一、肺癌中金属硫蛋白的表达及其与细胞增殖、凋亡的关系（论文文献综述）
方世旭[1]（2021）在《PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究》文中研究表明目的:通过生物信息学及细胞实验验证PAQR3在非小细胞肺癌顺铂敏感株及顺铂耐药株的表达差异。通过实验探索PAQR3对非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞增殖,迁移,凋亡及顺铂耐药的影响,并初步探讨该影响机制是否与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。方法:1.在GEO数据库中搜索基因芯片,筛选A549细胞及A549/DDP细胞中的差异表达基因,并选出存在差异表达的基因PAQR3进行研究。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中检索PAQR3在肺癌中的表达水平与患者预后的相关性。3.通过蛋白印迹（Western Blot,WB）及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-q PCR）检测A549及A549/DDP细胞中PAQR3的表达水平。其次,用带有PAQR3高表达及低表达的慢病毒转染A549/DDP细胞,构建A549/DDP细胞的PAQR3高表达稳定转染细胞株（oe-PAQR3）、高表达对照组（oe-NC）、低表达稳定转染细胞株（Si-PAQR3）、低表达对照组（Si-PAQR3）。与A549/DDP细胞对比,MTT实验检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,克隆形成实验检测单个细胞的增殖能力,MTT实验检测细胞的顺铂耐药,流式细胞检测术检测细胞的周期及凋亡情况。4.WB实验检测Ras/Raf/MEK/ERK信号级联中相关信号蛋白改变情况,探索该信号通路在PAQR3逆转顺铂耐药所发挥的作用,检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3。同时,检测MDR1、MRP1、γ-H2A.X及LRP1等DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。结果:1.在GEO数据库中筛选得到A549及A549/DDP差异表达的芯片数据集（GSE108214）,通过GEO2R在线分析软件,与A549细胞对比,PAQR3基因在A549/DDP中呈低表达（Log FC=-0.955）,差异有统计学意义（P<0.001）。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中,检测到965例患者为PAQR3低表达患者,960例患者为PAQR3高表达患者,生存预后的值分别为:总生存期（Overall Survival,OS）的危险比（Hazard Ratio,HR）为0.87,95%置信区间（Confidence Interval,CI）为0.76-0.98,P<0.05;首次疾病进展期（First Progression,FP）的HR为0.81,95%CI:0.67-0.98,P<0.05,后进展生存期（Post Progression Survival,PPS）的HR为0.85,95%CI:0.66-1.1,P=0.22。提示低表达PAQR3与不良的癌症预后显着相关。3.WB及RT-qPCR结果显示,与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞的表达量显着下调（P<0.05）。4.细胞功能实验结果显示,高表达PAQR3可抑制A549/DDP细胞的增殖、迁移和克隆形成,促进A549/DDP细胞凋亡,阻滞细胞从G1期向S期转变。相反,低表达PAQR3可促进A549/DDP细胞增殖、迁移和克隆形成,阻止细胞凋亡,促进细胞由G1向S期转变。5.MTT实验结果显示,A549细胞顺铂药物半数抑制浓度（50%of Inhibiting Concentration,IC50）为6.314μg/m L,A549/DDP细胞的IC50为21.49μg/m L,耐药指数为3.403。与A549/DDP细胞相比,构建了过表达的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性显着增加,oe-NC的IC50为21.84μg/m L,oe-PAQR3组的IC50为5.257μg/m L,耐药指数为4.1544,差距有统计学意义。与Si-NC组相比,Si-PAQR3组的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性下降,Si-NC的IC50为23.5μg/m L,Si-PAQR3组的IC50为47.56μg/m L,耐药指数为0.4941,差异有统计学意义（P<0.01）。6.WB实验结果显示,高表达PAQR3可下调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路而提高A549/DDP细胞对顺铂敏感性,低表达的PAQR3可上调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。同时,高表达PAQR3可上调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达,促进细胞凋亡达到逆转顺铂耐药的效果。低表达PAQR3可下调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,上调Bcl-2的表达,使细胞凋亡受阻,增强细胞对顺铂的耐药性。高表达PAQR3可上调MDR1、MRP1、γ-H2A.X,提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达PAQR3可下调MDR1、MRP1,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论:1.与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞显着低表达,PAQR3高表达可增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达的PAQR3可增加A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。2.PAQR3可能通过阻滞Ras/Raf/MEK/ERK通路及下调MDR1,MRP1,γ-H2A.X蛋白等逆转A549/DDP对顺铂的耐药。可能通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3信号通路阻止A549/DDP细胞的增殖,迁移及克隆形成,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。
肖攀[2]（2021）在《褪黑素对镉致胎盘滋养层细胞氧化损伤的挽救作用研究》文中研究指明镉（Cadmium,Cd）是环境中毒性最强的重金属元素之一,具有蓄积性强和毒性作用持久的特点。大量流行病学研究数据证实,Cd蓄积人体后可对诸多组织器官造成损害,对妊娠期妇女而言,Cd尤易蓄积于胎盘,破坏胎盘的发育和功能,导致胎儿发育缓慢甚至流产。褪黑素（Melatonin,MLT）是由哺乳动物松果体分泌的一种胺类激素,具有广泛的生理作用和很强的抗氧化潜力,可动员细胞内抗氧化酶系统,缓解机体所受氧化应激损伤。本研究以人胎盘滋养层HTR-8/SVneo细胞为模型,探究MLT对Cd致HTR-8/SVneo细胞氧化应激损伤的挽救效果,为探索MLT在防治Cd中毒病的临床应用上提供研究基础。实验结果如下:1.MTT实验结果表明,MLT可抑制CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞活性降低;光学显微镜观察发现MLT可修复CdCl2对HTR-8/SVneo细胞造成的损伤,使细胞形态逐渐恢复;透射电镜观察HTR-8/SVneo细胞超微结构发现,MLT减轻了CdCl2导致的线粒体基质密度降低和内膜上的嵴断裂,同时缓解了CdCl2导致的细胞胞质空泡化、细胞核染色质凝聚和核固等现象;此外,MLT对CdCl2致小鼠胎盘充血、细胞坏死和核碎裂具有一定的修复作用。2.荧光染色和流式细胞术检测表明,MLT抑制了CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞内ROS水平升高;通过检测细胞内抗氧化酶活性发现,MLT缓解了CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞内SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性降低,抑制CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞内脂质过氧化水平升高;表明MLT抑制了CdCl2造成的细胞内ROS水平升高,保护了抗氧化系统,并对CdCl2诱导的细胞脂质过氧化损伤具有抑制作用。3.JC-1荧光染色和流式细胞术检测结果表明,MLT可抑制CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞内线粒体损伤和线粒体膜电位下降;彗星实验结果表明,MLT可缓解CdCl2引起HTR-8/SVneo细胞内DNA损伤;流式细胞术检测发现,MLT对CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞G0/G1期周期阻滞具有缓解作用;Hoechst 33342染色和流式细胞术检测发现,MLT减轻了CdCl2导致的细胞核内染色质凝聚和核碎裂等凋亡表征,降低了细胞凋亡率。Western Blot实验结果显示,其作用机理可能是MLT上调抑制凋亡蛋白Bcl-2表达,并减少促凋亡蛋白Bax表达,从而抑制了CdCl2激发的凋亡执行分子caspase-3活化,最终抑制Cd导致的细胞凋亡。结论:MLT对Cd诱导的HTR-8/SVneo细胞氧化应激损伤具有一定的挽救作用,其分子机制可能与MLT可上调抑制凋亡蛋白Bcl-2表达,减少促凋亡蛋白Bax表达,抑制CdCl2激发的凋亡执行分子caspase-3的活化相关。本研究为探索MLT治疗Cd中毒引起的胎盘损伤及流产等临床病症奠定研究基础,在指导Cd中毒干预的生产实践中有着一定的现实意义。
吕美怡[3]（2021）在《姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响》文中研究指明目的:通过研究姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin蛋白表达的影响,为姜黄素应用于黏液表皮样癌的临床治疗提供实验依据。方法:实验以黏液表皮样癌MEC-1细胞株为研究对象,复苏后进行常规体外培养,取对数生长期细胞进行实验。实验组为姜黄素组,并设立对照组（含0.1%DMSO的PBS液）。（1）采用CCK-8法检测各浓度姜黄素（5、10、20、40、80μmo1/L）分别作用于MEC-1细胞（12h、24h、36h）后的增殖抑制率。将实验数据进行整理,分析,并运用SPSS软件计算出姜黄素24h的IC30浓度值,筛选低于IC30的姜黄素浓度5、10、20μmo1/L作为后续实验浓度。（2）Transwell侵袭实验测定各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24 h后,MEC-1细胞体外侵袭能力情况。（3）实时定量PCR检测各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24h后,MMP-9、CD44、E-cadherin的mRNA表达水平。（4）Western blot分别检测各浓度姜黄素（5、10、20μmo1/L）作用于MEC-1细胞24h后,MMP-9、CD44、E-cadherin的蛋白表达水平。结果:（1）姜黄素作用12h、24h、36h后,随着姜黄素浓度的增加,黏液表皮样癌MEC-1细胞增殖抑制率逐渐升高（P<0.05）,姜黄素呈浓度依赖性抑制MEC-1细胞增殖。同浓度姜黄素作用下,其对MEC-1细胞的增殖抑制作用,随时间的延长而增强（P<0.05）,呈时间依赖性。（2）姜黄素作用MEC-1细胞24h后,姜黄素各组穿过微孔膜的MEC-1数目与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）,姜黄素可抑制体外培养MEC-1细胞的侵袭能力。一定浓度范围内,随着姜黄素作用浓度增加,其对MEC-1细胞侵袭抑制作用逐渐增强,呈浓度依赖性。（3）实时定量PCR检测结果发现,姜黄素作用24h后的MEC-1细胞,随着姜黄素作用浓度增加,细胞中MMP-9mRNA、CD44 mRNA的相对表达量逐渐降低（P<0.05）,E-cadherin mRNA的相对表达量逐渐升高（P<0.05）。（4）Western blot检测结果发现姜黄素作用MEC-1细胞24h后,随着姜黄素浓度的增加,MEC-1细胞侵袭转移相关蛋白MMP-9、CD44蛋白的表达量逐渐降低（P<0.05）,E-cadherin的表达量逐渐升高（P<0.05）。结论:（1）姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞的增殖具有抑制作用,并在一定范围内呈时间、浓度依赖性。（2）在一定浓度范围内,姜黄素可以抑制体外培养的MEC-1细胞的侵袭能力,并呈浓度依赖性。（3）姜黄素抑制MEC-1细胞侵袭转移的作用机制,可能与下调MMP-9、CD44及上调E-cadherin的蛋白表达水平有关。
孙荣蔚[4]（2021）在《双氢青蒿素抑制头颈部肿瘤的药效研究》文中研究表明背景:头颈部肿瘤是最常见的恶性肿瘤之一,具有高度恶性和广泛侵袭等特点,因此复发和致死率较高。手术和放疗是早期和局部晚期头颈部肿瘤治疗的主要方式,同步化疗方案首选顺铂（Cisplatin,DDP）,或者西妥昔单抗联合放疗。EGFR在头颈部肿瘤中过度表达,与总生存率和无进展生存率低相关。西妥昔单抗是目前FDA唯一批准的头颈部肿瘤靶向药物,但现有的试验结果还不足以替代标准放化疗的地位。顺铂作为头颈部肿瘤的一线用药,其内在耐药性和获得性耐药相对普遍,并且伴随较为严重的毒副作用。顺铂产生耐药是多因素作用的结果,主要涉及药物蓄积、代谢、DNA损伤修复等多个环节。近年研究者发现信号转导和转录激活因子 3（Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）在顺铂耐药中发挥重要作用,因此STAT3可能是头颈部肿瘤潜在的治疗靶点。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）是疟疾一线用药,高效安全,临床应用广泛。除了抗疟、抗吸血虫病,已证实在多种类型肿瘤细胞中有较显着的抑制作用。实验室前期研究发现DHA是很好的STAT3抑制剂,在非小细胞肺癌中可以抑制EGFR靶向药诱导激活的STAT3,起到增敏靶向药的作用。目的:探讨DHA作为STAT3抑制剂在头颈部肿瘤中应用的可能性:1.明确DHA抑制顺铂引起的STAT3激活,增强顺铂抗头颈部肿瘤药效;2.探索DHA联合EGFR小分子抑制剂奥希替尼抑制头颈部肿瘤的联合药效。方法:采用MTT、Annexin V-PE/7AAD凋亡检测法和流式PI周期检测法研究DHA对头颈部肿瘤细胞的影响,并通过Western Blot和q-PCR分别检测相关蛋白的表达情况及mRNA水平表达情况;利用公共数据库进行生物信息学分析头颈部肿瘤STAT3特性,并且通过siRNA靶向干扰STAT3,进一步探究STAT3在头颈部肿瘤中的作用;构建HNSCC细胞异种移植瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）和人源肿瘤组织异种移植模型（Patient-derivedtumorxenograft,PDX）,体内验证DHA及其与顺铂、奥希替尼分别联用时的作用。结果:DHA抑制HNSCC三种细胞系的增殖、凋亡,且呈浓度依赖性,同时可以将细胞阻滞于G0/G1期,伴随S期的减少;DHA可以抑制组成型和诱导型（IL-6和DDP诱导）的STAT3的磷酸化。公共数据库分析结果显示头颈部肿瘤中STAT3高表达,且与患者无病生存期相关;利用siRNA靶向干扰STAT3后,与DDP单药组相比,可以进一步诱导细胞凋亡;将STAT3潜在抑制剂DHA与DDP联合,联合组可以显着抑制HNSCC细胞增殖,体内CDX和PDX模型实验中联合组肿瘤体积明显低于对照组;H&E染色发现,PDX模型组中小鼠肿瘤出现大量肝脏转移,DDP单药组对转移灶抑制作用不明显,DHA联合顺铂组可以减轻肝脏转移;血生化指标也显示DDP组肝功能指标异常升高,DHA联合顺铂组可以改善这种情况。DHA与奥希替尼联用时也可以进一步抑制HNSCC细胞增殖,同时DHA可以抑制与奥希替尼耐药相关的激酶活性,如STAT3、MET和AXL等,但不会影响奥希替尼对头颈部肿瘤细胞EGFR的抑制作用;体内药效实验结果显示,与对照组相比,联合组可显着抑制头颈部肿瘤生长。结论:DHA可以通过STAT3抑制HNSCC细胞增殖,将细胞阻滞于G0/G1期,并伴随S期的减少,进而影响细胞活力,诱导细胞凋亡;通过靶向干扰STAT3,可以增强头颈部肿瘤细胞对顺铂的敏感性,说明STAT3与头颈部肿瘤的发生发展甚至化疗耐药有密切联系;DHA与DDP联合可以进一步增强其对HNSCC细胞的凋亡诱导作用,且体内实验CDX和PDX模型也验证了这一协同增敏情况。本课题也考察了 DHA联合ERFR小分子抑制剂奥希替尼应用于头颈部肿瘤的可能性,二者可以进一步抑制与奥希替尼耐药相关的激酶活性,延缓耐药,体内实验结果表明与对照组相比,联合组可显着抑制头颈部肿瘤生长,二者具有协同增敏的作用。
白思特[5]（2021）在《miR-152靶向NCAM1调节肺腺癌顺铂敏感性体外实验研究》文中提出目的:探讨miR-152靶向NCAM1调节肺腺癌顺铂敏感性,为临床上解决肿瘤耐药问题提供理论依据。方法:取对数生长期A549/DDP和A549细胞、A549/ADM细胞,加入不同浓度顺铂培养48h,采用MTT法检测顺铂对A549和A549/DDP细胞活性增殖的影响,运用Graphpad Prism 8.0软件计算IC50值。分别将miR-152-3p mimics/inhibitor和过表达NCAM1转染进A549细胞中,将转染miR-152-3p mimics/inhibitor A549细胞分为（1）Control组（2）Mimics NC组（3）miR-152-3p mimics组（4）inhibitor NC组（5）miR-152-3p inhibitor组。同时将转染NCAM1细胞分为（1）Control组（2）OE-NC组（3）OE-NCAM1组,通过TRANSWEL实验检测各组细胞侵袭能力。通过基因干扰敲降NCAM1表达,将通过质粒转染A549和A549/DDP细胞分为（1）Control组（2）ox-NC组（3）ox-NCAM1组（4）sh RNA-NC组（5）sh-NCAM1组。通过MTT法检测肺腺癌对顺铂敏感性的改变;通过Quantitative-RT-PCR检测NCAM1基因m RNA的表达;Western Blot检测NCAM1蛋白表达水平。结果:通过增加顺铂浓度（分别取0、500、800、1000ng/ml）,在24小时检测3种不同细胞株增殖率我们可以发现:相较于其他2种细胞株而言,A549/DDP顺铂耐药株的细胞存活率最高;顺铂对A549/DDP顺铂耐药株细胞的增殖率明显高于A549细胞、A549/ADM阿霉素耐药株细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。计算顺铂对A549在24h的IC50=38.49μg/m L。TRANSWELL实验通过检测酶标仪（490nm）OD值间接计数细胞,通过Image J计数侵袭细胞发现mimics NC组与miR-152-3P mimics组、miR-152-3P inhibitor组与inhibitor NC组比较,miR-152-3P mimics组和inhibitor NC组侵袭细胞数量明显减少,差异有统计学意义（P<0.001）。OE-NCAM1组与OE-NC组比较,OE-NCAM1组侵袭细胞数量明显增加,差异有统计学意义（P<0.001）。通过MTT法检测在不同浓度顺铂（1000、2000、3000、4000、5000ng/m L）中miR-152-3p、NCAM1对A549和A549/DDP细胞活性增殖能力,以Control组作为对照,miR-152-3p组中miR-152-3P Mimics、miR-152-3P Inhibitor与Control组相比较,增殖能力下降,差异有统计学意义（P<0.05）;同样在A549和A549/DDP细胞中,ox-NCAM1（过表达NCAM1）与Control组相比较,增殖能力上升,差异有统计学意义（P<0.05）;sh-NCAM1（敲降NCAM1）与Control组相比较,增殖能力下降,差异有统计学意义（P<0.05）。Quantitative-RT-PCR检测NCAM1 m RNA表达,mimics NC与miR-152-3p mimics相比较,NCAM1表达明显上升（P<0.05）。通过Western blot检测,miR-152-3p mimics与mimics NC相比较,miR-152-3p mimics蛋白水平明显降低（P<0.01）,inhibitor NC与miR-152-3p inhibitor相比较,inhibitor NC蛋白水平明显降低（P<0.001）。结论:miR-152-3p mimics能够下调NCAM1的表达,抑制A549细胞的侵袭能力,降低顺铂耐药性。
金延玲[6]（2021）在《乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究》文中进行了进一步梳理肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要因素,目前对于肿瘤转移的分子机制仍未被阐明。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是脱离于肿瘤原发部位和远处转移灶进入血液中的肿瘤细胞,在远处靶器官滞留形成肿瘤转移灶。循环肿瘤细胞在血道转移中扮演了重要角色,研究循环肿瘤细胞生物学特性对于阐明肿瘤转移分子机制至关重要。目的:本课题以乳腺癌循环肿瘤细胞和黑色素瘤循环肿瘤细胞作为研究对象,体内外实验研究循环肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移、化疗药物敏感性和血液中的存活情况等生物学特性,探讨循环肿瘤细胞在血液中存活的机制;进一步阐明循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移中的作用和相关分子机制。方法:1.4T1乳腺癌细胞建立乳腺癌原位肿瘤模型,B16黑色素瘤细胞建立黑色素瘤实验性肺脏转移模型;Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,并命名为4T1-CTCs和B16-CTCs;分别用免疫组化染色、RT-PCR检测上皮标记物和体内致瘤实验鉴定CTCs。蛋白质免疫印迹法检测CTCs中E-cadherin和Vimentin表达,流式细胞术检测CTCs上皮标记物Ep CAM和间叶标记物Vimentin阳性率,鉴定CTCs EMT不同表型。2.MTT实验和细胞克隆形成实验检测CTCs增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测CTCs周期分布情况;蛋白质免疫印迹法检测CTCs周期相关蛋白CDK6表达;体内致瘤实验检测CTCs生长情况;免疫组织化学方法检测组织中Ki-67表达情况;MTT法检测CTCs对化疗药物敏感性。3.划痕实验和Transwell迁移实验检测CTCs迁移能力;Transwell侵袭实验检测CTCs侵袭能力;激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞CTCs骨架蛋白F-actin分布情况;肺脏转移实验检测CTCs肺转移情况。4.悬浮培养和流体剪切力处理细胞后检测细胞EMT标记物（E-cadherin,Ep CAM和Vimentin）表达情况。5.定量iTRAQ蛋白组学分析乳腺癌CTCs差异蛋白,使用GO数据库、KEGG数据库和String网站进行生物信息学分析;Kaplan-Merier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）分析MT2与乳腺癌患者预后之间的关系;String数据库在线分析MT2与凋亡自噬相关蛋白之间的相互作用,Gene MANIA数据库分析MT2与凋亡相关信号通路相关蛋白之间的相互作用。6.流式细胞术检测CTCs血液存活情况、细胞失巢凋亡抵抗能力;剪切力诱导凋亡实验检测细胞对流体剪切力抵抗情况;Transwell趋化外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）实验检测细胞对CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞的趋化能力;流式细胞术检测细胞表面免疫逃逸相关蛋白PD-L1和CD47表达。7.蛋白质免疫印迹方法和细胞免疫组化方法检测CTCs中MT2表达水平;慢病毒干扰CTCs MT2蛋白,蛋白质免疫印迹方法检测慢病毒干扰效率、凋亡相关蛋白caspase-3和自噬相关蛋白LC3 I及LC3 II;流式细胞术检测PI阳性细胞百分比。结果:1.分离和鉴定不同EMT表型的4T1乳腺癌CTCs:建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型30天,心脏采血后,使用Ficoll密度梯度离心分离血液中CTCs,从18只小鼠血液中分离出以上皮细胞为主的CTCs和以间叶细胞为主的CTCs,本实验中以4T1CTC-1作为上皮细胞为主CTCs的代表,4T1CTC-2作为间叶细胞为主CTCs的代表。（1）通过细胞标记物鉴定4T1乳腺癌CTCs:4T1CTC-1中Ep CAM+Vimenin+细胞占85.8%,4T1CTC-2中Ep CAM-Vimentin+细胞占69.4%;RT-PCR结果显示4T1CTC-1高表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.05或p<0.001）,4T1CTC-2低表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.001）;蛋白质免疫印迹法结果显示4T1CTC-1高表达E-cadherin和Vimentin（p<0.05）,4T1CTC-2低表达E-cadherin而高表达Vimentin（p<0.001）。证实分离的细胞来源于4T1乳腺癌,且具有不同EMT表型。（2）通过皮下成瘤能力鉴定乳腺癌CTCs:体内致瘤实验显示4T1CTC-1和4T1CTC-2均可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示4T1CTC-1和4T1CTC-2形成的肿瘤组织核大深染、异型明显,并且可见病理性核分裂像。皮下致瘤实验表明4T1CTCs具有致瘤能力,4T1CTC-1和4T1CTC-2均为肿瘤来源细胞。2.分离和鉴定B16黑色素瘤CTCs:使用Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,HMB45免疫组化染色B16CTCs阳性;体内致瘤实验显示B16CTCs可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示B16CTCs形成的肿瘤组织核大深染、异型性明显、可见病理性核分裂像。证实分离的细胞来源于B16黑色素瘤。3.CTCs对化疗药物敏感性降低:4T1CTCs表现为对表柔比星化疗药物敏感性降低（p<0.01或p<0.001）,B16CTCs表现为对顺铂化疗药物敏感性降低（p<0.05,p<0.01或p<0.001）。4.CTCs表现为体外增殖缓慢,体内肿瘤生长缓慢:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力均较4T1CTC-1慢（p<0.05,p<0.01或p<0.001）;与4T1原位细胞比较,4T1CTC-1中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力,B16CTCs细胞中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05或p<0.001）。5.CTCs表现为弱的侵袭迁移能力,但具有一定的肺转移能力:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为弱的体外侵袭能力和体内肺转移能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2的体外侵袭迁移能力和体内肺转移能力均较4T1CTC-1强（p<0.01或p<0.001）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs侵袭迁移能力弱（p<0.001）。6.悬浮培养对细胞EMT标记物无明显影响（p>0.05）,流体剪切力可以明显降低细胞上皮标记物E-cadherin和Ep CAM表达（p<0.01或p<0.001）,增加细胞间叶标记物Vimentin表达（p<0.05）。7.定量iTRAQ蛋白组学分析显示:与原位细胞比较,4T1CTC-1中有1483个蛋白下调,791个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与原位细胞比较,4T1CTC-2中有179个蛋白下调,233个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与4T1CTC-2比较,4T1CTC-1中有1473个蛋白下调,1006个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;4T1CTC-1中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在防御反应的正向调节,起始免疫反应的正向调节,41T1CTC-2中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在上皮细胞分化,细胞与细胞之间的连接和细胞对细胞因子刺激的反应。8.乳腺癌CTCs表现为强的血液存活能力:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs在血液中存活细胞数目多,表现为强的血液存活能力（p<0.05）、强的失巢凋亡抵抗能力和流体剪切力诱导凋亡抵抗能力（p<0.01）。9.4T1CTCs具有免疫逃逸表型:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs对CD4T淋巴细胞趋化能力强（p<0.05）,对CD8T淋巴细胞趋化能力弱（p<0.05）;与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs中CD47表达增高（p<0.001）,PD-L1表达无明显差异（p>0.05）。10.4T1CTCs表现为高的基础自噬水平和低的凋亡水平（p<0.05或p<0.01）,且抑制4T1CTCs自噬水平可增加细胞凋亡率,抑制细胞血液存活（p<0.001）。4T1CTCs高表达MT2（p<0.01）,抑制MT2可以降低4T1CTCs自噬水平（p<0.05）、增加凋亡水平（p<0.05）和抑制细胞存活（p<0.001）;抑制MT2联合抑制细胞自噬明显抑制细胞存活（p<0.001）。结论:1.成功分离了4T1乳腺癌CTCs和B16黑色素瘤CTCs。2.4T1乳腺癌CTCs表现为不同EMT表型,提示4T1乳腺癌CTCs具有异质性。3.CTCs表现为对顺铂和表柔比星化疗药物敏感性降低、体外增殖和体内生长缓慢、体外侵袭能力和体内肺脏转移能力弱,但血液存活能力强的生物学特性。4.流体剪切力可诱导CTCs发生EMT。5.定量iTRAQ蛋白组学分析显示不同EMT表型CTCs在蛋白水平和功能富集存在明显差异。6.4T1CTCs在血液中的存活能力与细胞具有强的失巢凋亡抵抗能力、剪切力诱导凋亡抵抗能力和免疫逃逸表型有关,MT2通过调控细胞自噬和凋亡介导CTCs存活。
梁伊灵[7]（2021）在《RNF181在非小细胞肺癌中低表达并抑制肿瘤进展的分子机制研究》文中认为目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤的首要死因,约80%的肺癌病例为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等多种病理类型,约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率很低。寻找调控NSCLC进展的关键因子,揭示其发挥的调控作用及分子机制,将有助于临床对NSCLC的诊断及治疗。RNF181（RING finger protein 181）又称为HSPC238,属于环指蛋白超家族,具有RING型结构域,在胰腺、肝脏、肾脏等组织中广泛表达。RNF181在NSCLC组织中的表达情况及其对肿瘤进展发挥的调控作用及机制尚不明确,本课题旨在研究RNF181对NSCLC进展的调控作用,寻找关键下游信号分子,明确其分子机制。方法通过免疫组织化学染色技术研究RNF181在NSCLC组织中的表达特点及其临床病理意义。在NSCLC细胞株H1299及A549中,分别转染RNF181表达载体或si RNA差异表达RNF181,分别通过MTT实验、Transwell侵袭实验检测RNF181对NSCLC细胞增殖、侵袭能力的调控作用。通过流式细胞技术检测RNF181对NSCLC细胞周期的调控作用。通过Western blot实验筛查检测相关靶点分子及信号通路的表达、活化情况,明确调控作用分子机制。结果我们分别收集了45例肺腺癌及其癌旁组织,30例肺鳞癌及其癌旁组织,通过免疫组织化学染色技术发现NSCLC组织中RNF181主要定位于细胞浆,且表达水平低于癌旁肺组织（肺癌vs癌旁,4.19±2.10 vs 9.39±1.54,P<0.01）,其表达水平与肺癌临床分期（P<0.05）及局部淋巴结转移负相关（P<0.01）在NSCLC细胞系H1299及A549细胞中通过转染质粒或si RNA差异表达RNF181后,经Transwell实验发现:下调RNF181蛋白表达水平后提高了两种细胞的侵袭能力,而过表达RNF181后得到相反的结果,这表明RNF181可抑制NSCLC细胞的侵袭能力。经Western blot实验检测发现:上调RNF181表达水平后,EMT相关蛋白E-cadherin的表达水平增加,而N-cadherin、Snail及Slug的蛋白表达水平下降,下调RNF181表达水平后得到相反结果,这提示RNF181可通过调节EMT过程抑制NSCLC细胞的侵袭能力。MTT实验发现:在A549及H1299细胞中过表达RNF181可抑制细胞增殖能力,而下调RNF181蛋白表达水平后,细胞增殖能力得到回复,同步进行的流式细胞技术检测发现RNF181过表达可阻滞细胞周期于G1/S期。经Western blot实验检测发现RNF181可抑制cyclin D1的表达,而cyclin A2、cyclin B1等细胞周期相关蛋白表达水平无明显变化,这提示RNF181可通过调节细胞周期蛋白抑制NSCLC细胞增殖。随后经Western blot筛查发现RNF181可抑制MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路相关蛋白JNK的磷酸化水平,而ERK,Yap等蛋白的表达及活化水平未见明显变化,这提示RNF181可能通过抑制JNK磷酸化水平抑制NSCLC进展,其具体分子机制尚需进一步深入研究。结论1.RNF181在肺癌组织中相对低表达,其表达水平与肺癌临床病理分期（P<0.05）及局部淋巴结转移负相关（P<0.01）,提示其可能发挥抑制肿瘤进展的作用。2.RNF181可通过调控EMT抑制NSCLC细胞侵袭能力。3.RNF181可通过调节cyclin D1的表达水平阻滞细胞周期于G1/S期,进而抑制NSCLC增殖能力。4.RNF181可能通过抑制JNK磷酸化发挥上述调控作用,进而抑制肿瘤进展。
赵晓龙[8]（2020）在《外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究》文中指出研究背景目前,非小细胞肺癌铂类耐药仍然是造成大部分非小细胞肺癌患者疗效差的的主要原因,然而非小细胞肺癌铂类耐药的具体机制尚未完全明了。铂类耐药是由多种因素造成的,其中外泌体和免疫调控介导的耐药可能发挥重要作用。首先,外泌体是细胞分泌的携带生物活性物质的纳米级囊泡,根据前期研究基础,我们提出外泌体可能通过其携带的碱基切除修复关键基因APE1或某些micro RNA传递耐药性。其次,位于肿瘤细胞上的免疫检查点关键分子程序性细胞死亡受体配体1（PD-L1）和程序性细胞死亡受体（PD-1）结合可以抑制免疫反应,而机体的免疫状态与化疗疗效密切相关,由此我们推测,PD-L1单核苷酸多态性也可能对铂类化疗疗效产生影响。本研究将从以上两个层面对非小细胞肺癌铂类耐药机制进行探索研究,为综合评估非小细胞肺癌患者铂类化疗的有效性,采取相应措施改善治疗效果和预后提供理论依据。研究方法1.采用高速离心和外泌体提取试剂盒收集外泌体。用PKH26对外泌体染色后,激光共聚焦观察其进入细胞内的情况。将带GST标签的APE1纯化蛋白（GST-APE1）与A549细胞共同孵育后,观察细胞内GST-APE1的定位情况。采用CCK-8实验和流式细胞术检测不同处理组细胞在不同浓度顺铂下的存活能力和凋亡率。采用Transwell实验评估细胞侵袭和迁移能力。采用APE1的功能抑制剂处理与不同分组外泌体共同孵育后的A549细胞,观察处理后A549细胞在顺铂中的存活率以及-H2AX蛋白变化情况。选取接受铂类化疗方案治疗的NSCLC患者共136例,对血浆外泌体进行提取和鉴定。采用Western blot和ELISA法检测血浆外泌体APE1表达,采用免疫组化检测组织APE1表达。根据实体肿瘤疗效评价标准,分为铂类化疗应答组（CR+PR）和铂类化疗无应答组（SD+PD）,观察APE1表达水平与患者治疗敏感性的关系。2.采用micro RNA芯片检测顺铂（CDDP）处理后外泌体micro RNA的变化情况。采用mi R-1273a mimic、inhibitor或阴性对照转染A549细胞以构建不同mi R-1273a表达水平的细胞。用CCK-8实验和流式细胞术凋亡分析检测不同表达水平的mi R-1273a对细胞在顺铂中存活能力和凋亡率的影响。将A549细胞与高表达mi R-1273a的外泌体共同孵育,研究高表达mi R-1273a外泌体对细胞在顺铂中存活能力的影响。通过生物信息学方法预测mi R-1273a的靶基因,并用Western blot和q PCR进行验证。选择行铂类化疗方案的非小细胞肺癌患者共85例（其中36例用于国际合作研究）,用于临床疗效评价。RT-q PCR用于检测血浆外泌体micro RNA水平;ELSIA用于检测血浆SDCBP或APE1水平。3.收集281例行铂类化疗方案治疗的非小细胞肺癌患者的血液样本,并提取DNA。251名同期接受健康体检的志愿者作为对照组。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术进行基因型分型。用卡方检验比较不同分组个体的基因型分布情况。用Kaplan-Meier分析和Cox单因素和多因素生存分析评价不同基因型患者的预后情况。研究结果1.成功收集到NSCLC源性外泌体,PKH26染色后可观察到着色的外泌体进入受体细胞内。A549细胞与外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,同时细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。顺铂处理A549细胞后,细胞和外泌体内的APE1表达增高。与高表达APE1的外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。APE1的碱基切除修复功能在外泌体APE1介导的细胞对顺铂敏感性变化中发挥主要作用。在临床样本中,外泌体中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式。与健康对照者相比,非小细胞肺癌患者外泌体APE1高表达。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体APE1的水平明显高于对铂类化疗应答组的患者。2.基因芯片结果显示,与对照组相比,共有276个mi RNAs在顺铂刺激下产生的外泌体(EXOCDDP)中变化>2倍,其中mi R-1273a在这些mi RNAs中的表达差异最为显着。过表达mi R-1273a增强了A549细胞对顺铂的敏感性,外泌体传递mi R-1273a同样可以增强受体细胞对顺铂的敏感性。SDCBP（Syndecan binding protein）可能是mi R-1273a发挥作用的靶点之一。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体mi R-1273a的水平明显低于对铂类化疗应答组的患者。合作项目结果显示,敲低A549细胞APE1后,外泌体中61个mi RNAs发生显着性变化,其中mi R-130b和mi R-200c的变化可能与NSCLC铂类化疗的疗效有关。3.对9个常见位点的PD-L1 SNP进行检测后,发现PD-L1 rs7866740在非小细胞肺癌患者中G等位基因频率明显高于对照组G等位基因频率（P=0.001）。携带G等位基因的个体患NSCLC的风险显着高于携带C等位基因的个体（OR=3.532,95%CI=1.232-10.129）。Kaplan-Meier分析表明,PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的PFS和OS明显低于CC型（P<0.05）;PD-L1 rs822336 GC+CC的OS明显低于GG型（P<0.05）。Cox生存分析显示,携带PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的患者化疗疗效和预后较差（PFS:校正后HR=1.367,95%CI=1.0-1.8,P=0.038;OS:校正后HR=1.402,95%CI=1.0-1.9,P=0.026）。携带PD-L1 rs822336 GC+CC基因型的患者预后较差（校正后HR=1.393,95%CI=1.1-1.8,P=0.021）,但与疗效无显着相关性。研究结论1.铂类药物刺激下NSCLC外泌体APE1增高,高表达APE1的外泌体可以降低受体细胞对铂类药物的敏感性。2.APE1的碱基切除修复功能可能在外泌体APE1介导的铂类化疗耐药中发挥关键作用。3.非小细胞肺癌患者血浆外泌体APE1水平与非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关。4.外泌体mi R-1273a的下降与受体细胞铂类敏感性下降有关。5.非小细胞肺癌患者血浆外泌体mi R-1273a水平与铂类化疗的疗效有关。6.APE1可能通过调控外泌体mi R-130b和mi R-200c水平促进NSCLC铂类耐药。7.PD-L1基因的rs7866740位点与NSCLC易感性有关。PD-L1基因的rs2890658和rs822336位点与NSCLC的预后有关。
许霞青[9]（2020）在《PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国位居第三位仅次于宫颈癌和宫体癌,严重影响人类健康。近年来,ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）抑制剂在卵巢癌的治疗中取得显着成效,开启了小分子抑制剂靶向治疗卵巢癌的大门。目前,PARP抑制剂主要被批准用于BRCA（Breast cancer）突变的卵巢癌患者。然而,随着临床试验数据的累积,研究者发现不论患者是否存在BRCA突变,使用PARP抑制剂Niraparib Rucaparib治疗的卵巢癌患者均能获益,显着改善了患者的无疾病生存期。因此,如何从PARP1（Poly ADP-ribose Polymerase 1）的生物学功能出发理解临床上这一现象成为该领域的研究热点。随着PARP1研究的深入关于它的其他生物学功能也开始受到关注。近年来的研究发现PARP1可以通过激活转录因子、抑制转录因子活性的方式或直接作为转录因子调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的多种生物学功能。本研究通过分析TCGA数据库（The cancer genome atlas）发现PARP1 m RNA高度表达与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+（Estrogen receptor-positive）乳腺癌以子宫体癌患者的无疾病生存期（Progress free survival,PFS）呈显着负相关,并将这四种肿瘤中与无疾病生存期相关的基因进行重合分析,发现91个基因的表达与PARP1 m RNA的高度表达呈负相关。同时,在卵巢癌细胞上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因组芯片检测基因变化,发现13个基因与PARP1的高度表达呈显着负相关。进而将从TCGA数据分析获得的91个基因与芯片分析获得的13个基因进行重合对比分析,发现PARP1蛋白表达与金属硫蛋白-1M（Metallothionein 1M,MT1M）基因转录呈显着负相关,这提示MT1M可能是PARP1调控的靶基因。那么,PARP1是否通过负性调控MT1M,从而调控卵巢癌的哪些生物学行为?金属硫蛋白-1M（MT1M）是半胱氨酸富集的小分子蛋白,属于金属硫蛋白（MT-1）家族成员,特异性结合金属离子,在金属解毒氧化应激保护方面发挥重要作用。近年来研究表明MT1M能够显着抑制多种肿瘤的增殖与转移,如肝细胞癌、甲状腺乳头状癌,是潜在的抑癌基因。考虑到MT1M在肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用,本研究推断PARP1可能通过负性调控MT1M参与肿瘤细胞的增殖与转移。本研究将围绕PARP1负性调控MT1M表达这一生物学现象,考察PARP1负性调控MT1M在卵巢癌增殖与转移中的作用具体的分子机制:（1）分析TCGA数据库中PARP1 m RNA的高度表达与多种肿瘤无疾病进展期的相关性,结合卵巢癌细胞基因芯片的数据,发现PARP1负性调控卵巢癌细胞中MT1M的表达;（2）明确MT1M的表达对卵巢癌细胞增殖与迁移的影响,并寻找PARP1调控MT1M表达的具体分子机制;（3）MT1M的表达在PARP抑制剂抗卵巢癌转移的作用。本研究发现了PARP1新的靶基因MT1M以调控卵巢癌转移的新机制即PARP1通过抑制MT1M表达促进卵巢癌转移,并为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。第一部分PARP1抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）采用TCGA数据库分析在PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌、膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期的相关性;（2）进一步采用Kmplot数据库分析,找到与PARP1 m RNA表达呈负相关性的基因;（3）在非BRCA突变的卵巢细胞OVCAR8上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因芯片检测基因变化,寻找与PARP1表达呈负相关的基因;（4）将TCGA数据库分析出与PARP1表达呈负相关的基因,与卵巢癌细胞OVCAR8中与PARP1表达呈负相关的基因进行重合对比分析,发现了PARP1调控新的靶基因MT1M;（5）在非BRCA突变的卵巢癌SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,采用Western blotting法、荧光实时定量PCR法以Elisa法验证PARP1对MT1M表达的影响。（6）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M,采用SRB实验考察过表达MT1M对卵巢癌细胞增殖的影响;（7）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M或敲除MT1M,采用Transwell实验和划痕愈合实验考察MT1M的表达对卵巢癌细胞迁移的影响;（8）在SKOV3细胞中过表达MT1M,并收集上清作条件培养基,考察MT1M的分泌对卵巢癌细胞迁移的影响;（9）在卵巢癌细胞OVCAR8上过表达PARP1,采用划痕实验考察PARP1的高度表达对卵巢癌细胞迁移的影响;同时在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,采用Transwell实验考察沉默PARP1对卵巢癌细胞迁移的影响。研究结果:（1）PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌等的无疾病生存期呈负相关。而PARP1 m RNA的表达与膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期没有明显的相关性。（2）采用Kmplot数据库分析卵巢癌、子宫体癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌,这四种肿瘤中与PARP1表达呈负相关的基因,发现91个基因与PARP1的表达呈负相关。（3）在卵巢癌细胞OVCAR8上,分析过表达PARP1转录表达显着降低的基因,沉默PARP1转录表达显着增加的基因以给予Olaparib转录表达显着增加的基因,发现13个基因与PARP1的表达呈负相关。（4）对比重合分析TCGA数据库得到的91个基因与卵巢癌细胞OVCAR8基因芯片得到的13个基因,发现了与PARP1表达呈负相关的靶基因-MT1M。（5）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,MT1M的转录表达显着增加,其蛋白表达也显着增加。同时发现敲除PARP1,能够促进MT1M的分泌。（6）过表达MT1M不影响卵巢癌细胞的增殖。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M,通过SRB法检测细胞增殖,结果显示MT1M的高度表达对卵巢肿瘤细胞增殖没有影响。（7）MT1M的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M能够显着抑制卵巢癌细胞的迁移;而敲除MT1M,SKOV3的迁移能力显着增强。（8）MT1M的分泌可影响卵巢细胞的迁移。在SKOV3上,首先过表达MT1M,并收集过表达成功后的细胞上清作为条件培养基,再通过Traswell法发现过表达MT1M的条件培养基可显着抑制SKOV3细胞的迁移。（9）PARP1的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞OVCAR8上,过表达PARP1,通过划痕实验法发现PARP1的高度表达可显着抑制卵巢细胞迁移;而敲除PARP1则明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3的迁移能力。第二部分PARP1抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究研究方法:（1）采用数据库预测分析潜在调控MT1M表达的转录因子,采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默预测的转录因子在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3（Forkhead box 3）;（2）考察FOXP3的表达对MT1M转录表达蛋白表达的影响;（3）采用免疫共沉淀方法,考察PARP1与FOXP3的结合情况;（4）采用检测PAR修饰的实验方法,考察PARP1对FOXP3核糖基化修饰的情况;（5）采用检测PAR修饰的实验方法,考察给予Olaparib对PARP1核糖基化FOXP3的影响;（6）采用核糖基化位点突变的PARP1（Flag-PARP1-E988K）,考察位点突变Flag-PARP1-E988K对FOXP3核糖基化修饰的影响;（7）采用荧光素酶报告基因法,考察PARP1和Flag-PARP1-E988K对FOXP3介导的MT1M转录表达的影响;（8）采用Western blotting实验方法考察在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib和敲除PARP1对FOXP3蛋白表达的影响。研究结果:（1）PARP1通过FOXP3调控MT1M的转录首先,采用数据库预测分析MT1M潜在的转录因子,发现STAT1、STAT3、FOXP3和E2F1等转录因子可能是调控MT1M表达的转录因子,进一步采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默这些转录因子考察其在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3即沉默FOXP3,Olaparib上调MT1M的作用消失。（2）FOXP3调控MT1M的转录表达蛋白表达在SKOV3细胞中过表达FOXP3和敲除FOXP3,采用western blotting和q RT-PCR实验方法考察过表达FOXP3和沉默FOXP3对MT1M转录蛋白表达的影响,发现过表达FOXP3能够显着增加MT1M的转录水平和蛋白水平;而敲除FOXP3则明显下调MT1M的转录蛋白水平。（3）PARP1与FOXP3直接结合。在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用免疫沉淀的方法,发现PARP1与FOXP3之间存在结合。（4）PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（5）Olaprib能够抑制由PARP1介导FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,并给予Olaparib作用6h,采用检测PAR修饰的方法,发现给予PARP抑制剂Olaparib后则抑制PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（6）核糖基化活性突变的质粒Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。同时在293T细胞上,过表达Flag-PARP1-E988K和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。（7）PARP1通过调控FOXP3的核糖基化修饰从而调控MT1M的转录表达。在卵巢癌细胞SKOV3上,过表达Vector、HA-FOXP3、Flag-PARP1、Flag-PARP1-E988K、HA-FOXP3+Flag-PARP以HA-FOXP3+Flag-PARP1-E988K,采用荧光素酶报告基因法,发现HA-FOXP3促进MT1M的转录表达,而PARP1则抑制由FOXP3介导的MT1M的转录表达;PARP1-E988K由于其核糖基化功能缺失不影响由FOXP3介导的MT1M的转录表达。（8）在卵巢癌细胞中,给予Olaparib以沉默PARP1对FOXP3表达的影响在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib,发现FOXP3的蛋白表达随着Olaparib浓度的增加而增加;而在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,则促进FOXP3的蛋白表达。第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中,给予不同浓度的Olaparib,采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响;（2）在卵巢细胞SKOV3和Ca OV3上,给予不同的PARP抑制剂Olaparib、Veliparib和Niraparib,采用划痕愈合实验和Transwell小室法来考察不同的PARP抑制剂对卵巢细胞迁移的影响;（3）采用慢病毒构建MT1M稳定敲除的卵巢癌细胞SKOV3（sh-MT1M）,再给予PARP抑制剂Olaparib,考察MT1M在PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移中的作用;（4）采用尾静脉接种Ca OV3形成转移的裸鼠模型,给予Olaparib,考察PARP抑制剂对卵巢癌细胞转移的影响;（5）采用人源高转移卵巢癌PDX模型,通过腋下接种方式,并给予Olaparib,考察Olaparib对卵巢癌转移的影响,以MT1M在PARP抑制剂抗肿瘤转移中的作用。研究结果:（1）PARP抑制剂可以上调卵巢癌细胞MT1M转录表达以分泌在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8上,给予浓度梯度的Olaparib,Western blotting法和q RT-PCR法检测MT1M的表达分泌,发现Olaparib浓度依赖上调MT1M的转录蛋白表达。同时给予不同的PARP抑制剂,采用Elisa法检测对MT1M分泌的影响,发现这些PARP抑制剂均能促进MT1M的分泌。（2）不同的PARP抑制剂均能明显抑制卵巢癌细胞的迁移在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3,采用划痕愈合实验和Transwell小室法,考察不同抑制剂对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示不同的PARP抑制剂均能显着抑制卵巢癌细胞的迁移。（3）敲除MT1M能够显着抑制PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移的能力构建稳定敲除MT1M的卵巢癌细胞株,在此基础上给予Olaparib作用,采用Transwell法检测对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示,敲除MT1M的卵巢癌细胞的迁移能力明显增强,而在敲除MT1M的卵巢癌细胞中给予Olaparib,发现Olaparib抑制卵巢癌细胞迁移的作用消失。（4）体内动物实验显示Olaparib可以显着卵巢癌转移,并促进MT1M的表达在尾静脉接种Ca OV3卵巢癌转移模型中,H&E染色结果显示Olaparib明显抑制肺内肿瘤转移灶点的形成。采用Elisa法检测血清中的MT1M,发现Olaparib促进MT1M的分泌。在人源高转移卵巢癌PDX模型,Olaparib抑制剂不影响肿瘤的生长。采用包氏固定法以H&E染色结果显示,Olaparib可以抑制卵巢细胞的肺转移。采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对肿瘤内MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响,结果显示Olaparib可以上调肿瘤内MT1M的转录表达以蛋白表达,并促进MT1M的分泌。研究结论:本研究发现PARP1新的靶基因MT1M,且在卵巢癌细胞中PARP1负性调控卵巢癌细胞MT1M的表达;而MT1M的高度表达能够抑制卵巢癌细胞迁移但不影响肿瘤细胞增殖;进一步研究发现FOXP3调控MT1M的表达并参与PARP1负性调控MT1M的转录表达,即PARP1与FOXP3结合使FOXP3发生核糖基化修饰,抑制FOXP3的转录活性,进而抑制MT1M的转录表达。体内动物实验验证了PARP抑制剂Olaparib确实能够抑制卵巢癌细胞的转移,促进肿瘤细胞表达MT1M。本研究不仅发现了调控卵巢癌转移的新机制,也为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。
王君宇[10]（2020）在《鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究》文中研究说明流行病学研究表明,大气中PM10浓度升高与人群心肺疾病风险增加密切相关。PM10携带的大量有毒有害物质,极易通过上呼吸道纤毛和粘膜物理阻隔,在支气管和肺泡中直接加深和沉积,引发或加重各类心肺系统疾病,严重影响人体健康。鹰嘴豆芽素A（Biochanin A,BCA）作为一种豆科植物中的天然异黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物活性,在干预PM10诱导的急性肺细胞损伤中的作用越来越受到关注,但其分子作用机制尚不完全清楚。本论文采集天津市大气PM10颗粒物并分析其粒径、成分、形态,结果表明PM10颗粒物的当量直径集中在10μm左右,总体动力学直径在0～100μm范围内。PM10来源广泛,生物、化学成分组成较为复杂,主要由可溶性盐离子(F-、Cl-、NO2-、SO42-、NO3-、PO4-)、重金属以及放射性等元素、有机物（芳香烃及其含氧衍生物、支链/正构烷烃、硅烷衍生物、酮类等）和生物组分组成。通过使用美国动物研究数据库（Tox Ref DB）、体外高通量筛选数据库（Tox Cast DB）和文献检索-生物信息学系统分析明确了PM10中致毒成分与呼吸系统损伤/潜在的关键分子靶点之间的显着相关性;揭示了PM10中致毒成分和预防与治疗PM10致呼吸系统损伤的信号途径及分子靶点:钙离子、丝裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇信号通路为PM10致呼吸系统损伤的主要途径,提示这些通路中的核心蛋白有极大可能性可作为预防与治疗PM10所致损伤的分子靶点。以BCA为研究对象,基于人源支气管正常上皮细胞,构建PM10暴露-BCA保护作用体外细胞模型,通过测定炎症反应、氧化应激等相关生理指标发现,PM10极显着诱发胞内ROS激增,降低胞内CAT水平,引发胞内LDH外流以及脂质过氧化作用现象,极显着上调炎症因子IL-6,IL-8,TNFα基因表达及其释放,促进炎症介质NO的合成及其对应的关键合成酶基因i NOS的转录,而BCA（5、10、20、40μM）和PI3K/AKT靶蛋白抑制剂LY294002（10μM）均可有效干预PM10引起的上述变化,表现出良好的抗炎抗氧化活性。此外,围绕PI3K/AKT信号通路,利用Western Blot和q RT-PCR等分子生物学手段初步揭示了BCA在缓解PM10致急性肺细胞损伤中的调节PI3K/AKT进程作用机制:PM10暴露会极显着影响到胞内生物标记蛋白、PI3K/AKT、DNA碱基修复通路的正常运作,而BCA则可能通过靶向作用于PI3K蛋白在细胞内膜的活化过程,干预XRCC1和PTEN蛋白对PI3K/AKT的调控及PI3K对下游AKT蛋白表达及其磷酸化,进而对下游信号分子产生一定程度的调控以发挥抗损伤功能活性。
二、肺癌中金属硫蛋白的表达及其与细胞增殖、凋亡的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺癌中金属硫蛋白的表达及其与细胞增殖、凋亡的关系（论文提纲范文）
（1）PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:PAQR3在A549细胞中的表达与A549细胞顺铂耐药的相关性 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌多药耐药研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）褪黑素对镉致胎盘滋养层细胞氧化损伤的挽救作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 Cd污染现状和对机体损伤 |
| 1.1 Cd的理化特性和来源 |
| 1.2 Cd的限量标准和污染现状 |
| 1.3 Cd的吸收、生物转化和代谢 |
| 1.4 Cd对动物体和人体的毒害作用 |
| 1.4.1 Cd对消化系统的影响 |
| 1.4.2 Cd对呼吸系统的影响 |
| 1.4.3 Cd对内分泌系统的影响 |
| 1.4.4 Cd对运动系统的影响 |
| 1.4.5 Cd对心血管系统的影响 |
| 1.4.6 Cd对神经系统的影响 |
| 1.4.7 Cd对泌尿系统的影响 |
| 1.4.8 Cd对免疫系统的影响 |
| 1.4.9 Cd对生殖系统的影响 |
| 1.4.10 Cd对细胞能量代谢的影响 |
| 2 Cd损伤挽救研究 |
| 2.1 Cd对机体危害机理研究 |
| 2.2 Cd损伤挽救研究 |
| 2.2.1 螯合剂 |
| 2.2.2 金属离子 |
| 2.2.3 抗氧化剂 |
| 2.2.4 其他 |
| 3 MLT对重金属毒性挽救的研究进展 |
| 3.1 MLT生物学作用 |
| 3.1.1 调节睡眠 |
| 3.1.2 抗氧化 |
| 3.1.3 骨骼保护 |
| 3.1.4 生殖调控 |
| 3.1.5 免疫调节 |
| 3.1.6 神经功能调节 |
| 3.2 MLT的作用机制 |
| 3.2.1 受体依赖途径 |
| 3.2.2 非受体依赖性途径 |
| 3.3 MLT对Cd致机体损伤挽救的研究 |
| 4 本学位论文的研究意义及研究内容 |
| 第二章 MLT对CdCl_2致HTR-8/SVneo细胞形态和小鼠胎盘组织损伤的修复 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.1.1 细胞实验 |
| 1.1.1.2 动物实验 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞株与实验动物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞培养 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.2 MTT实验检测细胞活性 |
| 1.2.3 光学显微镜观察细胞形态变化 |
| 1.2.4 透射电子显微镜观察细胞超微结构变化 |
| 1.2.5 动物供毒、石蜡切片及HE染色 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MLT缓解了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞活性降低 |
| 2.1.1 MLT浓度筛选 |
| 2.1.2 MLT与CdCl_2共处理对HTR-8/SVneo细胞活性影响 |
| 2.2 MLT修复了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞的形态损伤 |
| 2.3 MLT修复了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞的超微结构损伤 |
| 2.4 MLT修复了CdCl_2引起的胎盘组织的损伤 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 MLT对CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞抗氧化系统损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞株 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞实验 |
| 1.2.2 流式细胞术检测细胞内ROS含量 |
| 1.2.3 SOD、CAT、GSG-Px活性及MDA含量检测 |
| 1.2.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MLT抑制了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞内ROS水平升高 |
| 2.2 MLT缓解了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞内抗氧化酶活性降低 |
| 2.3 MLT抑制了CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞内脂质过氧化水平升高 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 MLT对CdCl_2致HTR-8/SVneo细胞氧化损伤的修复 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞株 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞实验 |
| 1.2.2 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 1.2.3 彗星实验检测DNA损伤 |
| 1.2.4 流式细胞术检测细胞周期分布 |
| 1.2.5 Hoechst33342染色 |
| 1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 1.2.7 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MLT抑制CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞内线粒体损伤 |
| 2.2 MLT抑制CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞DNA损伤 |
| 2.3 MLT抑制CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞G0/G1期阻滞 |
| 2.4 MLT抑制CdCl_2引起的HTR-8/SVneo细胞凋亡 |
| 2.5 MLT修复CdCl_2致HTR-8/SVneo细胞氧化损伤的分子机制 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:黏液表皮样癌侵袭转移相关分子的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）双氢青蒿素抑制头颈部肿瘤的药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1. 头颈部肿瘤流行病学概况及治疗现状 |
| 2. 头颈部肿瘤临床治疗面临的问题 |
| 2.1 一线化疗药的毒性和耐药问题 |
| 2.2 靶向药物的耐药问题 |
| 3. STAT3在头颈部肿瘤中的重要作用 |
| 3.1 STAT3的结构和主要生物学特性 |
| 3.2 STAT3与顺铂耐药的相关性 |
| 3.3 STAT3与靶向药EGFR-TKI耐药的相关性 |
| 3.4 STAT3在头颈部肿瘤中的重要性 |
| 4. 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用 |
| 4.1 青蒿素及其衍生物的理化性质和生物学特性 |
| 4.2 青蒿素及其衍生物的抗癌活性及作用机制 |
| 4.3 青蒿素及其衍生物在头颈部肿瘤中的作用 |
| 5. 小结 |
| 第二章 DHA对头颈部肿瘤的抑制作用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂及材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 MTT法检测细胞活力 |
| 2.4 Western Blot实验 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 DHA对不同HNSCC细胞的增殖抑制 |
| 3.2 DHA诱导HNSCC细胞凋亡 |
| 3.3 DHA导致HNSCC细胞G0/G1期阻滞 |
| 3.4 头颈部肿瘤基础STAT3表达较高,与预后密切相关 |
| 3.5 DHA通过STAT3抑制头颈部肿瘤细胞的生长 |
| 4. 小结 |
| 第三章 DHA协同顺铂抑制头颈部肿瘤的作用研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂及材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 MTT法检测细胞活力 |
| 2.4 siRNA干扰STAT3 |
| 2.5 Western Blot实验 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.7 基于细胞系建立的异源移植肿瘤模型(CDX模型) |
| 2.8 基于人源肿瘤组织建立的异种移植肿瘤模型(PDX模型) |
| 2.9 血常规指标检测 |
| 2.10 生化指标检测 |
| 2.11 H&E染色 |
| 2.12 免疫组化 |
| 2.13 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 顺铂促进头颈部肿瘤细胞STAT3磷酸化 |
| 3.2 靶向干扰STAT3可增强HNSCC细胞对顺铂的敏感性 |
| 3.3 DHA联合顺铂协同抑制HNSCC细胞增殖 |
| 3.4 DHA促进顺铂诱导的HNSCC细胞凋亡 |
| 3.5 DHA与DDP联合抑制HNSCC细胞异种移植瘤模型(CDX模型)小鼠肿瘤生长 |
| 3.6 DHA与DDP联合抑制人源HNSCC组织异种移植瘤模型(PDX模型)小鼠肿瘤生长 |
| 3.7 DHA抑制小鼠异种移植瘤内STAT3表达 |
| 3.8 DHA改善DDP引起的肝功能损伤和PDX模型肿瘤肝转移 |
| 4. 小结 |
| 第四章 DHA联合EGFR抑制剂治疗头颈部肿瘤的作用研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂及材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 MTT法检测细胞活力 |
| 2.3 Western Blot实验 |
| 2.4 克隆形成实验 |
| 2.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.6 基于细胞系建立的异源移植肿瘤模型(CDX模型) |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 DHA与Osi联合协同抑制HNSCC细胞生长 |
| 3.2 DHA与Osi联合作用抑制EGFR下游相关信号通路 |
| 3.3 DHA与Osi联合抑制HNSCC细胞异种移植瘤模型(CDX模型)小鼠肿瘤生长 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）miR-152靶向NCAM1调节肺腺癌顺铂敏感性体外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 细胞复苏及培养 |
| 1.3 MTT法检测顺铂对A549和A549/DDP细胞活性增殖的影响 |
| 1.4 细胞培养及转染 |
| 1.5 Transwell细胞侵袭实验 |
| 1.6 A549 细胞转染miR-152-3P mimics/inhibitor后 MTT法检测肺腺癌对顺铂敏感性的改变 |
| 1.7 Quantitative-RT-PCR检测NCAM1 基因m RNA的表达 |
| 1.8 Western Blot检测NCAM1 蛋白表达水平 |
| 1.9 采用 Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT法检测顺铂对A549和A549/DDP细胞活性增殖的影响 |
| 2.2 A549 细胞转染 miR-152-3P mimics/inhibitor、NCAM1 后侵袭能力改变 |
| 2.3 A549 细胞转染 miR-152-3P mimics/inhibitor、NCAM1 后 MTT 法检测肺腺癌对顺铂敏感性的改变 |
| 2.4 Quantitative-RT-PCR检测NCAM1mRNA表达 |
| 2.5 Western Blot检测miR-152-3p对 NCAM1 蛋白表达影响 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA在肺癌顺铂耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（6）乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 乳腺癌研究现状 |
| 1.1.2 循环肿瘤细胞研究现状 |
| 1.1.3 金属硫蛋白MT2 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.2 研究思路 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 循环肿瘤细胞系的分离鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 4T1 乳腺癌原位肿瘤细胞和肺脏肿瘤转移灶细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.2 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.3 B16 黑色素瘤循环肿瘤细胞分离和鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 循环肿瘤细胞生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的异质性 |
| 3.3.2 不同EMT表型的4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定 |
| 3.3.3 短期传代次数对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.4 循环肿瘤细胞对化疗药物的敏感性研究 |
| 3.3.5 循环肿瘤细胞增殖、克隆形成能力和体内致瘤能力研究 |
| 3.3.6 循环肿瘤细胞侵袭迁移能力及肺转移能力 |
| 3.3.7 悬浮培养和流体剪切力对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.8 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的血液存活能力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 乳腺癌循环肿瘤细胞定量iTRAQ蛋白组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白 |
| 4.3.2 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白的GO富集分析 |
| 4.3.3 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络分析 |
| 4.3.4 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的KEGG分析 |
| 4.3.5 间叶表型4T1CTCs的候选标记物 |
| 4.3.6 中间表型 4T1CTC-1 和间叶表型 4T1CTC-2 共同高表达蛋白分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 金属硫蛋白2(MT2)通过诱导CTCs发生自噬促进失巢凋亡抵抗和存活 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 4T1乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的失巢凋亡抵抗能力 |
| 5.3.2 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的流体剪切力诱导凋亡抵抗能力 |
| 5.3.3 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为免疫逃逸表型 |
| 5.3.4 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过增加自噬水平抑制凋亡水平促进细胞存活 |
| 5.3.5 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过 MT2 增加自噬水平促进细胞存活 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 一、主要结论 |
| 二、特色与创新 |
| 三、局限性与不足 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 中英文缩略表 |
| 致谢 |
（7）RNF181在非小细胞肺癌中低表达并抑制肿瘤进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述 RNF181 在肿瘤中的表达及意义 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（8）外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 外泌体APE1对非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的影响 |
| 第一节 非小细胞肺癌细胞外泌体APE1对细胞铂类敏感性的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 第二节 血浆外泌体APE1与非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的关系 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三章 外泌体micro RNA对非小细胞肺癌铂类敏感性的影响 |
| 第一节 铂类刺激下外泌体micro RNA对非小细胞肺癌铂类敏感性的影响 |
| 3.1.1 引言 |
| 3.1.2 材料方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 第二节 APE1 相关外泌体micro RNA与非小细胞肺癌铂类化疗疗效的关系 |
| 3.2.1 引言 |
| 3.2.2 材料方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 第四章 PD-L1单核苷酸多态性与非小细胞肺癌易感性和预后的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 外泌体在DNA损伤修复过程中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 非小细胞肺癌铂类耐药机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分PARP1 抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 感受态细菌 |
| 1.2.3 质粒 |
| 1.2.4 药物与主要试剂 |
| 1.2.5 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 siRNA转染 |
| 1.3.3 质粒扩增 |
| 1.3.4 质粒转染 |
| 1.3.5 Western blotting法检测蛋白含量 |
| 1.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western blotting) |
| 1.3.7 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 1.3.8 Elisa检测 |
| 1.3.9 SRB实验检测细胞增殖 |
| 1.3.10 划痕愈合实验 |
| 1.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 1.3.12 条件培养基制备 |
| 1.3.13 数据分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PARP1 调控的潜在靶基因MT1M |
| 1.4.2 卵巢癌基因芯片数据 |
| 1.4.3 PARP1 负性调控MT1M的表达 |
| 1.4.3.1 敲除PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.3.2 过表达PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.4 敲除PARP1对MT1M分泌的影响 |
| 1.4.5 PARP2和PARP3对MT1M表达的影响 |
| 1.4.6 MT1M表达对卵巢细胞增殖的影响 |
| 1.4.7 MT1M的表达对卵巢细胞迁移影响 |
| 1.4.7.1 MT1M高度表达抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.7.2 MT1M的低表达促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.8 分泌的MT1M抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9 PARP1的表达对卵巢细胞迁移的影响 |
| 1.4.9.1 高度表达PARP1促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9.2 敲除PARP1抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.5 讨论 |
| 2 第二部分PARP1 抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 药物与主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 siRNA转染 |
| 2.3.3 质粒扩增 |
| 2.3.4 质粒转染 |
| 2.3.5 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 2.3.6 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 PAR修饰实验 |
| 2.3.9 荧光素酶报告基因法(Dual-Luciferase reporter assay) |
| 2.3.10 荧光素酶报告基因信号测定 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PARP1 通过FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.2 FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.3 PARP1与FOXP3 相互结合 |
| 2.4.4 FOXP3发生核糖基化修饰 |
| 2.4.5 PARP1 抑制由FOXP3 介导的MT1M的转录表达 |
| 2.4.6 敲除PARP1 增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.4.7 PARP抑制剂增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 药物与主要试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 3.3.3 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 3.3.4 SRB实验检测细胞增殖 |
| 3.3.5 Elisa实验法 |
| 3.3.6 划痕愈合实验 |
| 3.3.7 Transwell小室实验 |
| 3.3.8 苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色:H&E染色 |
| 3.3.9 免疫组化染色: |
| 3.3.10 包装慢病毒与感染慢病毒 |
| 3.3.11 动物实验 |
| 3.3.12 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PARP抑制剂促进MT1M的转录表达与分泌 |
| 3.4.2 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移 |
| 3.4.3 MT1M在 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移中的作用 |
| 3.4.4 Olaparib抑制尾静脉接种卵巢癌细胞CaOV3 的肺转移 |
| 3.4.5 Olaparib抑制原代卵巢癌HO-8910PM PDX的动物模型的肺转移 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 PARP1的其他生物学功能:DNA修复之外 |
| 参考文献 |
| 作者简历在学期间所取得的科研成果 |
（10）鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PM_(10)概述 |
| 1.1.1 PM_(10)概念、成分及来源 |
| 1.1.2 PM_(10)对人体健康的影响 |
| 1.1.3 PM_(10)致急性肺细胞损伤的机理研究 |
| 1.2 鹰嘴豆芽素A概述 |
| 1.2.1 鹰嘴豆芽素A概念 |
| 1.2.2 鹰嘴豆芽素A生物活性 |
| 1.2.3 鹰嘴豆芽素A分子作用机制 |
| 1.3 PI3K/AKT信号通路概述 |
| 1.3.1 PI3K/AKT信号通路的传导与调节 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路的组成 |
| 1.3.3 PI3K/AKT信号通路调控氧化应激、炎症与免疫 |
| 1.3.4 PI3K/AKT信号通路抑制剂 |
| 1.4 DNA碱基切除修复途径(BER)概述 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 天津市PM_(10)形态学与化学组成成分分析 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂与耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 颗粒物样品采集 |
| 2.2.2 颗粒物粒径分析 |
| 2.2.3 颗粒物中无机元素测定 |
| 2.2.4 颗粒物中水溶性离子测定 |
| 2.2.5 颗粒物中有机化合物测定分析 |
| 2.2.6 天津市PM_(10)颗粒物形态分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 天津市PM_(10)粒径分析与确定 |
| 2.3.2 颗粒物中无机元素的测定分析 |
| 2.3.3 天津市PM_(10)颗粒物中水溶性离子测定分析 |
| 2.3.4 颗粒物中有机化合物分析 |
| 2.3.5 天津市PM_(10)形态学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 PM_(10)诱导因素与呼吸系统损伤相关性分析 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 PM_(10)成分信息收集 |
| 3.1.2 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.1.3 呼吸系统损伤的界定方法 |
| 3.1.4 呼吸系统损伤终点统计分析 |
| 3.1.5 Tox Cast DB数据库评估 |
| 3.1.6 基因分数计算 |
| 3.1.7 二模网络可视化 |
| 3.1.8 生物信息分析 |
| 3.2 实验结果与讨论 |
| 3.2.1 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.2.2 致呼吸系统损伤化学成分Tox Cast DB生物活性分析 |
| 3.2.3 PM_(10)诱导因素-呼吸系统损伤二模网络可视化 |
| 3.2.4 Tox Cast?分子靶点生物信息学分析评价 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 PM_(10)致急性肺细胞损伤研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂与耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PM_(10)颗粒物采集 |
| 4.2.2 PM_(10)颗粒物样品的制备 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 染毒母液的制备 |
| 4.2.5 细胞模型构建及处理 |
| 4.2.6 MTT试验 |
| 4.2.7 LDH试验 |
| 4.2.8 DCFH-DA荧光标记细胞内活性氧测定 |
| 4.2.9 氧化损伤相关指标的测定 |
| 4.2.10 炎症因子/介质的测定 |
| 4.2.11 基因表达测定 |
| 4.2.12 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PM_(10)致急性肺细胞损伤作用评价 |
| 4.3.2 BCA安全作用剂量考察 |
| 4.3.3 PM_(10)暴露-BCA保护体外细胞模型的建立 |
| 4.3.4 DCFH-DA细胞内活性氧测定 |
| 4.3.5 BCA抗氧化作用评价 |
| 4.3.6 BCA抗炎作用评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 BCA缓解PM_(10)致急性肺细胞损伤作用机制研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验试剂与耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养、模型构建及处理 |
| 5.2.2 CRISPR-CAS9 法构建XRCC1 基因敲除BEAS-2B细胞模型 |
| 5.2.3 基因表达测定 |
| 5.2.4 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.5 蛋白浓度测定及变性处理 |
| 5.2.6 蛋白质免疫印迹试验 |
| 5.2.7 数据统计与分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 BCA抑制PM_(10)致急性肺细胞损伤的生物标志蛋白表达 |
| 5.3.2 BCA调控PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.3 XRCC1 干扰PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.4 BCA介导DNA碱基切除修复BER信号通路 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 全文结论 |
| 6.1.2 论文创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
四、肺癌中金属硫蛋白的表达及其与细胞增殖、凋亡的关系（论文参考文献）
- [1]PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究[D]. 方世旭. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]褪黑素对镉致胎盘滋养层细胞氧化损伤的挽救作用研究[D]. 肖攀. 山西大学, 2021(12)
- [3]姜黄素对黏液表皮样癌MEC-1细胞体外侵袭能力及MMP-9、CD44、E-cadherin表达的影响[D]. 吕美怡. 遵义医科大学, 2021(01)
- [4]双氢青蒿素抑制头颈部肿瘤的药效研究[D]. 孙荣蔚. 南京中医药大学, 2021(02)
- [5]miR-152靶向NCAM1调节肺腺癌顺铂敏感性体外实验研究[D]. 白思特. 右江民族医学院, 2021(01)
- [6]乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究[D]. 金延玲. 兰州大学, 2021(09)
- [7]RNF181在非小细胞肺癌中低表达并抑制肿瘤进展的分子机制研究[D]. 梁伊灵. 沈阳医学院, 2021(09)
- [8]外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究[D]. 赵晓龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [9]PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究[D]. 许霞青. 浙江大学, 2020(02)
- [10]鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究[D]. 王君宇. 天津大学, 2020(02)