一、小鼠分泌性中耳炎动物模型的建立（论文文献综述）
仇静静[1]（2021）在《TGF-β1介导的上皮间质转化在鼓室硬化发病机制中的研究》文中提出研究目的:鼓室硬化（tympanosclerosis,TS）是急慢性中耳炎的常见后遗症,其病理改变主要表现为中耳黏膜固有层发生的纤维化及钙化病变。转化生长因子-β1（TGF-β1）是中耳炎与鼓室硬化中研究较多、较为关注的细胞因子之一,该因子在鼓室硬化的形成过程中呈现逐渐增高的趋势,是导致纤维化发生的重要因素,但具体的作用机制仍不明确。上皮间质转化（epithelial–mesenchymal transformation,EMT）是促进炎症向纤维化进展的重要机制,TGF-β1是其关键的诱导因子。但TGF-β1是否介导EMT在鼓室硬化的发病机制中发挥作用目前未有研究。本次研究通过建立大鼠鼓室硬化模型和中耳上皮细胞原代培养探讨TGF-β1介导的EMT在鼓室硬化发病机制中的作用。研究方法:本次研究共选用40只6-8周龄的健康雄性Sprague Dawley大鼠,其中30只大鼠用于建立鼓室硬化模型,具体方法为右耳单次注射浓度为1×108CFU/ml的灭活肺的炎链球菌悬液50μl。造模8周后处死大鼠并取出双耳听泡。取中耳黏膜制成石蜡切片后进行H&E染色和von Kossa染色,观察中耳黏膜的形态学改变及钙沉积情况。收集中耳黏膜进行Western blotting检测,确定TGF-β1及EMT相关蛋白的表达。同时,收集10只正常8周龄雄性SD大鼠中耳黏膜,进行上皮细胞原代培养。原代细胞培养48小时后分为TGF-β1激活组和TGF-β1抑制组,其中激活组细胞使用TGF-β1刺激48小时,抑制组首先采用TGF-β受体I/II型抑制剂处理细胞6小时,后用与刺激组相同浓度的TGF-β1刺激细胞48小时,分别收集激活组和抑制组细胞进行Western blotting和免疫荧光染色,分析两组细胞中EMT相关蛋白的表达情况。研究结果:1、造模8周时通过耳显微镜观察发现,72.4%的用肺炎链球菌造模的SD大鼠右耳鼓膜的锤骨柄周围出现白色钙化病变;对侧未处理左耳均未出现钙化斑块,鼓膜结构清晰。2、H&E染色提示发生鼓室硬化的大鼠的中耳黏膜有明显的炎性细胞浸润和纤维化,对侧未处理左耳的中耳黏膜形态结构正常,未见炎症或纤维化改变。3、von Kossa染色提示鼓室硬化黏膜中存在钙质颗粒的沉积;对侧未处理左耳未见钙质颗粒的沉积。4、在大鼠中耳黏膜的Western blotting实验中,与对照组相比,鼓室硬化大鼠中耳黏膜中TGF-β1以及snail、N-钙粘蛋白、纤维连接蛋白等间充质细胞标志物表达增加,上皮细胞标志物E-钙粘蛋白表达降低。5、在利用中耳上皮细胞进行的体外实验中,我们证实TGF-β1可以激活中耳黏膜上皮细胞中的EMT通路,导致snail、纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白的表达量增加,同时使E-钙粘蛋白的表达降低。而当我们使用TGF-β1受体抑制剂抑制TGF-β1的传导时,EMT相关蛋白的表达水平降低。同时我们通过免疫荧光染色证实,使用TGF-β1刺激中耳上皮细胞时促进了EMT的关键标志物-波形蛋白的表达增高。研究结论:鼓室内注射灭活肺炎链球菌是一种建立鼓室硬化模型的安全、可靠的方法;TGF-β1可促进动物模型的中耳炎症向纤维化进展,是促进鼓室硬化形成的关键因子;TGF-β1介导的EMT在鼓室硬化的发病机制中起重要作用。
史聪[2]（2021）在《变态反应相关分泌性中耳炎的动物模型构建及病理机制的研究》文中研究指明目的:1.采用卵清蛋白（Albumin,OVA）全身致敏和鼻部激发构建变态反应相关分泌性中耳炎的BALB/c小鼠模型;2.观察变态反应对于鼻腔-咽鼓管-中耳黏膜病理改变;3.动态观察变态反应迟发相主要细胞因子白介素5（IL-5）及中耳积液相关水通道蛋白5（AQP5）在中耳组织中的表达情况。方法:采用变应原OVA全身基础致敏联合鼻内激发构建变态反应相关的分泌性中耳炎模型。选择清洁级BALB/c小鼠18只,随机分组空白对照组C、模型组Ⅰ（鼻内激发2周）、模型组Ⅱ（鼻内激发4周）,每组6只。组织HE染色后观察中耳及鼻黏膜组织结构变化以及测量中耳黏膜的厚度;并用免疫组化方法检测各组动物中耳中IL-5和AQP5的表达和变化。结果:OVA经上呼吸道途径致敏构建变态反应相关分泌性中耳炎动物模型,取材组织进行HE染色。对照组C可见咽鼓管黏膜为假复层纤毛上皮,细胞核排列整齐、均匀,纤毛柱状上皮紧密排列及杯状细胞穿插其中。黏膜下层可见致密的纤维结缔组织与软骨紧贴。自咽鼓管内口至鼓膜处中耳鼓室黏膜上皮呈假复层纤毛上皮-单层柱状/立方纤毛上皮-扁平上皮改变。黏膜下层的结缔组织较薄与骨组织紧密相贴。模型组咽鼓管及近咽鼓管处中耳黏膜可见黏膜上皮细胞数目增加,排列紊乱。黏膜下层略微增厚,纤维细胞增多,血管扩张及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞等浸润。被覆立方上皮及扁平上皮处的中耳黏膜,模型组Ⅰ即滴鼻2周组可见上皮细胞细胞数目增多、排列欠均匀。模型组Ⅱ即滴鼻4周组可见上皮细胞化生,杯状细胞增多,部分纤毛脱落,黏膜下层血管扩张及少量炎性细胞浸润。测量近咽鼓管黏膜、中段中耳鼓室黏膜及鼓膜紧张部三处组织厚度,（1）近咽鼓管黏膜厚度测量:模型组Ⅰ（22.14±4.21um）、模型组Ⅱ（29.25±8.67um）较对照组C（19.31±2.07um）均增厚,模型组Ⅱ较对照组C的黏膜增厚差异有意义（P<0.05）;（2）中段中耳鼓室黏膜测量:模型组Ⅰ（7.06±2.67um）、模型组Ⅱ（9.62±4.02um）较对照组C（5.61±0.78um）增厚,模型组Ⅱ较对照组C的黏膜增厚差异有意义（P<0.05）;（3）鼓膜厚度测量:模型组Ⅰ（7.33±2.5）、模型组Ⅱ（9.31±3.03）较对照组C（5.76±1.07）差异无统计学意义（P>0.05）。变态反应作用时间增多,伴随中耳骨髓腔内IL-5表达明显增加。阳性细胞计数结果:模型组Ⅱ较对照组C多,差异有统计学意义（P<0.05）,模型组Ⅰ与对照组C、模型组Ⅱ的差异无统计意义。免疫组化显示AQP5在小鼠的中耳黏膜和咽鼓管均有表达,中耳鼓室及咽鼓管段黏膜上皮纤毛、基底膜的扁平细胞以及咽鼓管段腺细胞膜表达。模型组较对照组AQP5平均光密度值略有升高,但差别无显着性意义（P>0.05）。结论:本实验采用OVA经上呼吸道致敏的方式成功构建变态反应相关的分泌性中耳炎的动物模型,支持变态反应是分泌性中耳炎发生发展的病因之一。1.过敏原经上呼吸道致敏,从鼻、咽鼓管、中耳黏膜发生较一致的改变,支持了“中耳-咽鼓管-上呼吸道联合体”的学说;2.持续的抗原刺激下,机体内变态反应相关炎性介质等的存在对中耳的黏膜组织的结构造成不可逆的改变,从中耳的局部炎症向慢性中耳炎的转变;3.AQP5在中耳黏膜上皮细胞表达,变态反应对AQP5的表达无相关性。
刘龙生[3]（2021）在《非儿童分泌性中耳炎与咽喉反流的分析研究》文中研究表明目的分泌性中耳炎（Secretory otitis media,SOM）作为最常见的传导性耳聋的发病原因之一,近期其与咽喉反流（laryngophary-ngeal reflux,LRP）的相关性研究逐渐成为研究热点?目前国内外对分泌性中耳炎的发病机制和病因的相关研究仍较少?此次主要为研究分泌性中耳炎与咽喉反流之间关系,目的是有利于分泌性中耳炎的临床诊治,为患者提供更优的治疗方案。方法（1）将2019年6月至2020年6月安徽医科大学第一附属耳鼻咽喉-头颈外科收治入院的60例分泌性中耳炎患者作为研究对象。按照专业医生的要求凭借自身感受填写反流症状指数表（reflux symptom index,RSI）。再通过电子喉镜检查结果由2名耳鼻喉科医生完成反流体征指数表（reflux finding score,RFS）,并取分数平均值。再由专业人员使用Dx-p H监测仪对患者进行口咽部24小时p H监测。根据患者体位计算反流事件总数、反流百分比时间和最长反流时间,并得出Ryan评分。（2）在上述60名分泌性中耳炎患者中筛选出46例分泌性中耳炎伴有咽喉反流的患者,并按照专业耳鼻喉科医师的要求,进行七个咽鼓管功能障碍评分表（Eust achian tube dysfunction questionnaire-7,ETDQ-7）的评估。结果1.60例分泌性中耳炎的患者RSI量表的阳性率为70%;60例分泌性中耳炎的患者RFS量表的阳性率为61.66%;60例分泌性中耳炎的患者RSI和/或RFS阳性率为73.33%（44/60）。2.60例分泌性中耳炎的患者Ryan指数阳性46例（46/60,76%）,以直立评分阳性最多。3.分泌性中耳炎合并咽喉反流的46名患者的七项咽鼓管功能障碍评分阳性率为100%（46/46）。结论1.分泌性中耳炎的发病与喉咽反流的症状具有正向相关性。2.咽鼓管功能障碍是喉咽反流伴有分泌性中耳炎的发病的重要环节之一。
赵洪春[4]（2020）在《内质网应激在中耳炎发病机制中的作用研究》文中研究说明研究背景中耳炎（Otitis media,OM）作为耳鼻喉的常见疾病,其发病率较高,病诊量较大,尤以儿童常见。国内没有确切的OM发病率报道。据欧洲和美国等报道,3岁之前大约80%的儿童经历过至少1次OM。OM最常见的病原菌是肺炎链球菌,肺炎链球菌可引起30%～60%的OM。对于目前急性中耳炎的治疗,临床棘手问题是OM频繁发作,导致的中耳一系列并发症,例如引起患儿鼓室硬化、中耳黏连以及并发中耳胆脂瘤,可导致病患不同程度的听力障碍,严重者会影响到语言的发育。迄今为止,肺炎球菌引发的疾病（Pneumococcal disease,PD）是全世界未被解决的临床卫生医疗问题之一。肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,Spn）导致的OM,现今被认为属于非侵袭性疾病,不早期治疗或治疗方式不当可引发婴幼儿性听力下降,还会导致语言发育中枢滞后,可能累及其他中枢,对儿童损害较大。临床上中耳炎的治疗包括药物和手术,药物以抗生素为主,但由于其耐药性,Spn对常用抗生素应用时间存在限制,使得临床药物治疗难度上升。所以建立合适的模型,同时对OM发病机制和潜在治疗模式探索已成为儿科和耳鼻喉科临床医生的当务之急,我们迫切需要对OM发病机制进行深入研究,寻求治疗靶点。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）作为一种细胞内复杂的膜网络,它不仅可以确保细胞钙和脂质的稳态,还可以有效介导蛋白的的折叠和运输,尤其是跨膜、分泌蛋白的途径。ER是一种多功能细胞器,包含着许多酶,折叠酶和伴侣蛋白,可协助氧化蛋白折叠和其他翻译后修饰可确保维持ER稳态。在组织缺氧、细胞应激及感染造成的稳态失衡这些生理和病理条件下可引发内质网蛋白质功能受到抑制,促使UPR（未折叠蛋白反应）,引起内质网应激ERS（ER-stress）。ERS的特征是活化转录因子4（ATF4）-C/EBP同源蛋白（CHOP）的激活途径。越来越多的证据表明,ERS参与多系统多器官疾病的发生、发展,如脑血管/心血管系统疾病、神经样病变、病毒性炎症、听功能损伤等,在这些人类疾病的发病机理中起着不可忽视的作用。研究发现,炎症会触发内质网应激,使内质网内环境失衡,导致炎症性疾病发生。最近,在各种炎症性疾病研究中,一些研究已经报道了内质网应激和炎症反应之间的信号串连作用,特别是炎症性肠病中两者关系密切相关。而且,众所周知,内质网中蛋白质的过度生产可以引发炎症,炎症反应可以触发内质网应激。先前的研究认为,炎症发生可以激活UPR,诱发内质网应激启动,破坏内质网稳态平衡,从而导致炎症性疾病。除了内质网应激和炎症之间相互作用的复杂性外,细胞对内质网应激的反应有特定细胞类型的成分,这些成分决定了对应激条件的适应或适应不良和死亡。在内质网应激的一系列反应中,可激活炎症基因表达程序,调节炎症基因表达。事实上,我们已经表明,在环境应激强度增加的过程中,通过eIF2a激酶PKR的一个新的轴与蛋白质PACT相互作用,过度激活促炎症反应的发生。据先前研究报道,ERS过程中PACT-PKR的激活机制是促凋亡的,同时可诱发细胞炎症程序。根据以往的文献数据认为,内质网应激与促炎条件相互作用,互为因果。但是,在OM发病机理中,内质网应激的作用机制尚不明确。因此,我们在一个实验性的OM小鼠模型中测试了内质网应激和炎症基因表达的存在,同时探讨运用内质网应激的抑制剂如何影响促炎反应和OM的发病机制。更进一步研究OM及ERS的关系,对于研究炎症发生理论和完善细胞自修复机制具有重要意义,且有助于进一步认识疾病发生发展的机制,为临床OM疾病预防提供新理论依据,对OM治疗提供新药物途径。拟解决的科学问题1)如何构建利于中耳炎长期效应观察类似人类中耳炎的模型,该模型是否适于讨论中耳炎分子机制及过程?2)构建的OM模型是否有内质网应激反应的启动,内质网应激又是否反作用于OM?3)抑制内质网应激是否可以减低炎症反应,降低OM发生?4)内质网应激在OM是否起到关键作用或者主导作用?第一章:构建合适的OM模型:肽聚糖（PGPS）诱导的B6小鼠中耳炎模型特点研究方案:我们先前的研究中证明,接种格兰仕阳性杆菌细胞壁成分肽聚糖(PGPS可诱导中耳炎症反应,从而创建不需要活细菌或病毒的OM模型,该模型生存率高利于长期效应观察。PGPS是一种病原体相关微生物模式（PAMP）可以激活Toll样受体2（TLR2）,导致免疫反应的激活。本文采取鼓室内注射肽聚糖（PGPS）（PGPS最佳注射剂量为55μg/10μL,PBS为溶剂）诱导C57BL/6J（B6）小鼠,构建中耳炎（OM）模型,PBS（10 μL）构建对照组。通过耳内窥镜形态学观察,听觉脑干诱发电位（ABR）、畸变产物耳声发射技术（DPOAE）及鼓室计功能学观察评估鼓膜形态变化、听力水平及鼓室压力,评判中耳炎模型中耳腔炎症的特点,同时应用HE染色、RT-PCR、Western-blot、TUNEL染色及免疫组化等分子生物学技术检测炎性相关因子及凋亡相关基因的表达,检测PGPS诱导的中耳炎模型的生物学特点。研究结果:1.PGPS诱导后发现第1d小鼠部分外耳道皮肤及鼓膜开始充血,第2d鼓膜标志不清,锤骨纹模糊,第3d鼓室内可见少许脓性分泌物,炎症模型建立。HE染色发现PGPS组小鼠中耳粘膜上皮增厚,中耳腔内炎症细胞增多,以多核细胞为主,对照PBS组中耳腔无炎症细胞浸润。2.听功能学结果提示B6小鼠在PGPS诱导后,Click、8Khz、16kh阈值在ABR上升高有统计学意义;鼓室压力降低,成负压状态。DPOAE测定与PBS组无明显统计学差异。3.PGPS诱导后B6小鼠炎症及凋亡基因cleaved Cas3、TNF-α、IL-6、TLR2mRNA增高,而IL-1β没有差异。Western-Blot也验证了 RT-PCR的结果,提示相应的炎症及凋亡蛋白表达也升高,且有统计学意义。4.免疫组化提示PGPS组中耳粘膜上皮中TNF-α表达阳性,定量分析提示PGPS组表达明显升高,差异有统计学意义。5.细胞凋亡原位检测TUNEL法检测中耳腔组织阳性凋亡情况,PGPS组较PBS组TUNEL阳性中耳表皮细胞数量显着增加,提示在PGPS诱导后的小鼠中耳组织中上皮细胞凋亡增加。第二章 内质网应激与中耳炎的关系研究方案:分组及注射同第一部分,通过RT-PCR和Western-blot探讨PGPS诱导的B6小鼠中耳粘膜上皮组织中内质网相关基因ATF6、Cas12、BIP、CHOP mRNA水平及相关蛋白的表达,探讨内质网应激在中耳炎发生过程中的作用,利用免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白CHOP的表达,探索ERS可诱发细胞凋亡,参与中耳炎的炎症机制;用CellRox试剂盒检测中耳粘膜上皮中ROS的生成,初步探讨氧自由基的生成与中耳炎发生的关系。研究结果:1.取PBS组和PGPS组的B6小鼠中耳组织,运用RT-PCR检测内质网应激相关相关基因ATF6、Cas12、CHOP、BIPmRNA的表达,在PGPS诱导组表达明显高于PBS组,均有统计学意义（P<0.05）。2.运用Western-Blot蛋白免疫检测发现,PGPS诱导组ERS的相关蛋白ATF6、Cas12、CHOP、BIP表达也明显增高,与PBS组比较数值有统计学意义（P<0.05）。3.免疫组化检测凋亡蛋白CHOP,提示PGPS诱导的B6小鼠组CHOP蛋白在细胞质核均有表达;同时运用ImageJ定量分析结果显示PGPS诱导的小鼠CHOP表达明显高于PBS组小鼠,数值有统计学意义（P<0.05）。4.CellRox试剂盒检测中耳上皮组织中ROS的生成,提示PGPS诱导后B6小鼠组比对照PBS组ROS生成明显增多,中耳粘膜上皮细胞荧光染色阳性。第三章 内质网应激抑制剂TUDCA对中耳炎的保护作用研究方案:我们选取B6小鼠随机分为三组:PGPS组（PGPS剂量为55 μg/10μL）,TUDCA治疗组（200μg TUDCA用10μLPGPS新鲜稀释）和PBS组。通过HE染色和耳内窥镜检查,观察三组小鼠中耳腔情况;听觉诱发脑干反应（ABR）检测ABR阈值;WB检测相关炎症及内质网应激相关蛋白表达。研究结果:1.TUDCA组ABR检查在短声Click、低频8KHz、稍高频16KHz明显比PGPS组阈值降低,数值有明显差异（P<0.05）。TUDCA组ABR与PBS组比较,虽然阈值高于PBS组,但统计学无明显差异。2.HE染色显示TUDCA组中耳上皮与PGPS组比较,中耳粘膜上皮增厚减低,炎症细胞浸润减少等,分析中耳粘膜上皮厚度及炎症覆盖面积比值,提示与PGPS组比较TUDCA组中耳上皮炎症减弱,同时测量中耳上皮的厚度以及炎症覆盖面积比值提示,TUDCA组两者数值均降低,数值有统计学意义（P<0.05）。3.westernb-blot提示TUDCA组与PGPS组相比内质网应激相关蛋白ATF6、Cas12、CHOP、BIP mRNA表达明显降低。TUDCA组炎症相关基因TNF-α的表达也明显降低。第四章探讨内质网应激在OM炎症中的主导作用—自噬、氧化应激与中耳炎的作用关系研究方案:随机选取B6小鼠,构建TUDCA、雷帕霉素（Rapamycin RAP）,自噬基因用RT-PCR定量分析,检测PGPS组和PBS小鼠组P62、LC3的表达,探讨TUDCA与RAP对自噬机制的抑制,同时检测内质网应激相关基因在各组的表达,探讨RAP对ER-stress的抑制;RT-PCR检测PBS,PGPS组和TUDCA氧化应激相关基因的表达,探讨氧化应激在PGPS诱导的OM作用;进一步阐明自噬、氧化应激与内质网应激在中耳炎机制中的作用关系。研究结果:1.PGPS诱导的B6小鼠自噬相关基因P62、LC3表达升高,TUDCA及自噬抑制剂Rap治疗后自噬相关基因P62、LC3都明显减低,与诱导组比较数值有统计学意义（P<0.05）;TUDCA组与Rap组相比自噬相关基因P62、LC3表达降低的更明显,而且两组差异有明显不同（P<0.05）,提示TUDCA可通过抑制内质网应激减低OM自噬发生。2.与第三部分结果一致,TUDCA组较PGPS组,内质网应激相关基因ATF6、BIP、CHOP mRNA减低明显,TUDCA组与PGPS组间数值差异有统计学意义（P<0.05）;Rap治疗后较PGPS组内质网应激相关基因ATF6、BIP、CHOP mRNA趋势减低,但两组间数值差异明显（P>0.05）;TUDCA治疗组相对’Rap治疗组内质网应激相关基因ATF6、BIP mRNA减低明显,两组间数值差异有意义（P<0.05）,而CHOP mRNA的减低两组之间无差异,表明Rap不能抑制内质网应激发生。4.氧化应激相关基因检测,PGPS组较PBS组氧化应激相关蛋白SOD mRNA表达轻度升高外,Nrf2、GSH-Px、NOD、Catalase基因mRNA表达无差异;TUDCA治疗后氧化应激相关基因未见明显减低,提示氧化应激机制可能未参与ROS的生成,表明PGPS诱导OM氧化应激没有发生。研究创新性及意义1.成功运用革兰氏阳性杆菌细胞壁成分肽聚糖PGPS在C57BL/6J小鼠诱导中耳炎模型,且该模型较稳定,较以往细菌诱导的模型小鼠生存率高,有助于观察小鼠的中耳炎长期效应。2.内质网应激ER-Stress参与许多炎症的发生与发展。本实验阐述ER-Stress在中耳炎发生发展中的作用及角色,同时探索中耳炎ER-Stress的发生机制;同时抑制ER-Stress可以有效减轻中耳炎症,说明抑制ER-Stress可作为一个治疗OM的潜在靶点,为以后治疗中耳炎提供新的理论基础。3.本论文首次探讨内质网应激在中耳炎中的主导作用,相比自噬及氧化应激,在PGPS诱导的C57BL/6J小鼠中耳炎模型中,内质网应激先于自噬发生,且能激活氧化应激氧自由基的产生,抑制内质网应激同时可以有效抑制自噬的发生,这为OM治疗提供治疗前景。
张亚楠,白明,惠香香,王赛,苗明三[5]（2021）在《基于中西医临床病症特点的分泌性中耳炎动物模型分析》文中研究指明基于分泌性中耳炎的中西医临床病症特点,参考临床诊断标准,整理分析并建立分泌性中耳炎的西医诊断标准和中医辨证标准,总结分泌性中耳炎动物模型的造模方法和模型特点,依据临床诊断标准及症状特点,对现有的动物模型与临床症状的吻合程度进行评价,明确其优缺点。统计结果发现,目前分泌性中耳炎动物模型的造模方法较少,且仅能揭示出某一种相关致病机制,其中吻合度较高的模型是基因工程技术造模和向中耳耳泡注入细菌因子2种造模方法,与西医临床病症吻合度较高,但均未能体现中医证型。因此建立同时体现分泌性中耳炎中西医临床病症特点的动物模型,完善分泌性中耳炎病症结合动物模型评价标准,是分泌性中耳炎中医药未来研究的主要任务。
阿不拉江·托合提[6]（2020）在《Nrf2在慢性化脓性中耳炎中的表达及发病机制的研究》文中提出目的:分析Nrf2蛋白与TLRs在不同类型中耳炎中耳粘膜组织的表达差异及Nrf2与TLRs在慢性化脓性中耳炎中表达水平的相关性。阐述慢性化脓性中耳炎中耳粘膜组织中Nrf2的表达与慢性化脓性中耳炎发病进程之间的关系。探讨Nrf2与TLR4表达模式对慢性化脓性中耳炎中耳粘膜组织中促炎细胞因子的影响。在此基础进一步探究Nrf2调控TLR4轴对慢性化脓性中耳炎的发病进程中内在调控机制,为揭示慢性化脓性中耳炎发病进程,急性中耳炎到慢性化脓性中耳炎过度的潜在分子机制奠定科学基础。方法:第一部分:（1）利用RT-q PCR法检测慢性化脓性中耳炎（CSOM）,中耳炎后遗疾病（DOM）,非中耳炎（Non-OM）患者中耳组织中Nrf2和TLRs（TLR2,TLR4,TLR5和TLR9）的表达水平差异。（2）为了验证RT-q PCR结果的准确性,利用Western blot法检测上述三种中耳炎中耳组织中的Nrf2和TLRs的表达水平差异。（3）采用Persson相关性分析法分析慢性化脓性中耳炎中Nrf2和TLR4表达水平的相关性及相互作用。第二部分:（1）利用RT-q PCR法检测CSOM,DOM,Non-OM中耳组织中促炎细胞因子（TNF-α,IL-1β,IFN-γ和IL-6）的差异表达。（2）采用ELISA法验证上述RT-q PCR结果的准确性。分析慢性炎症在CSOM,DOM,Non-OM中表达水平的意义。第三部分:（1）建立高剂量脂多糖（LPS）诱导的AOM小鼠模型和持续低剂量LPS诱导的CSOM小鼠模型。采用Western blot法检测AOM,CSOM,Control三组中耳组织中促增殖相关蛋白（Cyclin D1和CDK2）和促凋亡蛋白（裂解的Caspase-3和Bax）蛋白水平的差异。（2）采用RT-q PCR法检测AOM,CSOM,Control三组中耳组织中促炎细胞因子表达水平差异;采用ELISA法验证上述RT-q PCR结果的准确性。（3）采用RT-q PCR法检测AOM,CSOM,Control组中耳组织中Nrf2和TLR4表达水平差异;采用Western blot法验证上述RT-q PCR结果的准确性。（4）验证Nrf2的敲低效率和TLR4过表达效率,采用RT-q PCR法检测Nrf2在CSOM,COSM+KD-Nrf2中耳组织中表达水平差异和TLR4在CSOM,COSM+OE-TLR4中耳组织中表达水平差异。（5）采用RT-q PCR法检测CSOM,COSM+KD-Nrf2,Control中耳组织中TLR4表达水平差异;采用Western blot法验证上述RT-q PCR结果的准确性。采用RT-q PCR法检测CSOM,COSM+OE-NTLR4,Control中耳组织中Nrf2表达水平差异;采用Western blot法验证上述RT-q PCR结果的准确性。（6）采用RT-q PCR法检测CSOM,COSM+OE-NTLR4,COSM+KD-Nrf2,Control中耳组织中促炎细胞因子表达水平差异;采用ELISA法验证上述RT-q PCR结果的准确性。（7）验证Nrf2过表达的效率和TLR4敲低效率,采用RT-q PCR法检测Nrf2在AOM,AOM+OE-Nrf2中耳组织中表达水平差异和TLR4在AOM,AOM+KD-TLR4中耳组织中表达水平差异。（8）采用RT-q PCR法检测AOM,AOM+OE-Nrf2,AOM+KD-TLR4,Control中耳组织中促炎细胞因子表达水平差异;采用ELISA法验证上述RT-q PCR结果的准确性。结果:第一部分:（1）Nrf2在CSOM中耳粘膜组织中表达水平显着高于DOM,Non-OM组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在DOM,Non-OM组中表达水平差异无统计学意义;TLR4在CSOM中耳粘膜组织中表达水平显着低于DOM,Non-OM组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在DOM,Non-OM组中表达水平差异无统计学意义;TLR2,TLR5和TLR9在CSOM,DOM,Non-OM中耳组织中表达水平差异无统计学意义。（2）采用Western blot法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。（3）Nrf2与TLR4在CSOM中耳组织中表达水平有显着统计学相关性（Pearson相关系数为0.608,P<0.0001）,呈负相关。第二部分:（1）RT-q PCR结果显示促炎细胞因子（TNF-α,IL-1β,IFN-γ和IL-6）在CSOM中耳组织中表达水平显着高于DOM,Non-OM组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在DOM,Non-OM组中表达水平差异无统计学意义。（2）采用ELISA法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。第三部分:（1）使用高剂量LPS建立AOM小鼠模型,持续低剂量LPS建立CSOM小鼠模型,促增殖相关蛋白（Cyclin D1和CDK2）在CSOM,AOM组织中表达水平显着低于Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在CSOM,AOM组中表达水平差异无统计学意义。促凋亡蛋白（裂解的Caspase-3和Bax）在CSOM,AOM组织中表达水平显着高于Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在CSOM,AOM组中表达水平差异无统计学意义。（2）RT-q PCR结果显示促炎细胞因子在CSOM中耳组织中表达水平显着高于AOM,Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在Control,AOM组中表达水平差异无统计学意义。采用ELISA法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。（3）Nrf2在小鼠CSOM中耳粘膜耳组织中表达水平显着高于AOM,Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在AOM,Control组中表达水平差异无统计学意义;TLR4在小鼠CSOM中耳粘膜耳组织中表达水平显着低于AOM,Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在AOM,Control组中表达水平差异无统计学意义;采用Western blot法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。（4）验证Nrf2敲低和TLR4过表达载体传染率,Nrf2在CSOM+KD-Nrf2中耳组织中表达水平显着低于CSOM组,P<0.01,差异具有统计学意义;TLR4在CSOM+OE-TLR4中耳组织中表达水平显着高于CSOM组,P<0.01,差异具有统计学意义。（5）TLR4在CSOM+KD-Nrf2中耳组织中表达水平显着高于CSOM组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在Control,CSOM+KD-Nrf2组中表达水平差异无统计学意义;采用Western blot法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。Nrf2在COSM+OE-TLR4,CSOM组中耳组织中表达水平差异无统计学意义,P>0.01;Nrf2在COSM+OE-TLR4组中表达水平显着高于Control组,差异具有统计学意义,P<0.01;采用Western blot法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。（6）RT-q PCR结果显示促炎细胞因子在CSOM中耳组织中表达水平显着高于CSOM+KD-Nrf2,CSOM+OE-TLR4,Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在CSOM+KD-Nrf2,CSOM+OE-TLR4组中表达水平差异无统计学意义。采用ELISA法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。（7）验证Nrf2过表达,TLR4敲低载体在AOM小鼠中耳组织中的转染率,Nrf2在AOM+OE-Nrf2组中表达水平显着高于显着高于AOM组,P<0.01,差异具有统计学意义;TLR4在AOM+KD-TLR4组中表达水平显着低于AOM组,P<0.01,差异具有统计学意义。（8）RT-q PCR结果显示促炎细胞因子在AOM+KD-TLR4,AOM+OE-Nrf2组中耳组织中表达水平显着高于AOM,Control组,P<0.01,差异具有统计学意义;而在AOM+KD-TLR4,AOM+OE-Nrf2组中表达水平差异无统计学意义。采用ELISA法检测结果与RT-q PCR法检测结果完全一致。结论:（1）Nrf2在CSOM中耳组织中高表达与CSOM发病进程有关。TLR4在CSOM中耳组织中低表达与CSOM发病进程有关。Nrf2与TLR4在CSOM中耳组织中表达水平呈负相关。Nrf2靶向下调TLR4促成CSOM的发病。（2）促炎细胞因子（TNF-α,IL-1β,IFN-γ和IL-6）在CSOM中高表达与CSOM的发病进程有关,CSOM中存在慢性炎症。Nrf2/TLR4通路在CSOM中维持慢性炎症,然而慢性炎症在CSOM发病进程中起至关重要的作用。（3）Nrf2在CSOM中耳组织中高表达与CSOM发病进程有关。Nrf2靶向调控TLR4,并且在CSOM中对TLR4表达起负调控,但TLR4水平的改变不影响Nrf2表达水平。Nrf2靶向下调TLR4通过维持慢性炎症,促成CSOM的发病进程。TLR4在调节CSOM进程中显示TLR4高表达消除CSOM的慢性炎症,而敲低TLR4则促进AOM-CSOM的转变,表明TLR4的减弱促成CSOM的发病机理。敲低Nrf2可减轻CSOM的慢性炎症,并且Nrf2高表达促进AOM的慢性炎症,表明Nrf2在AOM过渡CSOM过程中起推动作用。综上所述,敲低Nrf2通过上调TLR4逆转慢性炎症,从而减缓CSOM的发病进程。这项研究揭示AOM-CSOM过度的潜在机制并可能为临床CSOM的治疗提供潜在的生物制剂。
许玲[7]（2020）在《三叶因子在中耳炎中的表达及与炎症因子的相关性研究》文中研究表明目的:中耳炎（otitis media）是一类以感染为主要病因,中耳黏膜损伤为主要病理表现,以进行性听力下降、耳鸣、耳痛为主要临床表现的中耳炎症性疾病,是影响中耳黏膜功能最常见的疾病。三叶因子家族（trefoil factor family,TFF）与呼吸系统关系密切,在呼吸道黏膜的保护、修复过程中具有重要意义。以往研究证实,中耳黏膜存在呼吸型黏膜上皮,但是关于TFF是否在中耳黏膜中存在表达,以及对中耳炎发病进程中发挥作用及其机制未见报道。本研究通过构建大鼠中耳炎动物模型,检测TFF1、TFF3蛋白在大鼠中耳炎疾病发展过程中的表达水平,研究TFF1、TFF3蛋白表达与中耳黏膜炎症因子表达之间的关系,探讨TFF1、TFF3蛋白在中耳炎发病机制中可能发挥的作用。研究方法:本研究分为两部分,第一部分选取同龄健康成年雄性SD大鼠25只,采用双侧听泡各注入活性50ul 3型肺炎链球菌悬液,来构建大鼠中耳炎模型。将SD大鼠随机分为5组,分别为:假手术对照组、模型2周组、模型4周组、模型8周组、模型12周组。用HE染色法观察不同时期大鼠中耳黏膜细胞形态学变化;通过免疫组织化学法和Western blot法检测TFF1、TFF3蛋白在不同时期大鼠中耳黏膜组织中的表达情况;本研究第二部分选取SD大鼠10只,随机分2组,分别为:假手术对照组、中耳炎模型组。同第一部分造模方法构建大鼠中耳炎模型,收集两组大鼠中耳黏膜组织标本,采用ELISA法检测组织中TFF1、TFF3蛋白和TNF-α、IL-6、IL-8的浓度。结果:中耳炎模型组大鼠中耳黏膜组织HE染色可见胶原纤维聚集,纤维组织增生,血管化的形成。免疫组织化学染色显示TFF1、TFF3蛋白在正常组大鼠的中耳黏膜组织中有一定表达,在中耳炎模型组大鼠的中耳黏膜组织中表达增高,并主要表达于上皮细胞和成纤维细胞的胞质中。Western blot法检测发现,与假手术对照组相比,中耳炎模型组大鼠中耳黏膜组织中TFF1、TFF3蛋白的表达量随着疾病的发展呈现先增加后在造模8周时稍下降,之后又增加的趋势,在造模12周达到高峰。ELISA检测结果发现,中耳炎模型组大鼠中耳黏膜中TFF1、TFF 3蛋白、TNF-α、IL-6、IL-8的浓度比对照组显着增高（P<0.05）。相关性分析表明,中耳炎大鼠中TFF1蛋白的水平与IL-6、IL-8的水平呈显着正相关（P<0.05）,而与TNF-α的水平不相关。TFF3蛋白的水平与TNF-α、IL-6、IL-8的水平呈显着正相关（P<0.05）。结论:TFF1、TFF3蛋白在正常组大鼠的中耳黏膜组织中有表达,并在大鼠中耳炎中耳黏膜组织表达水平显着增高,同时中耳炎大鼠中TFF3蛋白与炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8水平存在显着相关性,TFF1蛋白与IL-6、IL-8的水平存在显着相关性,TFF1与TNF-α的水平不相关。组织中TFF1、TFF3蛋白的水平可以反应大鼠中耳炎黏膜炎症的活动程度,并且对于中耳炎炎症进展具有良好的评估效能。意义:本课题通过构建大鼠中耳炎动物模型和相关的体外实验方法,首次探讨了TFF1、TFF3蛋白在大鼠中耳炎症中的表达调控的理论研究,而且明确了TFF1、TFF3蛋白作为中耳黏膜炎症中重要的调控因子,参与了中耳炎症的发生与发展,研究结果将丰富对中耳炎发病机制的理论认识,也为基于靶向中耳炎的治疗提供新思路。
张蓉[8]（2020）在《加味取渊汤治疗分泌性中耳炎临床疗效评价及对大鼠Th1/Th2、AQP-1、TNF-α的影响研究》文中研究指明目的:分泌性中耳炎（Secretory Otitis Media,SOM）是以中耳积液和听力下降为主要特征的中耳非化脓性炎性疾病。其临床主要症状表现为耳内阻塞、胀闷感,听力下降,或伴耳鸣、耳痛。目前SOM尚无统一规范的治疗方案,临床大多选择药物治疗和手术治疗。西医的治疗多以对症治疗为主,而中医整体审察,并结合四诊及病证来治疗疾病,近年来诸多研究表明中医治疗疗效明显。取渊汤出自于《辨证奇闻》,原用其治疗鼻窦炎,后导师结合古代医籍理论和平素门诊诊疗经验,在原方基础上加以炙麻黄、杏仁、甘草和陈皮,用以治疗变态反应性鼻炎、鼻窦炎、分泌性中耳炎,临床使用多年,疗效明显。本课题为评价加味取渊汤和西药联合应用治疗分泌性中耳炎的临床疗效,并运用大鼠模型探索加味取渊汤的可能作用机制。方法:1.临床疗效评价:选取2018年12月至2019年6月于南京市中西医结合医院耳鼻喉科门诊,确诊为分泌性中耳炎和中医辨证为风邪外袭型的患者60例,随机分为治疗组和对照组（每组30例）,对照组采取临床常规治疗:头孢呋辛酯和欧龙马滴剂,口服头孢呋辛酯片0.25g/次,每日2次;欧龙马滴剂5ml/次,每日3次,口服;7天为1个疗程,疗程为2周。治疗组在对照组基础上加用加味取渊汤,每日1剂,分早晚两次服用,疗程为2周。分别采用以下指标对患者进行评分:各项临床症状量化评分;疗效评价;纯音听阈测定评价;声导抗检查评价等综合评估两组患者的症状、体征及中医症候,以此来评估加味取渊汤的临床疗效。并于治疗前后抽取患者血液制成血清,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清样本中的白介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）,以计算出Th1/Th2,以此分析加味取渊汤免疫调控效果。2.动物模型评价:将SD大鼠（30只）随机分为模型组、治疗组和对照组（每组10只）。以卵清蛋白腹腔注射致敏结合鼓膜内注射继发方法,建立大鼠分泌性中耳炎模型。建模成功后以头孢呋辛酯灌胃体积1ml/100g及欧龙马滴剂灌胃剂量为1.575ml/kg,每日1次,连续给药14天;治疗组在对照组基础上加用加味取渊汤,大鼠灌胃体积为1ml/100g,日1次,连续给药14天。模型组不给药,确认造模成功后处死。模型组在处死后,治疗组和对照组于给药后各取得标本,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测样本中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和水通道蛋白-1（AQP-1）,并检测IL-4和IFN-γ,以计算出Th1/Th2,以此分析加味取渊汤免疫调控效果。结果:1.临床疗效评价:（1）经过14天治疗,治疗组总有效率93.33%,对照组总有效率90.00%。（2）在耳内阻塞、胀闷感,听力下降和耳痛方面,两组均有显着疗效,且治疗组对上述症状改善更为显着。（3）对两组改善纯音听阈疗效进行比较,治疗组对上述症状改善更为显着;对两组改善声导抗疗效进行比较,两组在改善患者声导抗检查方面无显着差异。（4）治疗组和对照组均可显着改善IL-4、IFN-y和Th1/Th2,且治疗组对于IL-4和Th1/Th2的改善显着优于对照组。2.动物模型疗效评价:（1）治疗组和对照组对于SOM大鼠的IL-4、IFN-γ和Th1/Th2表达均有显着改善,且治疗组改善优于对照组。（2）治疗组和对照组对于大鼠的TNF-α和AQP-1表达量均有显着改善,且治疗组对于TNF-α和AQP-1的调节显着优于对照组。结论:1.加味取渊汤联合头孢呋辛酯片和欧龙马滴剂治疗分泌性中耳炎疗效显着。2.加味取渊汤可以有效改善患者主观症状及体征,并可降低IL-4,纠正Th1/Th2平衡失衡,改善控制炎症反应,促进黏液排除。3.通过动物模型疗效观察,加味取渊汤可以提高AQP-1、纠正Th1/Th2平衡失衡及降低TNF-α,更显着促进中耳积液吸收,解除中耳黏膜水肿,纠正中耳负压,促进疾病恢复。
童兴科[9]（2019）在《清窍胶囊对分泌性中耳炎小鼠模型水通道蛋白AQP1,4,5表达水平的影响》文中进行了进一步梳理目的:基于水通道蛋白对院内制剂“清窍胶囊”治疗分泌性中耳炎（SOM）小鼠模型机制的初步研究,试图为清窍胶囊治疗分泌性中耳炎提出新的理论依据,同时探讨清窍胶囊对SOM小鼠模型外周血及中耳黏膜水通道蛋白（Aquaporin）AQP1,4,5表达水平的影响,部分诠释清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的蛋白组学机制。方法:采用随机、对照、前瞻性研究的方法,将80只健康、耳廓反射良好且无噪声暴露史的小鼠随机纳入健康对照组10只,实验组、空白对照组各35只。实验组及空白对照小鼠统一采用卵清蛋白分别于第1、第8天行腹腔注射全身致敏,第15天卵清蛋白鼓室内注射耳内激发,3天内观察鼓室内出现液平面或液气平面,显示分泌性中耳炎小鼠模型制备成功,淘汰各组造模未成功及不合格的小鼠;实验组予清窍胶囊药末混悬液0.5ml（0.02mg/kg）灌胃,每日2次;空白对照组予等量生理盐水灌胃;实验组及空白对照组分别于d1、3、5、7、9随机取2只小鼠,行心脏采血及快速断头刮取中耳黏膜,余各组小鼠于第10日予以心脏采血及快速断头刮取双侧中耳黏膜,以双侧中耳黏膜为一个实验标本,并分组编号,血清予以常规高速离心取上清液,中耳黏膜予以强蛋白裂解液冰点充分裂解后高速离心取上清液,各组均采用ELLSA方法对各组小鼠外周血清及中耳黏膜裂解液中的水通道蛋白AQP1,4,5含量进行定量检测并统计分析。统计学方法:采取SPSS 17.00统计软件包分析数据,计量数据以（x±s）表示,组间比较采用两独立样本t检,以P<0.05表示比较差异有统计学意义。结果:（1）实验组SOM小鼠模型血清AQP1,5表达浓度明显高于空白对照组（P<0.01）,差异具有统计学意义,而AQP4表达浓度较空白对照组显着降低（P>0.05）;（2）实验组小鼠模型中耳黏膜裂解液中AQP1,5表达浓度较空白对照组明显升高（P<0.01）,AQP4表达浓度与空白对照组相比略微降低,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）实验组中SOM小鼠血清AQP1,5及中耳黏膜AQP1,4的随时间的表达浓度显着高于空白对照组,而中耳黏膜中AQP5随时间的表达水平明显低于空白对照,并且血清中AQP4随时间的表达水平则与空白对照组相比无显着差距。结论:（1）清窍胶囊能明显提高SOM小鼠血清中AQP1,5的表达量,提高小鼠中耳黏膜中AQP1,5的表达水平,加快SOM小鼠血清中AQP1,5及黏膜中AQP1,4的表达,但对中耳黏膜AQP4及血清中AQP4的表达水平的提高作用有限,对中耳黏膜中AQP4无明显干预。（2）显示清窍胶囊可能通过提高SOM小鼠模型血清和中耳黏膜中水通道蛋白AQP1,5的表达水平,从而干预分泌性中耳炎（SOM）中耳黏膜水液的输布,提高中耳黏膜AQP1,4对水液的转运效率,调节中耳黏膜水平衡,从而促进中耳积液的清除,其对缩短SOM的病程及改善分泌性中耳炎的转归有着积极明显的作用。（3）清窍胶囊对小鼠中耳黏膜及外周血水通道蛋白AQP4的调节效果有限,且可能下调AQP5的表达,预示着中耳黏膜及血清当中的AQP1,4,5之间可能存在着协调表达,各亚型之间可能存在表达、分布的相互平衡,但具体清窍胶囊如何干预AQP1,4,5的表达,各水通道蛋白如何协调表达及之间的信号通路尚需更深一步的研究。
钟伦坤,周兴玮,何娴,朱佳丽,黄秀丽,何腾,孙永东[10]（2018）在《清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的临床疗效以及相关机制》文中研究表明目的探讨清窍胶囊对分泌性中耳炎HIF-VEGF信号通路的影响和临床疗效。方法前瞻性纳入本院从2014年12月至2015年11月期间收治80例急性分泌性中耳炎患者并随机分为2组,组1给予头孢克洛胶囊;组2采用口服清窍胶囊治疗。比较两组患者电测听、声阻抗测试结果、不良反应发生率。ELISA法检测清窍胶囊治疗前后病人中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平的浓度并比较治疗前后的差异。同时将60只小鼠随机分为安慰剂组（生理盐水）、对照组（头孢克洛胶囊）和治疗组（清窍胶囊）,均采用卵清蛋白致敏作用建立小鼠分泌性中耳炎的动物模型,建模成功后用ELISA法检测小鼠中耳积液中低氧诱导因子-1（HIF-1a）和血管内皮生长因（VEGF）的表达水平,比较3组之间的差异。对照组和治疗组分别给予适量的头孢克洛胶囊和清窍胶囊治疗,安慰剂采用等量的生理盐水治疗。采用ELISA法检测治疗前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平。结果组2在电测听和声阻抗检测结果方面均优于组1（P <0.05）;组2不良反应发生率显着低于组1（P <0.05）。3组小鼠造模后中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平的浓度明显高于造模组,差异具有统计学意义（P <0.01）,经过治疗后,3组小鼠上述因子水平均显着降低,以治疗组降低程度最大。且组1和组2在治疗前后上述因子的水平变化同小鼠试验结果一致。结论清窍胶囊可能通过影响HIF-VEGF信号通路来发挥治疗分泌性中耳炎的作用,且临床疗效优于头孢克洛胶囊,值得进一步临床推广。
二、小鼠分泌性中耳炎动物模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠分泌性中耳炎动物模型的建立（论文提纲范文）
（1）TGF-β1介导的上皮间质转化在鼓室硬化发病机制中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 肺炎链球菌 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型的构建 |
| 2.2 中耳黏膜组织准备 |
| 2.3 中耳上皮细胞原代培养、鉴定及处理 |
| 2.4 H&E染色观察实验组与对照组中耳黏膜组织形态学改变 |
| 2.5 von Kossa染色观察实验组与对照组中耳黏膜组织中的钙化情况 |
| 2.6 Western blotting检测中耳黏膜中相关蛋白的表达 |
| 2.7 免疫荧光鉴定细胞类型及检测波形蛋白的表达 |
| 2.8 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 成功构建鼓室硬化模型 |
| 1.1 耳显微镜观察结果表明成功构建鼓室硬化模型 |
| 1.2 组织病理学观察造模大鼠炎症与纤维增生结果 |
| 1.3 组织钙沉积染色观察显示造模大鼠形成组织钙沉积结果 |
| 2 成功培养中耳上皮细胞 |
| 3 EMT相关蛋白在鼓室硬化模型中表达增加 |
| 3.1 大鼠组织检测表明EMT相关蛋白在鼓室硬化模型中表达增加 |
| 3.2 中耳黏膜细胞检测表明TGF-β1促进相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 鼓室硬化病因及相关因素的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）变态反应相关分泌性中耳炎的动物模型构建及病理机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 变态反应相关分泌性中耳炎动物模型的建立 |
| 1.2.2 实验动物的分组 |
| 1.2.3 动物模型的判断 |
| 1.2.4 动物血液的采集 |
| 1.2.5 动物标本的采集 |
| 1.2.6 鼻黏膜及听泡黏膜HE染色 |
| 1.2.7 免疫组织化学检测AQP5及IL-5在中耳鼓室黏膜及咽鼓管黏膜表达 |
| 1.2.8 双抗体夹心酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IgE的表达量 |
| 1.2.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 鼓膜观察 |
| 2.2 血清总IgE表达量 |
| 2.3 鼻黏膜HE染色 |
| 2.4 中耳鼓室黏膜HE染色 |
| 2.5 免疫组化结果 |
| 2.5.1 鼻黏膜IL-5表达结果 |
| 2.5.2 中耳骨髓腔内IL-5表达 |
| 2.5.3 鼻黏膜AQP5免疫组化 |
| 2.5.4 中耳组织AQP5表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 糖皮质激素对分泌性中耳炎的临床疗效进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）非儿童分泌性中耳炎与咽喉反流的分析研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6. 展望 |
| 7.参考文献 |
| 8.附录 |
| 9.致谢 |
| 综述 分泌性中耳炎研究进展 |
| 参考文献 |
（4）内质网应激在中耳炎发病机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文词汇对照表 |
| 前言 |
| 一. 中耳炎研究背景 |
| 二. 中耳炎的发病机制及治疗现状 |
| 三. 中耳炎动物模型研究基础及现状 |
| 四. 内质网应激研究背景 |
| 五. 内质网应激与炎症 |
| 六. 内质网应激与中耳炎 |
| 实验材料与仪器设备 |
| 1、实验材料 |
| 2、主要试剂材料及仪器 |
| 3、主要试剂溶液配制 |
| 实验方法 |
| 1、动物分组及实验前期处理 |
| 2、中耳取材 |
| 3、小鼠中耳粘膜上皮细胞的剥离 |
| 4、组织学方法:HE染色 |
| 5、免疫组化染色 |
| 6、听性脑干反应ABR测试 |
| 7、畸变产物耳声发射DPOAE测定 |
| 8、耳镜观察 |
| 9、鼓室计测量 |
| 10、细胞凋亡原位检测 |
| 11、氧自由基检测CellROX Green Reagent kit (Invitrogen,10444) |
| 12、RNA提取 |
| 13 、反转录 |
| 14、实时定量PCR |
| 15、琼脂糖凝胶电泳 |
| 16、Western blot |
| 17、统计分析 |
| 实验结果 |
| 第一章 PGPS诱导的C57BL/6J小鼠中耳炎模型的炎症反应 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 探讨内质网应激与中耳炎的关系 |
| 1、前言 |
| 2、实验结果 |
| 3、讨论 |
| 第三章 内质网应激抑制剂TUDCA对中耳炎的炎症保护作用 |
| 1.前言 |
| 2.果 |
| 3、讨论 |
| 第四章 探讨内质网应激在OM炎症中的主导作用—自噬、氧化应激与中耳炎的作用关系 |
| 1、前言 |
| 2、实验结果 |
| 3、讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 内质网应激在炎症机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文附文 |
（5）基于中西医临床病症特点的分泌性中耳炎动物模型分析（论文提纲范文）
| 1 SOM的病因及机制 |
| 1.1 SOM机制研究 |
| 1.2 SOM中医机制研究 |
| 2 SOM诊断标准及临床特点 |
| 2.1 SOM西医学诊断标准及临床表现 |
| 2.2 SOM中医临床诊断标准 |
| 3 SOM动物模型分析 |
| 3.1 SOM动物的选择 |
| 3.2 SOM动物模型吻合度判断 |
| 4 讨论 |
（6）Nrf2在慢性化脓性中耳炎中的表达及发病机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Nrf2及TLRs在不同类型中耳炎中的表达及相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学处理方 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 Nrf2/TLR4 通路对慢性化脓性中耳炎中耳组织中促炎细胞因子的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学处理方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 Nrf2/TLR4 在慢性化脓性中耳炎发病机制中的作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Nrf2 在中耳炎发病机制中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）三叶因子在中耳炎中的表达及与炎症因子的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 三叶因子在大鼠中耳炎模型中的表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.研究材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肺炎链球菌悬浊液的制备 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 动物模型的构建 |
| 2.4 中耳黏膜组织制备 |
| 2.5 HE染色观察各组中耳黏膜形态学改变 |
| 2.6 免疫组织化学染色法检测中耳黏膜组织TFF1、TFF3 蛋白的表达 |
| 2.7 Western blot法检测中耳黏膜组织TFF1、TFF3 蛋白的表达 |
| 2.8 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 组织形态学观察结果 |
| 2 免疫组织化学法检测TFF1、TFF3 蛋白的表达 |
| 3 Western blot法检测TFF1、TFF3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 第二部分 大鼠中耳炎模型中三叶因子与炎症因子的相关性研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肺炎链球菌悬浊液的制备 |
| 2.2 实验分组及建模 |
| 2.3 中耳黏膜组织制备与HE染色观察组织形态 |
| 2.4 酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测中耳黏膜组织中TFF1、TFF3蛋白和TNF-α、IL-6、IL-8细胞因子的浓度 |
| 2.5 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 对照组和模型组大鼠中耳黏膜组织形态学结果 |
| 2 对照组和模型组大鼠实验室指标比较 |
| 3 大鼠黏膜组织中TFF1、TFF3 蛋白与TNF-α、IL-6、IL-8 相关性分析 |
| 4 大鼠中耳黏膜组织中TFF1、TFF3 蛋白对中耳炎诊断的评估效能 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）加味取渊汤治疗分泌性中耳炎临床疗效评价及对大鼠Th1/Th2、AQP-1、TNF-α的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 现代医学对于SOM的认识 |
| 1.1 现代医学对于SOM病因和病理机制的认识 |
| 1.2 现代医学对于SOM的诊断 |
| 1.3 现代医学对于SOM的治疗 |
| 2. 中医学对于SOM的认识 |
| 2.1 中医学对于SOM病因病机的认识 |
| 2.2 中医学对SOM的诊断 |
| 2.3 中医学对于SOM的治疗 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1. 研究资料 |
| 1.1 观察对象 |
| 1.2 病例选择 |
| 1.3 受试者权益保障和知情同意书 |
| 1.4 伦理审查 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 药物及实验仪器 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 疗程 |
| 2.4 观察方法 |
| 2.5 血清处理及检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3. 数据研究结果 |
| 3.1 两组组间一般资料分析 |
| 3.2 治疗前两组间临床症状体征积分比较 |
| 3.3 组内治疗前后比较 |
| 3.4 治疗后两组间临床症状体征积分比较 |
| 3.5 组间治疗前后临床症状体征总分比较 |
| 3.6 疗效两组间比较 |
| 4. 不良反应 |
| 5. 实验指标结果比较 |
| 5.1 治疗前两组IL-4、IFN-γ比较(Th1/Th2即IFN-γ/IL-4) |
| 5.2 治疗组治疗前后IL-4、IFN-γ比较 |
| 5.3 对照组治疗前后IL-4、IFN-γ比较 |
| 5.4 两组治疗前后Th1/Th2比较 |
| 5.5 治疗后两组IL-4、IFN-γ比较 |
| 第三部分 动物实验 |
| 1. 研究材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 实验用药 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 动物模型建立 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 治疗组和对照组IL-4、IFN-γ和Th1/Th2比较 |
| 3.2 治疗组和对照组TNF-α和AQP-1比较 |
| 第四部分 讨论 |
| 1. 选题依据 |
| 1.1 加味取渊汤组成与分析 |
| 1.2 现代药理学研究 |
| 1.3 对照组药物的使用 |
| 2. 临床实验结果分析 |
| 2.1 单项分析 |
| 2.2 综合疗效分析 |
| 2.3 血清样本中的Th1/Th2分析 |
| 3. 动物实验结果分析 |
| 3.1 分泌性中耳炎大鼠模型的建立方法 |
| 3.2 AQP-1、Th1/Th2和TNF-α比较 |
| 4. 机制分析 |
| 5. 总结 |
| 6. 研究存在问题及展望 |
| 第五部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得研究成果 |
| 致谢 |
（9）清窍胶囊对分泌性中耳炎小鼠模型水通道蛋白AQP1,4,5表达水平的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 基于水通道蛋白分泌性中耳炎的研究进展 （ 综述 ） |
| 参考文献 |
（10）清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的临床疗效以及相关机制（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入与排除标准 |
| 1.4 分组方法 |
| 1.5 实验动物 |
| 1.6 建模方法 |
| 1.7 实验材料、试剂和仪器 |
| 1.8 疗效评价 |
| 1.9 分泌性中耳炎模型小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平 |
| 1.1 0 清窍胶囊对小鼠HIF-VEGF通路信号分子的影响 |
| 1.1 1 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 清窍胶囊对分泌性中耳炎的临床疗效观察 |
| 2.1.1 两组电测听和声阻抗测试 |
| 2.1.2 两组不良反应发生率比较 |
| 2.2 建模前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平的比较 |
| 2.3 治疗前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF水平比较 |
| 2.4 清窍胶囊对分泌性患者中耳积液中HIF VEGF通路信号分子的影响 |
| 3 讨论 |
四、小鼠分泌性中耳炎动物模型的建立（论文参考文献）
- [1]TGF-β1介导的上皮间质转化在鼓室硬化发病机制中的研究[D]. 仇静静. 青岛大学, 2021(02)
- [2]变态反应相关分泌性中耳炎的动物模型构建及病理机制的研究[D]. 史聪. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]非儿童分泌性中耳炎与咽喉反流的分析研究[D]. 刘龙生. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]内质网应激在中耳炎发病机制中的作用研究[D]. 赵洪春. 山东大学, 2020(04)
- [5]基于中西医临床病症特点的分泌性中耳炎动物模型分析[J]. 张亚楠,白明,惠香香,王赛,苗明三. 中国中药杂志, 2021(04)
- [6]Nrf2在慢性化脓性中耳炎中的表达及发病机制的研究[D]. 阿不拉江·托合提. 新疆医科大学, 2020(03)
- [7]三叶因子在中耳炎中的表达及与炎症因子的相关性研究[D]. 许玲. 青岛大学, 2020(01)
- [8]加味取渊汤治疗分泌性中耳炎临床疗效评价及对大鼠Th1/Th2、AQP-1、TNF-α的影响研究[D]. 张蓉. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]清窍胶囊对分泌性中耳炎小鼠模型水通道蛋白AQP1,4,5表达水平的影响[D]. 童兴科. 西南医科大学, 2019(08)
- [10]清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的临床疗效以及相关机制[J]. 钟伦坤,周兴玮,何娴,朱佳丽,黄秀丽,何腾,孙永东. 实用医学杂志, 2018(17)