CD3~+TIGIT~-细胞 |
| 4.3.9 细胞增殖实验 |
| 4.3.10 细胞增殖实验检测 |
| 4.3.11 ELISA法检测血浆IL-37 浓度 |
| 4.3.12 数据分析及统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AP患者血清中及单核细胞中IL-37 表达升高 |
| 4.4.2 IL-37对MDSC表型的影响 |
| 4.4.3 IL-37对MDSC抑制功能的影响 |
| 4.4.4 IL-37对MDSC抑制功能的影响的机制 |
| 4.4.5 MDSC表面CD155 的表达依赖于ROS的表达 |
| 4.4.6 MDSC通过CD155/TIGIT途径抑制T细胞功能 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象、纳入及排除标准 |
| 2.1.1 纳入标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 免疫状态分期 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 观察指标 |
| 2.2.2 标本收集 |
| 2.2.3 T淋巴细胞亚群检测方法 |
| 2.2.4 乙肝五项定量检测方法 |
| 2.2.5 生化指标检测方法 |
| 2.2.6 HBV-DNA检测方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 研究对象的基本临床资料 |
| 3.1.1 不同免疫状态下HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群水平特征 |
| 3.1.2 T淋巴细胞亚群对免疫状态的评估效能 |
| 3.2 HBV-DNA载量对外周血T淋巴细胞亚群水平影响 |
| 3.3 不同HBsAg定量水平下HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群分布特点 |
| 3.4 T淋巴细胞亚群与各临床指标之间的相关性分析 |
| 3.5 T淋巴细胞亚群对打破免疫耐受的评估效能 |
| 3.6 T淋巴细胞亚群对发生e抗原血清学转换的评估效能 |
| 3.7 抗病毒治疗对HBV感染患者T淋巴细胞亚群的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望与不足 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 CD8+T淋巴细胞与HBV感染关系的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 原发性膜性肾病 |
| 1.1.1 原发性膜性肾病的发病机制 |
| 1.1.2 原发性膜性肾病的研究进展 |
| 1.1.3 治疗上的新进展 |
| 1.2 原发性膜性肾病与免疫细胞间的关系 |
| 1.2.1 原发性膜性肾病与Th2细胞 |
| 1.2.2 原发性膜性肾病与B淋巴细胞 |
| 1.2.3 原发性膜性肾病与Th17细胞 |
| 1.2.4 原发性膜性肾病与自然杀伤细胞(natural killer, NK) |
| 1.2.5 原发性膜性肾病与Treg |
| 1.3 MDSC |
| 1.3.1 MDSC的生物分类和功能特征 |
| 1.3.2 MDSC在自身免疫性疾病中的作用 |
| 1.3.3 MDSC在肿瘤中的作用 |
| 1.3.4 MDSC在免疫相关性肾病中的研究进展 |
| 1.3.5 MDSC与其他免疫细胞相互作用 |
| 1.4 Th17与自身免疫性疾病 |
| 1.4.1 Th17细胞的分化和表达调控 |
| 1.4.2 Th17细胞功能 |
| 1.4.3 Th17细胞在自身免疫性疾病中的促炎作用 |
| 1.4.4 Th17细胞在肾脏炎症和肾脏自身免疫性疾病中的作用 |
| 第2章 原发性膜性肾病患者中MDSC通过促进Th17细胞极化促进疾病进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 2.3.2 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) |
| 2.3.3 磁珠分选初始CD4~+ T细胞 |
| 2.3.4 流式分选MDSC |
| 2.3.5 MDSC抑制功能实验 |
| 2.3.6 Th17极化实验 |
| 2.3.7 Th2极化实验 |
| 2.3.8 培养MDSC |
| 2.3.9 细胞外染色 |
| 2.3.10 细胞内IFN-γ/IL-4/IL-17A染色 |
| 2.3.11 Treg染色 |
| 2.3.12 酶联免疫吸附法检测血浆中抗磷脂酶A2受体抗体(PLA2R)IgG |
| 2.3.13 人Th1/Th2/Th17 细胞因子检测 |
| 2.3.14 血浆Arg-1 和IL- 13 检测 |
| 2.3.15 荧光定量PCR |
| 2.3.16 组织染色 |
| 2.3.17 多色免疫组化(Multiplex immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.18 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PMN患者病变肾组织的特征性病理改变 |
| 2.4.2 PMN患者血浆中抗PLA2R抗体含量与尿蛋白定量正相关 |
| 2.4.3 CD3~+ T细胞与CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.4 PMN患者Th2反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.5 PMN患者外周血Th1细胞比例下调 |
| 2.4.6 PMN患者外周血Treg细胞比例下调 |
| 2.4.7 PMN患者外周血MDSC及亚群数量显着增加并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.8 PMN患者的MDSC具有更强的抑制自体初始CD4+ T细胞增殖的功能 |
| 2.4.9 PMN患者Th2比例增加与MDSC增加正相关 |
| 2.4.10 体外IL -6 和IL-10 增强MDSC抑制Th2分化的能力 |
| 2.4.11 IL-17~+ 细胞和CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.12 PMN患者Th17反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.13 PMN患者Th17反应与MDSC正相关 |
| 2.4.14 MDSC以Arg-1 依赖的方式促进Th17细胞分化 |
| 2.4.15 PMN 患者血浆 Arg-1 含量增加并与疾病活动度相关 |
| 2.4.16 IL-6 和IL-10 促进MDSC分泌Arg-1 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 去除MDSC缓解PMN模型小鼠的肾脏损伤 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 膜性肾病小鼠模型的构建及GEM治疗 |
| 3.3.2 PBMC的分离 |
| 3.3.3 背部和腋窝淋巴结细胞分离 |
| 3.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 3.3.5 流式检测MDSC |
| 3.3.6 Treg细胞内染色 |
| 3.3.7 Th1/2/17 细胞内染色 |
| 3.3.8 荧光定量PCR |
| 3.3.9 小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率的测定 |
| 3.3.10 小鼠血清尿素氮测定 |
| 3.3.11 肾组织病理染色 |
| 3.3.12 肾脏透射电镜制备 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型 |
| 3.4.2 PMN小鼠MDSC及其亚群比例增加 |
| 3.4.3 GEM可有效去除小鼠外周血中MDSC |
| 3.4.4 去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤 |
| 3.4.5 去除MDSC减弱PMN小鼠Th17免疫反应 |
| 3.4.6 去除MDSC减弱PMN小鼠Th2免疫反应 |
| 3.4.7 去除MDSC增强PMN小鼠Th1免疫反应 |
| 3.4.8 去除MDSC增加PMN小鼠Treg比例 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（8）低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 一、附图 |
| 二、附表 |
| 三、附加图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 英文论着Ⅰ |
| 英文论着Ⅱ |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参与学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文正文 |
| 第一部分: 免疫性血小板减少症中骨髓T细胞的转录组图谱构建及亚群特征研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: T细胞免疫检查点单核苷酸多态性与免疫性血小板减少症相关性研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 补充图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文及参加学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文正文 |
| Part Ⅰ: Construction and Characterization of the Transcriptome Map of Bone Marrow T Cells in Immune Thrombocytopenia |
| Abstract |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Figures |
| Tables |
| References |
| Part Ⅱ Immune Checkpoint-Related Single Nucleotide Polymorphisms Are Associated with Immune Thrombocytopenia |
| Abstract |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Figures |
| Tables |
| Supplementary Materials |
| References |
（10）免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分：免疫蛋白酶体抑制剂对ITP患者的单核/巨噬系统及GD4+T细胞的机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分：免疫蛋白酶体抑制剂对ITP被动模型的治疗作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
| 外文论文Ⅰ-已发表 |
| 外文论文Ⅱ |
四、CD28在多发性硬化患者CD8~+淋巴细胞的表达（论文参考文献）
- [1]B/T淋巴细胞弱化因子在免疫调控和免疫相关疾病中的作用[J]. 宁召臣,王晓彤,熊化保. 中国生物化学与分子生物学报, 2021(11)
- [2]来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究[D]. 耿陈露. 浙江大学, 2021(01)
- [3]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [4]白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究[D]. 丁黎莉. 吉林大学, 2021(01)
- [5]慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义[D]. 徐清浪. 南昌大学, 2021(01)
- [6]髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展[D]. 李会敏. 吉林大学, 2021(01)
- [7]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [8]低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究[D]. 韩盼盼. 山东大学, 2021(11)
- [9]ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究[D]. 王姝文. 山东大学, 2021(10)
- [10]免疫蛋白酶体抑制剂诱导ITP免疫耐受机制研究[D]. 杜圣红. 山东大学, 2021(11)