一、永生化人脐静脉内皮细胞重建成功（论文文献综述）
张露文,戴鹏秀,张翊华,陈奕静,王璟璐,李佳锴[1]（2022）在《猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化》文中研究表明背景:细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性,大T抗原基因可使细胞永生化效率提升,并广泛应用于实验中,越来越受到研究者的关注。目的:建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株,为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础。方法:使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞,连续传代培养,通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定。结果与结论:（1）该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞,具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志;（2）转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因;（3）永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞;（4）永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能;（5）由此可见,转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力,该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株。
霍达[2]（2021）在《仿生构建功能化小口径组织工程血管》文中研究表明研究背景:心血管疾病引起的血管阻塞仍是全球范围内导致患者死亡的重要原因,尽管球囊血管成形术等传统手术已经得到了发展,但仍有许多患者需要接受血管移植手术,如冠状动脉搭桥手术。此外还有许多疾病治疗需要使用血管替代物进行移植,例如血液透析患者的动静脉分流术,创伤导致血管损伤患者的血管移植术等。目前自体移植物例如胸廓内动脉和隐静脉是冠脉搭桥的金标准移植物,但静脉在移植到需要承受高压的动脉部位时长期表现不够好,还有很多患者由于健康状况较差而使得自体血管无法用于移植。在其他的血管移植术中,各种高分子材料的人工血管移植物成为自体血管的替代品,如膨体聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene,e-PTFE）,但是其生物相容性、顺应性等方面有很多不足,当其口径较小时易形成血栓,限制了其临床应用。在过去的十几年里,血管组织工程已经成为发展最快的研究领域之一。血管组织工程的目的是综合应用材料学、生物学设计出有活性的性质与天然血管相似的组织工程血管（tissue engineered blood vessel,TEBV）。但目前TEBV仍然存在制备周期较长、细胞来源有限、力学性能不足、植入后易形成血栓等诸多缺点。天然血管之所以具有完备的生物学功能和优异的力学性能,与其组成和结构密切相关。血管由内膜、中膜和外膜三层结构组成,内膜为内皮细胞层,能够调控凝血平衡,防止血栓形成;中膜由定向排列的平滑肌、弹性纤维和胶原纤维组成,提供了主要的力学强度;外层为包含成纤维细胞和外周神经的结缔组织。本研究从仿生学角度出发,针对TEBV的构建进行了以下几个方面的研究。研究方法:血栓形成是TEBV植入体内后首先需要解决的问题。TEBV作为外源异物,植入后容易造成血小板的活化、聚集以及后续的凝血反应,在这个过程中,活化的血小板释放的高浓度二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）起到了重要促凝作用。人体血管内皮细胞表面的两种胞外核苷酸酶:CD39与CD73,对ADP浓度起到调节作用,然而TEBV在体内完成内皮化需要较长的时间。为了实现早期抗凝,我们以还原氧化石墨烯（reduce graphene oxide,r GO）作为载体,将CD39与CD73两种酶蛋白通过共价键结合在其表面,随后将r GO-酶复合物修饰在脱细胞血管表面,进行了体外和大鼠体内的酶活性、抗凝抗血栓等功能的验证。随后,我们解析天然血管的成分和微结构,制备出具有仿生定向排列纤维结构的高强度双网络水凝胶血管。动物来源的脱细胞血管尽管有着力学性能好、来源广的优点,但异种材料引起的免疫排斥和尺寸口径不能自由选择的缺点限制了其应用。水凝胶是广泛应用于组织工程的材料,但能够承受较大压力或张力的水凝胶工程化组织仍较少见,力学强度不足仍是其最大的短板之一。我们首先设计了可以快速温和制备的光固化双网络（double-network,DN）水凝胶,并在其中添加了碳纳米管（carbon nanotube,CNT）,模仿天然血管纳米纤维结构,通过能量耗散机制和纤维网络提高整体的强度和顺应性。随后利用该水凝胶通过3D打印技术制备出血管结构后,对其进行限制性风干处理（Restricted air drying,RAD）,以得到类似天然血管的分层级定向排列纤维结构,最终得到RAD-CNT-DN高强度水凝胶血管。单纯的水凝胶血管仍不具备天然动脉血管的分层结构,且不易直接接触血液。最后我们复合PCL纤维膜、生物膜和上述合成的DN水凝胶,并利用细胞3D打印和细胞种植技术,制备出三层结构细胞化小口径血管。我们使用脱细胞血管内膜作为血管的内层分隔水凝胶与血液,起到类似血管内弹性膜的物理分隔作用,并提供一定的力学强度。在外面包被一层使用微纳3D打印技术制备的PCL纤维膜,PCL纤维具有交错的定向排列结构,与血管中层定向排列的纤维,可以提供足够的力学强度。外层使用含有人脐带来源间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）生物墨水打印细胞层。随后将诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PS cells）定向诱导分化为血管内皮细胞,使用自行搭建的血管灌流培养系统将其种植在血管内表面,得到内皮化的三层血管。研究结果:血管表面功能仿生的实验结果表明,CD39与CD73形成的嘌呤能通路,能在生理条件下将局部微环境中血小板活化释放的ADP转化为一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）和腺苷,两者能够起到调控微环境、防止血栓形成并促进内皮化的作用。片状结构的r GO不仅能够保证级联酶促反应的顺利进行,而且能够增强酶蛋白在血管内表面的分散程度和稳定性。动物实验结果表明,r GO-酶修饰后的TEBV相比未修饰的血管更不易形成急性血栓,内皮化程度更好,能够保持通畅。微结构仿生实验结果表明,快速合成的DN水凝胶通过能量耗散提升了强度和韧性。在RAD处理过程中,水凝胶血管内部在特定方向产生的应力使得高分子聚合物逐渐形成分层级的定向排列纤维结构,该结构与血管壁的纤维排列结构类似。力学测试结果表明,我们制备的水凝胶血管弹性模量、断裂强度、极限形变和爆破压力都有显着提升,顺应性更加接近天然血管。三层血管制备的体外实验结果表明,MSC细胞在水凝胶内三维生长状态良好,细胞在PCL纤维引导下沿着纤维方向生长。血管内表面种植的内皮细胞在冲刷力作用下定向排列,接近天然血管内皮细胞排列方式。对三层血管进行了初步的大鼠体内移植实验,结果表明MSC细胞可以存活7d以上,种植了内皮细胞的血管更不容易形成血栓,移植14d后保持通畅。结论:综上所述,本论文通过对血管功能和结构的解析进行仿生设计,首先制备出具有仿生内皮细胞涂层的抗血栓TEBV,然后利用水凝胶材料和3D打印技术,制备出具有类似天然血管纤维微结构的高强度水凝胶血管,最后复合使用脱细胞材料、高分子材料和含细胞水凝胶,制备出三层仿生血管,并进行了动物体内移植实验。该方法将之前需要两周以上的体外培育过程缩短到一天以内。3D打印技术可以灵活地调整血管口径和长度。结果表明,这些仿生手段能够实现血管内表面抗血栓,快速制备出具有优良力学性能的小口径血管,为体外设计制备TEBV提供了新的方法和思路。
邵晗琪[3]（2021）在《CRISPR/Cas9介导可逆永生化内皮细胞系建立及主动脉瓣疾病潜在应用分析》文中研究表明目的本研究旨在建立共表达Cas9和SV40 LT的血管内皮细胞系,方便内皮细胞的大量培养,后续利用CRISPR系统切除SV40 LT或任何基因,用于心血管疾病及癌症等分子机制研究。方法首先构建共表达Cas9和SV40 LT的永生化人脐静脉内皮细胞系。两条技术路线:两步法是先后分别转染表达SV40 LT和Cas9的慢病毒载体,得到HUVEC2-CTG;一步法是利用overlap PCR和同源重组法构建慢病毒载体Lv-EF1 α-Cas9-IR ES-SV40 LT,然后感染原代HUVEC2,得到HUVEC2-CT。随后设计并筛选针对S V40 LT 的 CRISPR 系统,转染 HUVEC2-CTG 细胞,得到 HUVEC2-C△TG。用 We stern Blotting在蛋白水平验证Cas9对SV40 LT的切除效果。用CCK8法检测HU VEC2-CΔTG细胞体外增殖情况,免疫细胞化学检测CD31、CD34,vWF,并研究SV40 LT切除前后内皮细胞Matrigel管型形成功能,用转录组测序比较SV40 LT切除前后内皮细胞的转录组差异。在GEO数据库上挖掘出CAVD相关的基因和m iRNA数据,利用生物信息学方法来甄别差异性基因和miRNA。对具有差异性表达特征的的基因组网络进行了生物学反应过程与分子通路的聚类分析,并且研究和分析了 miRNA-基因调控网络,寻找利用建立的血管内皮细胞进行深入机制研究的切入点。结果我们分离培养出了原代人脐静脉血管内皮细胞,命名为PUMC-HUVEC2,其形态表现为典型的鹅卵石样。在感染SV40 LT-GFP后,利用PCR/Western Blottin g分别检测到在DNA/蛋白两个层次上SV40 LT的表达,命名为HUVEC2-TG,呈内皮形态、结合凝集素。进一步转染Cas9,获得稳定表达的HUVEC2-CTG,West ern Blotting显示在挑取的25个单克隆细胞株中23个有Cas9表达,基因组DNA检测也显示Cas9阳性。HUVEC2-CTG为内皮形态、结合凝集素。构建的慢病毒载体Lv-EF1α-Cas9-IRES-SV40 LT测序正确后,一步转染获得了 Cas9和SV40 LT共同稳定表达的HUVEC2-CT,在基因组DNA中检测到了Cas9和SV40 LT的表达。构建的针对SV40 LT的CRISPR系统,转染至HUVEC2-CTG细胞中,得到了HUVEC2-C△TG。用CCK8法检测HUVEC2-C△TG细胞体外增殖情况,结果证明敲除后的细胞生长速度显着低于对照组细胞,其中HUVEC2-C△TG-27切除前3、5、7天的OD值分部是（0.45±0.017）、（0.64±0.067）和（0.93±0.110）,切除后3天（0.24±0.005）、5天（0.30±0.011）、7天（0.27±0.011）明显降低（P 值均小于0.001）,表明HUVEC2-C△TG细胞的体外增殖能力下降。根据CCK8检测HUVEC2-C△TG细胞的增殖情况的结果,选择SV40 LT切除效果最好的HUVEC2-C△TG-27,免疫细胞化学验证HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-27/HUVEC2-C△TG-27细胞的内皮细胞特性,结果显示CD31、CD34以及vWF均表达为阳性,并未见明显差异。HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-8、22、27/HUVEC2-C△TG-8、22、27 内皮细胞 Matrigel管型形成功能结果显示,这些内皮细胞在Matrigel上均可以形成典型的管样结构,未发现明显差异。根据转录组表达谱全面分析的结果来看,HUVEC2-CTG-8、22、27在SV40 LT切除前细胞增殖相关基因就存在差异表达,与其SV40 LT和Cas9在基因组中插入的位置不同有关。随后分析了切除SV40 LT后发生显着差异表达的基因,发现分别有246、141、506个基因发生差异表达。我们进一步对差异基因进行分子通路聚类分析,从中发现三个细胞株中免疫反应相关通路都上调,而下调通路并不一致,其中细胞HUVEC2-CΔTG-8下调基因主要集中在细胞骨架重塑、细胞趋附与细胞周期相关通路,细胞HUVEC2-CΔTG-22下调基因主要集中在纤维化形成相关通路,细胞HUVEC2-C△TG-27下调基因主要集中在代谢相关通路。我们重点关注了与细胞增殖相关的基因变化,发现SV40LT切除后的差异基因中部分细胞增殖相关基因在不同细胞株中发生相同的变化。我们进一步分析了这些细胞增殖相关的差异基因的分子通路,发现在三个细胞株中,增殖相关的差异基因均能聚类到胰岛素样生长因子（IGF）相关通路,其中主要是IGF结合蛋白（IBP）4-7发生变化。通过对CAVD患者的差异基因进行生物信息学分析,发现CAVD患者的上调基因主要聚类到对外界刺激的反应、生物大分子代谢、免疫细胞激活上,而下调基因则集中在对外界刺激的反应、心肌细胞发育、离子稳态上。另外,多种CAVD病因的相关基因均有部分差异表达。同时,1 10个miRNA表达发生显着差异。在下调miRNA-上调基因模式中,找到了可调控HLA-DRB1和HLA-DRB5的3个miRNA以及5个可调控VCAM1的miRNA。上调miRNA-下调基因中,HAND2与hsa-miR-6081、ACTC1与hsa-miR-4793-5p存在相互作用。为下一步利用所建细胞系进行深入研究奠定了基础。结论本研究分别用两步法及一步法建立了共表达Cas9和SV40LT的内皮细胞系H UVEC2-CTG和HUVEC2-CT;已利用CRISPR系统切除永生化基因SV40 LT,证明切除后增殖下降,发生了基因表达谱改变,是优化的血管内皮细胞模型。生物信息学分析找到的CAVD疾病发生潜在的分子机制,待下一步利用所建内皮细胞模型等验证。
钱佳佳[4]（2021）在《基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制》文中认为目的:通过蛋白组学及网络药理学分析温经通络汤调控血管内皮细胞功能的多靶点信号网络,明确温经通络汤抑制血管新生的机制;基于ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型分析骨关节炎不同病理阶段软骨组织中血管新生特点,以及相关信号通路（VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT）表达特点,明确其与膝骨关节炎病理进程相关性;阐明温经通络汤调控血管新生干预膝骨关节炎的分子机制,为温经通络汤治疗膝骨关节炎提供实验依据。方法:（1）蛋白组学检测温经通络汤调控内皮细胞的多靶点信号机制:培养永生化人脐静脉内皮细胞,分为不同浓度温经通络汤含药血清及空白血清干预组,CCK8筛选温经通络汤含药血清抑制内皮细胞生长的最适浓度、划痕实验、Transwell及管腔形成实验检测最适浓度的温经通络汤含药血清调控内皮细胞增殖、迁移及管腔形成的作用。通过蛋白组学分析温经通络汤含药血清干预内皮细胞后与空白血清组间差异表达蛋白,并通过GO、KEGG富集分析筛选出与血管生成相关的富集度较高的信号通路及蛋白进行下一步研究。（2）网络药理学研究温经通络汤治疗膝骨关节炎作用靶点:通过网络药理学方法筛选出温经通络汤的有效成分和药物靶点,并探讨其治疗膝骨关节炎的作用靶点和信号通路,推测温经通络汤治疗膝骨关节炎的关键靶点。（3）前交叉韧带横断术（ACLT）诱导的小鼠膝骨关节炎模型病理特点研究:建立ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型,运用病理染色、免疫荧光、免疫组化、Western Blot、RT-PCR等实验方法,明确不同病理阶段血管新生情况及VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT通路与炎症、软骨退变（Mankin评分）的关系。（4）温经通络汤对膝骨关节炎小鼠的治疗作用及机制研究:建立膝骨关节炎小鼠模型,造模四周后给予不同浓度温经通络汤4周灌胃治疗,WB及免疫组化检测各组小鼠软骨炎症、软骨基质降解情况;RT-PCR及WB检测软骨中VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2及PI3K/AKT通路的变化规律,初步揭示温经通络汤调控血管生成的潜在分子机制。结果:（1）CCK8、划痕实验、Transwell及管腔形成实验结果表明4%温经通络汤含药血清干预脐静脉内皮细胞后,可显着延缓其增殖、迁移及管腔形成。蛋白组学分析结果显示温经通络汤含药血清及空白血清干预后,两组脐静脉内皮细胞中共有148种差异蛋白质,其中87个蛋白出现上调,61个蛋白下调。对这些差异蛋白进行GO和KEGG富集分析显示差异蛋白主要与血管内皮细胞迁移调控、血管生成正调控、凋亡过程负调控、细胞外基质结合、铁死亡等通路相关,并筛选出差异蛋白VEGF-A、VEGFR2进行验证。（2）通过韦恩图对温经通络汤药物预测靶点和骨关节炎疾病靶点进行映射,共得到温经通络汤治疗膝骨关节炎的131个共同作用靶点,筛选出其中38个关键靶点进行GO及KEGG富集分析,结果显示相关信号通路涉及炎症、免疫、代谢和血管新生等方面。其中与血管新生相关的通路包括HIF1信号通路、VEGF及PI3K-AKT等信号通路。（3）ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型软骨退变程度呈时间依赖性,软骨基质降解和炎症反应与骨关节炎病变程度基本一致,VEGF-A/VEGFR2信号通路在ACLT模型的发生发展中起着重要作用。研究结果显示PI3K/AKT信号通路在该模型病理进程中呈现下降趋势,表明其可能通过其他途径参与膝骨关节炎病理进程。（4）温经通络汤可降低膝骨关节炎小鼠软骨中COL-X的表达,增加COL-Ⅱ表达（P<0.01）,从而延缓软骨基质降解;减少炎症介质COX2及iNOS表达（P<0.01）,延缓膝骨关节炎病理进程。初步明确温经通络汤可能通过VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2信号通路调控血管侵袭参与膝骨关节炎;温经通络汤可激活软骨中PI3K/AKT通路表达,表明PI3K/AKT信号通路可能通过其他途径参与调控膝骨关节炎进程,具体作用机制还有待进一步验证。结论:体外实验证实温经通络汤含药血清可抑制脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成,从而抑制血管生成;蛋白组学技术及网络药理学分析结果表明温经通络汤含药血清可从血管内皮细胞迁移调控、血管生成正调控、凋亡过程负调控、细胞外基质结合、铁死亡等多通路多靶点抑制血管生成;CD31免疫荧光染色可清晰显示膝骨关节炎小鼠软骨组织中血管新生情况,VEGF-A/VEGFR2及PI3K/AKT通路通过不同途径参与调控膝骨关节炎病理进程;温经通络汤可通过调控VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2及PI3K/AKT信号通路的表达,抑制血管新生,改善膝骨关节炎小鼠的软骨基质降解及炎症反应。
李颖,王丁,肖武汉[5]（2021）在《长江江豚脐带永生化成纤维细胞系建立及细胞生长特性研究》文中研究指明取长江江豚（Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis）产后胎盘脐静脉,经组织块培养,差异贴壁法纯化,构建长江江豚的原代细胞系;经外源癌基因SV40 T antigens（猿猴病毒T抗原）转染构建稳定脐带细胞系,并对长江江豚的永生化后的成纤维细胞的细胞形态、转染效率、生长曲线和活率等进行探究。结果表明:（1）原代脐静脉细胞大约14d从组织边缘分离, 20d形成单层,细胞呈现典型的成纤维细胞状,梭形、不规则星行或多边形。原代细胞传代14代后出现老化和凋亡。（2）通过SV40 T antigens转染构建的细胞系可传代40—50次,证实转染SV40 T antigens后可增加细胞的增殖能力。（3）不同世代永生化的成纤维细胞复苏前后细胞活性并无明显差异,复苏细胞活性在90%以上,表明永生化后的细胞可以稳定保存。利用CCK-8法测得细胞的生长曲线呈现"S"型。（4）对永生化的细胞系进行后续基因表达尝试,通过转染外源基因绿色和红色荧光蛋白,转染外来质粒效率约为15%,说明外源基因可以表达,并能被成功检测。研究构建长江江豚的脐静脉来源的永生化后细胞系,为江豚的其他组织细胞系建立以及江豚细胞库的建立提供基础,成功对永生化后的细胞系进行外源基因的转染,为以后深入长江江豚相关基因和分子机制研究打下基础。
蔡文建[6]（2020）在《人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究》文中提出目的:通过构建不同组合的人源化肝细胞二维共培养体系,从细胞活性及主要细胞色素酶基因表达层面比较不同共培养体系作为代谢活化系统的优越性,并通过体外微核试验对优势共培养体系的代谢活化能力进行初步的验证,为人源化细胞共培养代谢活化系统在遗传毒性试验和致突变性试验中的应用提供理论基础和技术支持。方法:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:应用穿孔法制作共培养6孔板。选择人肝癌HepG2/C3A细胞、人结直肠腺癌Caco-2细胞、人肾小管上皮HK-2细胞、人脐静脉内皮HUVEC细胞、人肝星形LX-2细胞作为共培养模型构建的待选细胞系。分别设置各细胞的单独培养组,四种双细胞共培养组 HepG2/C3A-Caco2（CL）、HepG2/C3A-HK2（CH）、HepG2/C3A-HUVEC（CU）和 HepG2/C3A-LX2（CL）,以及六种三细胞共培养组HepG2/C3A-Caco2-HK2(（COH）、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC（COU）、HepG2/C3A-Caco2-LX2（COL）、HepG2/C3A-HK2-HUVEC（CHU）、HepG2/C3A-HK2-LX2（CHL）和HepG2/C3A-HUVEC-LX2（CLU）。每组设置3个重复。培养基联通后连续培养4d,观察细胞生长情况并应用CCK-8法测量细胞生长情况。单独培养组和共培养组处理一致。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:将连通后的共培养组细胞及单独培养细胞继续培养24h后收获细胞,加入裂解液进行裂解提取RNA。在不同共培养模型及单独细胞培养模型中,用RT-qPCR方法测量不同模型中的HepG2/C3A细胞的主要I相代谢酶CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9 以及主要Ⅱ相代谢酶 GSTA1/2 和UGT1A1的表达情况。3.优势共培养代谢活化模型的微核试验初步验证:选取细胞生长状态良好、主要P450代谢酶基因表达水平升高的共培养模型作为代谢活化系统。以体外胞质分裂阻滞微核试验验证模型的代谢活化效能。用典型需要代谢活化的致突变阳性物环磷酰胺（9.5、19和38μg/ml）和不需代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯（0.325、0.65和1.3μg/ml）进行染毒,设置空白对照和溶剂（超纯水和DMSO）对照组,试验操作与染毒组一致。滴片后用吉姆萨进行染色,计数1000个双核细胞的微核细胞数。结果:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:细胞接种24h后贴壁生长,加培养基连通共培养孔,连续观察4d,细胞生长状况良好,显微镜观察共培养细胞与单独培养细胞的形态均未发生显着变化。培养后2、3、4d的生长情况结果显示:在双细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HK2共培养模型中HK2细胞出现生长抑制,其余三种双细胞共培养模型在共培养2d及4d,细胞生长活性与单独培养的细胞差异无统计学意义（P>0.05）。在三细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HUVEC-LX2共培养模型中各细胞与单独培养时生长情况的差异无统计学意义（P>0.05）,其余各培养组在培养第3d或第4d,其共培养模型细胞活性显着大于单独培养模型中的活性（P<0.05）。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:Ⅰ相代谢酶基因表达水平在不同模型中差别较大。CYP1A2基因在HepG2/C3A-HUVEC、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的6.54、2.34、3.42倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2B6基因在HepG2/C3A-HUVEC共培养组表达量升高,为单独培养组的1.47倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2C9基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的4.2倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2E1基因 在 HepG2/C3A-Caco2、HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-LX2、HepG2/C3A-HUVEC 和 HepG2/C3A-HUVEC-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的1.63、1.33、1.85、1.62、3.4倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP3A4基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.88倍,差异有统计学意义（P<0.05）。UGT1A1基因在 HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.27、4.40、4.75倍,差异有统计学意义（P<0.05）。GSTA1A2基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的5.11倍,差异有统计学意义（P<0.05）。3.优势共培养代谢活化模型HepG2/C3A-Caco2-LX2的微核试验初步验证:不需要代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯染毒后,单独培养组的微核率分别为16‰、15‰、16‰,共培养组微核率分别为14‰、16‰、15‰,二者的微核率无明显差异（P>0.05）。环磷酰胺共培养组微核率（21‰、18‰、16‰）明显高于单独培养组（微核率12‰、13‰、12‰）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.双细胞共培养模型对细胞的生长状况影响较小,三细胞共培养模型中HepG2/C3A-HK2-Caco2共培养模型和HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型的细胞生长活性优于各细胞的单独培养模型,且生长稳定,有望成为稳定的共培养体系。2.HepG2/C3A细胞在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型中主要的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因表达升高。3.以HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型作为代谢活化系统能够在不加入S9的情况下验证致突变阳性物环磷酰胺的致突变性。
李昌玲[7]（2020）在《丹参多酚酸B对心脑血管疾病的作用及其机制的研究》文中研究表明研究背景糖尿病（diadetesmellitus,DM）是全球主要的慢性疾病之一,全世界约有3亿人罹患糖尿病,并且糖尿病前期患者数量仍在增加。根据流行病学调查,预计2030年将有4.5亿。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）作为糖尿病并发症之一,因其导致严重的心血管事件而引发关注。糖尿病心肌病是一种特异性的心肌疾病,与冠状动脉粥样硬化、高血压、心脏瓣膜病以及其他心脏病变无关,临床表现为早期的无症状的舒张功能障碍,晚期则发展为有症状的充血性心力衰竭。目前对糖尿病心肌病的机制研究主要集中于糖毒性、脂毒性、胰岛素抵抗、心肌纤维化、心肌肥大、心肌细胞凋亡及坏死、氧化应激等方面。心肌纤维化是糖尿病心肌病的主要病理变化,心肌纤维化增加心肌硬度,降低心肌顺应性,最终发展为心脏舒张、收缩和传导功能障碍,同时伴有动脉血管壁增生,使管腔缩小,降低毛细血管密度,减低心肌血氧供应,造成心脏功能损伤。研究发现冠状动脉微循环障碍是糖尿病患者心肌间质纤维化的重要原因,因此减轻微循环障碍引起的内皮功能障碍可能是有效缓解糖尿病心肌病进展的重要措施之一。因此增加毛细血管密度,促进血管生成,增加血氧供应,可以为糖尿病心肌病的治疗带来曙光。然而目前对糖尿病心肌病的微血管病变研究较少,因此探寻有效的药物促进血管生成并研究其作用机制具有重大的临床及实践意义。丹参多酚酸B（Salvianolic Acid B,Sal B）是中药丹参的主要化学成分之一。研究发现,丹参多酚酸B可以减轻缺血再灌注导致的心肌损伤,降低脑梗死模型动物的脑梗死体积和神经功能缺损评分,其作用可能是通过改善微循环障碍,促进血管生成有关。另外有研究表明,丹参多酚酸可以增加内皮细胞数量,促进内皮细胞管状结构生成,增加血管生成相关标志物VEGFA、VEGFR2、ANGPT1、ANGPT2、Tie2等的表达。因此,本研究中利用链脲佐菌素诱导小鼠1型糖尿病模型,明确丹参多酚酸B能否通过促进血管生成从而减轻糖尿病心肌病并深入探讨其分子机制,为中医药防治糖尿病心肌病提供思路,为中医药的进一步推广应用提供参考。研究目的1.研究丹参多酚酸B对糖尿病小鼠心肌重构及纤维化的作用;2.研究丹参多酚酸B对糖尿病心肌病小鼠血管生成的作用及机制。研究方法1.动物模型建立及丹参多酚酸体内给药C57BL/6J小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）溶液以构建1型糖尿病小鼠模型,并随机分为3组:糖尿病模型组、丹参多酚酸B低剂量治疗组（15mg/kg/d）、丹参多酚酸B高剂量治疗组（30mg/kg/d）。糖尿病造模成功后,丹参多酚酸B高低剂量治疗组小鼠开始以腹腔注射方式给予相应浓度的丹参多酚酸B干预,每日1次,正常对照组及糖尿病模型组小鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。丹参多酚酸B干预16周后,小鼠麻醉处死,留取血液及组织标本备用。2.超声心动图检测心功能小鼠取材前,采用多普勒超声成像技术评估各组小鼠的心脏功能,检测左心室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS）、早晚期二尖瓣流入血流速度比（E/A）和舒张早晚期二尖瓣半环速度峰值比（E’/A’）。3.组织学染色实验末期,收集各组小鼠心脏,浸泡于4%多聚甲醛中固定,按照标准步骤脱水,制备石蜡切片,H&E染色观察心脏大体形态及心肌细胞直径,天狼猩红及Masson染色检测心肌间质胶原含量,ColI、ColIII免疫组织化学染色观察相关胶原蛋白的表达,CD31免疫组化染色观察心肌中毛细血管密度。4.组织荧光免疫组化各组小鼠心脏石蜡切片,常规脱腊后,组织荧光免疫组化显示α-SMA及CD31的分布及表达情况。5.蛋白免疫印迹剪取心脏组织或收集刺激后细胞,提取蛋白,经过凝胶电泳、转膜等步骤检测相应蛋白在组间的表达差异。6.转录组测序收集各组小鼠心肌组织,进行转录组测序以探究其分子机制。7.实时定量RT-PCR剪取心脏组织或者收集细胞后,提取RNA,经过逆转录、PCR扩增等检测相关基因的mRNA在组间的表达差异。8.细胞培养HUVECs购买于美国ATCC公司,用含5%胎牛血清及1%生长因子的ECM培养基培养,常规方法换液及传代。9.CCK-8 检测HUVECs种植于96孔板中,给予0、10、50、100、1000ug/ml的丹参多酚酸B干预,24h后在酶标仪中检测各孔OD值以评价细胞活性。10.体外成管实验检测HUVECs分为对照组、乏氧组、Sal B组。将基质胶预先在4℃条件下过夜融化,第二天铺板,预冷的吸头吸取70ul基质胶到24孔板中,置于37℃孵箱中孵育30min,待其成胶。将经历不同的刺激之后的各组细胞,取200ul各组细胞悬液（密度:4*104/ml）铺到胶上。4小时后,倒置显微镜下观察细胞间管状结构形成程度并拍照保存。11.细胞免疫荧光化学染色采用细胞免疫荧光检测IGFBP3在各组间核转位情况。12.启动子甲基化检测收集各组细胞,进行启动子区域的甲基化水平检测。13.基因表达的干预在体外实验中,利用瞬时转染siRNA-IGFBP3的方式抑制内皮细胞IGFBP3的表达。14.细胞的迁移实验利用划痕实验及Transwell小室检测丹参多酚酸B对细胞迁移能力的影响。15.细胞周期利用流式细胞术检测细胞周期的分布。16.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理实验数据,结果以平均数+标准差表示。组间变量采用单因素方差分析检验,P小于0.05认为有统计学差异。研究结果1.小鼠的一般特性1型糖尿病造模成功后,小鼠的尾静脉随机血糖水平明显升高。低剂量或高剂量的丹参多酚酸B药物干预后,对随机血糖的影响未见明显变化。糖尿病小鼠造模成功后即出现消瘦、多饮、多食等症状,给予高低剂量的丹参多酚酸B治疗后可缓解上述糖尿病小鼠的症状。2.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠的心肌重构及心功能异常各组小鼠给予丹参多酚酸B等相应干预16周后,观察各组小鼠心脏形态及功能变化。相较于正常组小鼠,糖尿病组小鼠表现为心脏变大、心尖圆钝、心肌细胞横截面积增加。高低剂量丹参多酚酸B药物治疗后,相较于糖尿病组,心脏缩小、室壁变薄及心肌细胞横截面积降低。通过测量心重量及体重,丹参多酚酸B药物降低了糖尿病小鼠的心脏体重比（HW/BW）。相较于正常对照组小鼠,糖尿病导致小鼠心脏功能下降,而高低剂量的丹参多酚酸B治疗可提高心功能指标,增强糖尿病小鼠心功能。然而各组小鼠左室长轴切面左室舒张末期内径（LVEDd）未见统计学差异。3.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化组织学染色结果显示,相较于正常对照组小鼠,糖尿病导致小鼠心肌组织中胶原纤维明显增多,表现为心脏的广泛纤维化;丹参多酚酸B干预能够减低糖尿病小鼠心肌组织胶原含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达。4.丹参多酚酸B增加糖尿病小鼠心肌组织血管生成CD31的免疫组织化学染色结果显示,与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠CD31蛋白表达显着减少,即毛细血管密度降低,高、低剂量的丹参多酚酸B干预后,糖尿病小鼠心肌组织中CD31表达增加,提高了毛细血管密度。应用CD31和α-SMA荧光共定位染色显示,糖尿病小鼠心肌中成熟血管数量明显少于正常组小鼠,而高、低剂量的丹参多酚酸B治疗可改善上述变化。Western blot检测结果显示糖尿病小鼠心肌组织血管内皮生长因子VEGFA及其受体VEGFR2表达减少,而丹参多酚酸B治疗可促进其表达,实验结果与免疫组化结果一致。5.丹参多酚酸B通过降低IGFBP3表达促进血管生成小鼠心肌组织的转录组测序结果显示,糖尿病小鼠心肌中IGFBP3高表达,而高低剂量的丹参多酚酸B治疗后可降低IGFBP3的水平。心肌组织实时定量RT-PCR结果进一步表明,高低剂量的丹参多酚酸B治疗可改善糖尿病小鼠心肌中IGFBP3 mRNA水平的高表达。6.丹参多酚酸B通过激活p-AKT和p-ERK信号通路促进血管生成各组小鼠心肌组织免疫印迹实验结果表明,高、低剂量的丹参多酚酸B治疗组小鼠心肌组织中AKT及ERK信号通路的磷酸化水平升高。7.丹参多酚酸B增强脐静脉内皮细胞的活性CCK-8实验显示,50ug/ml的丹参多酚酸B对内皮细胞活性的促进作用最强,故50ug/ml的丹参多酚酸B用于随后的试验中。8.丹参多酚酸B促进HUVECs血管生成Western blot实验表明,丹参多酚酸B治疗乏氧环境中的HUVECs 24h更能促进VEGFA、VEGFR2的表达。体外细胞成管实验表明,乏氧环境下内皮细胞的成管能力显着降低,而丹参多酚酸B治疗则可以挽救细胞降低的成管能力。9.丹参多酚酸B促进IGFBP3向胞浆转位蛋白免疫印迹检测及细胞免疫荧光检测表明,乏氧条件下内皮细胞内IGFBP3主要在胞核内表达,胞浆内表达较少,给予丹参多酚酸B治疗后,胞核内IGFBP3表达降低,胞浆中表达增多。10.丹参多酚酸B增强IGFBP3启动子区域甲基化丹参多酚酸B降低IGFBP3表达是通过增强IGFBP3启动子区域甲基化实现的。11.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3增强细胞成管能力利用siRNA抑制IGFBP3表达后,基质胶内细胞成管能力增强。12.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3促进细胞迁移划痕实验及transwell小室实验结果表明,抑制IGFBP3表达后乏氧环境下内皮细胞迁移能力增强。13.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3促进细胞增殖流式细胞术检测结果表明,抑制IGFBP3活性后,乏氧环境下内皮细胞处于S期及G2期比例增加,促进了内皮细胞的增殖。14.丹参多酚酸B通过p-AKT及p-ERK信号通路调控IGFBP3的表达蛋白免疫印迹实验显示丹参多酚酸B治疗或si-IGFBP3均能增加AKT及ERK磷酸化水平。研究结论1.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠心肌重构、心肌纤维化及心脏功能;2.丹参多酚酸B通过降低IGFBP3活性促进糖尿病心肌病小鼠心肌血管生成;3.丹参多酚酸B能够促进IGFBP3的胞浆转位;4.丹参多酚酸B能够通过促进IGFBP3启动子区域甲基化以降低IGFBP3的活性;5.丹参多酚酸B通过增强p-AKT及p-ERK信号通路调控IGFBP3从而改善糖尿病心肌病血管生成。研究背景脑血管病在全球范围内具有前三位的致死性和首位的致残性,其中缺血性脑卒中占卒中事件的87%,对人们的健康带来严重危害。脑组织供血中断后,血流低灌注,微血管损伤,血脑屏障破坏,引起神经元坏死、凋亡。梗死周围半暗带区域因为仍存有部分未死亡的脑组织,被认为是减轻脑梗死损伤的治疗靶标,而改善微血管损伤增加血运以恢复血氧供应是长期以来治疗缺血性脑梗死的有效治疗方法。丹参多酚酸B（Salvianolic Acid B,Sal B）是中药丹参的主要化学成分之一。传统中医学认为,丹参具有活血化瘀的功效,常用于治疗心脑血管疾病。而现代研究发现,丹参多酚酸B可以减轻缺血再灌注导致的心肌损伤,其作用可能是通过改善微循环障碍,促进血管生成有关。丹参多酚酸B可以增加内皮细胞数量,促进内皮细胞管状结构生成,增加血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ANGPT1、ANGPT2、Tie2等的表达。我们的前期研究也发现,丹参多酚酸B通过降低内皮细胞IGFBP3的表达,促进心肌血管生成从而改善糖尿病心肌病心脏功能。另外,研究发现丹参多酚酸B可以降低脑梗死模型动物的脑梗死体积和神经功能缺损评分,其作用是通过促进血管生成实现。因此,本研究中利用缺血性脑卒中大鼠为实验模型,探究丹参多酚酸B通过促进血管生成从而改善缺血性脑卒中大鼠神经功能的分子机制,以期提供可供选择的、安全的临床药物。研究目的1.研究丹参多酚酸B对缺血性脑卒中大鼠神经损伤的作用;2.研究丹参多酚酸B促进缺血性脑卒中大鼠血管生成的作用及机制;3.研究丹参多酚酸B对STC1表达的影响及其机制。研究方法1.动物模型建立及丹参多酚酸体内给药购买230g左右雄性SD大鼠,适应性喂养后采用Longa线栓法创建缺血性脑卒中（pMCAO）大鼠模型。造模方法为:麻醉后大鼠仰卧位固定,颈部消毒后正中切口,右侧颈总动脉钝性游离,分离出颈内、外动脉,结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,随后血管夹夹闭颈内动脉,可见结扎段内血管充盈,在靠近颈总动脉结扎处用注射器扎一小口,从该口处插入线栓并沿颈总动脉插入颈内动脉,在颈内动脉内深度约2cm后结扎固定线栓,随后将皮肤缝合并充分消毒,腹腔注射4ml生理盐水补充体液耗损,放置于保温毯上,栓塞2h后将线栓拔出约1cm,剪除外漏线栓。将造模成功的大鼠随机分为3组:缺血性脑卒中大鼠模型组（OG）、丹参多酚酸B低剂量组（10mg/kg/d）（SalB-L）、丹参多酚酸B高剂量组（20mg/kg/d）（Sal B-H）。假手术组大鼠（Sham）动脉血管内不插入线栓,其余手术操作过程完全相同。造模成功后,丹参多酚酸B高、低剂量组大鼠开始以腹腔注射方式给予相应浓度的丹参多酚酸B,每日1次,假手术组及缺血性脑卒中模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。2.神经功能评定大鼠取材前,大鼠的神经功能缺损情况利用Longa5分制标准法检测。3.蛋白免疫印迹剪取各组大鼠梗死区脑组织,经蛋白提取、凝胶电泳、转膜后,检测相关蛋白在组间的差异性表达。4.梗死体积评定过量麻醉大鼠,迅速断头取脑,脑组织冠状面切片,2%的2,3,5氯化三苯基四氮唑染液（TTC）检测各层脑组织缺血梗死情况。5.组织学染色收集各组大鼠脑组织,用4%多聚甲醛固定,经标准步骤脱水制备石蜡切片,进行H&E染色观察神经元损伤情况,进行Nissl染色观察尼氏小体损伤情况。6.组织荧光免疫组化收集各组大鼠脑组织,4%多聚甲醛固定24h后梯度蔗糖溶液沉糖脱水,OCT包埋后冰冻切片机切片。应用免疫组织荧光染色,观察脑组织内神经元损伤情况、毛细血管密度及STC1表达情况。7.TUNEL 染色各组大鼠脑组织冰冻切片进行TUNEL染色以观察神经元凋亡情况。8.提取原代皮层神经元购买新生24h内大乳鼠,断头取脑后提取原代皮质神经元,鉴定后检测丹参多酚酸B的含药血清对神经元凋亡的影响。9.主动脉环出芽实验剪取大鼠胸主动脉环,给予Matrigel基质胶培养,观察各组含药血清对主动脉环出芽情况的影响。10.细胞培养购买HUVECs,常规方法换液、传代及冻存。11.基因表达的干预在体外实验中,利用瞬时转染siRNA-STC1的方式抑制细胞STC1的表达。12.体外成管实验检测HUVECs分为对照组、乏氧组、乏氧加Sal B组、乏氧加抑制STC1表达组、乏氧加丹参多酚酸B加抑制STC1表达组。将基质胶预先在4℃条件下过夜融化,第二天铺板,预冷的吸头吸取70ul基质胶到24孔板中,置于37℃孵箱中孵育30min,待其成胶。将经历不同的刺激之后的各组细胞,取200ul各组细胞悬液（密度:4*104/ml）铺到胶上。4小时后,观察计算细胞管状结构长度及数量。13.细胞的迁移实验利用划痕实验及Transwell小室观察丹参多酚酸B对内皮细胞迁移能力的影响。14.细胞的增殖实验利用Edu增殖实验观察丹参多酚酸B对内皮细胞增殖能力的影响。15.统计学分析所有实验结果均应用SPSS 18.0软件统计分析,且以平均数±标准差表示。多组间的变量运用单因素方差分析检验,P小于0.05认为有统计学意义。研究结果1.丹参多酚酸B促进缺血性脑梗死大鼠脑组织血管生成缺血性脑梗死大鼠造模成功后,给予单身多酚酸B腹腔注射给药,提取各组大鼠脑组织蛋白,western blot结果显示相较于丹参多酚酸B给药2w,丹参多酚酸B给药2w更能促进VEGFR2、VEGFA蛋白的表达,故采用丹参多酚酸B给药3周用于随后的实验。2.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤高、低剂量的丹参多酚酸B给药3周后,Longa5分标准法评定结果显示,丹参多酚酸B能够降低神经功能损伤评分。3.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠梗死体积TTC染色结果发现,丹参多酚酸B可以减轻梗死体积。4.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠脑组织损伤H&E染色剂Nissl染色结果发现,丹参多酚酸B可以减轻脑损伤。Cleaved-caspase3的免疫组织化学染色结果及TUNEL染色结果显示,模型组大鼠梗死区神经元凋亡明显,给予丹参多酚酸B治疗后,凋亡的神经元明显减少。脑组织梗死区的Western blot检测结果显示,凋亡相关蛋白的表达在模型组升高,丹参多酚酸B治疗后表达降低。进一步的原代神经元细胞培养后,乏氧刺激后,给予各实验组大鼠血清继续培养,TUNEL染色及western blot检测结果均表明,丹参多酚酸B能够减轻原代神经元的凋亡。5.丹参多酚酸B能够促进缺血性脑卒中大鼠脑组织血管生成CD31的免疫组织化学染色结果显示,与假手术组大鼠相比,缺血性脑卒中组大鼠CD31蛋白表达显着减少,高、低剂量的丹参多酚酸B干预后,缺血性脑卒中大鼠脑组织中CD31表达增加。主动脉环出芽实验显示,乏氧条件下的主动脉环出芽减少,给予丹参多酚酸B含药血清培养后,主动脉环出芽增多,进一步表明丹参多酚酸B促进血管生成。6.丹参多酚酸B通过促进STC1表达促进血管生成大鼠脑组织STC1的免疫组化结果显示,假手术组大鼠脑组织中几乎不表达STC1,缺血性脑卒中大鼠STC1表达增多,而高、低剂量的丹参多酚酸B治疗进一步提高STC1的表达。体内外的western blot检测结果进一步显示,丹参多酚酸B治疗可以增加乏氧依赖性的STC1的表达。7.抑制STC1的表达可抑制人脐静脉内皮细胞的迁移丹参多酚酸B可以促进乏氧条件下人脐静脉内皮细胞的迁移作用,转染si-RNA抑制STC1的表达后,丹参多酚酸B对细胞迁移的促进作用降低。8.丹参多酚酸B通过激活mTOR/AKT信号通路促进血管生成各组大鼠脑组织免疫印迹实验结果表明,高、低剂量的丹参多酚酸B治疗组大鼠脑组织中AKT及ERK信号通路的磷酸化水平升高。研究结论1.丹参多酚酸B能够提高缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积;2.丹参多酚酸B能够通过促进脑组织血管生成进而减轻缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡;3.丹参多酚酸B通过提高STC1活性促进缺血性脑卒中大鼠脑组织血管生成;4.丹参多酚酸B可能通过激活mTOR/AKT信号通路促进缺血性脑卒中大鼠血管生成。
张晓星[8]（2019）在《HUVECs来源的外泌体治疗缺血性脑卒中的实验性研究》文中进行了进一步梳理背景:缺血性脑卒中目前是导致全球成人残疾最主要的原因之一,目前主要的治疗方法是超急性期溶栓,预后大多不理想。因此,有效的治疗脑卒中,促进脑卒中后的组织修复和功能重建具有重要意义。人脐静脉内皮细胞对受损的神经元具有保护作用,能够抑制受损神经元的凋亡,促进神经干细胞的增殖与分化。但是,关于人脐静脉内皮细胞来源的外泌体在促进脑卒中后血管新生、神经元再生及突触重塑方面的研究较少。目的:评价人脐静脉内皮细胞来源的外泌体是否能够减小缺血性脑卒中后梗塞的体积,促进梗塞边缘区血管新生及神经元再生,加速突触的重塑,改善缺血性脑卒中后神经功能的恢复。方法:培养人脐静脉内皮细胞,收集上清液,提取人脐静脉内皮细胞分泌的外泌体。NTA检测外泌体的粒径、电镜检测外泌体的形态、Western blot检测外泌体表面蛋白标志物。制备小鼠短暂性大脑中动脉栓塞模型（tMCAO）。实验组在tMCAO模型成功后24小时内尾静脉注射30ug总蛋白量（溶于100 ulPBS）的外泌体,对照组注射等量的PBS溶液,分别在1、3、7、14、28天对缺血性卒中后的小鼠进行mNSS评分。术后28天处死小鼠取材。焦油紫染色观察梗塞体积的大小,CD31/BrdU免疫荧光检测梗塞边缘区血管的形成,DCX/BrdU,NeuN/BrdU免疫荧光染色检测梗塞边缘区神经的再生,免疫印迹法检测梗塞边缘区Synaptophysin及PSD-95的表达情况,检测突触重塑。结果:1.NTA检测外泌体粒镜范围在30-100nm,外泌体在电镜下形态呈现圆形,外泌体表面蛋白标志物CD9、CD63、CD81呈阳性。2.HUVECs来源外泌体处理组脑组织梗塞体积较PBS组显着减小。3.HUVECs来源外泌体能促进缺血性脑卒中后梗塞边缘区新生血管及神经元的形成,加速突触的重塑及改善神经功能预后。结论:人脐静脉内皮细胞来源外泌体能够促进缺血性脑卒中的恢复。
李盛波,郑勇斌[9]（2018）在《人脐静脉内皮细胞永生化的研究进展》文中研究指明原代人脐静脉内皮细胞培养技术存在诸多不足,永生化能延长细胞生命周期并保持稳定的内皮细胞源性,使不同细胞及细胞代之间保持同质性,为血管内皮细胞及其相关疾病的研究提供良好的细胞模型。目前以猿猴病毒40大T抗原基因和人端粒酶逆转录酶催化亚基基因诱导人脐静脉内皮细胞永生化最常用;介导外源基因进入内皮细胞的载体常见的有病毒类和非病毒类两种,以逆转录病毒载体或慢病毒载体最常用。可回复性永生化技术有望为内皮细胞永生化提供更好的选择性。
王薇[10]（2018）在《高糖高脂环境下Wnt7a对创面血管生成及炎症表达的影响》文中提出研究背景:糖尿病状态下创面愈合过程延迟。创面愈合是一个复杂的动态过程,主要包括三个阶段:炎症反应期、增生期以及重塑期,依靠众多细胞、细胞因子及信号通路等共同参与。理解愈合的分子基础对于皮肤创面的防治有非常重要的意义,造成其创面难愈的因素复杂,存在血管内皮细胞等多种细胞功能失调所致新生血管减少、局部炎症浸润增加等。尽管肥胖作为糖尿病的一个常见的危险因素,对其在影响创面愈合作用的机制研究还是相对匮乏。目的:本次实验拟通过评价人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）在不同葡萄糖及软脂酸的作用下,形态及功能的改变,筛选出在Wnt家族中表达发生显着差异的Wnt7a蛋白并联合细胞实验及动物实验共同评价Wnt7a蛋白对血管内皮细胞在血管生成及炎症反应上的调节作用。方法:通过对不同浓度葡萄糖（D-glucose,Glc）/和软脂酸（palmitic acid,PA）作用于HUVECs细胞,评价其在细胞形态、迁移功能、血管生成以及Wnt信号通路相关mRNA的转录改变进行讨论,选择与功能密切相关的通路蛋白。使用大剂量链佐星（streptozocin,STZ）单次尾静脉注射诱导的大鼠糖尿病以及联合高脂饲料构建的大鼠高脂糖尿病模型,采用对称性背部制造圆形皮肤全层缺损（直径约13.5 mm）的方法,构建创面模型,对创面构建的第0,1,2,4,7,10,14天统一光线、方向、距离进行拍照,采用Masson染色观察创面组织形态学变化,比较皮肤基本属性及创面愈合速度的差异,并在创周局部注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）稀释的Wnt7a蛋白（100 ng）前后,对创面进行血管生成以及炎症改善相关的免疫组化、酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）、流式细胞分析或者蛋白免疫印迹实验（western blotting,WB）进行研究。结果:Wnt7a在高糖及高糖高脂作用下,在脐静脉内皮细胞上的表达减少,动物实验也证实了这个结论。糖尿病以及高脂糖尿病模型上大鼠的皮肤愈合速度相较于正常组都显着下降,通过局部创周注射Wnt7a蛋白,这两个代谢异常组的创面愈合率在愈合早期（第2天,d2）较未注射组没有显着差异,但到了愈合末期（第10天,d10）愈合的速度较未处理的两组速度显着提升,且与创面新生血管数量、CD31密度、一氧化氮（nitric oxide,NO）及内皮性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的浓度都显着增加;而通过对愈合过程中创周的病理学分析其炎症浸润情况、创周免疫细胞类型分析以及炎症相关蛋白,主要是L-selectin、ICAM-1、IL-6/8等的转录及表达发现在愈合末期局部使用Wnt7a蛋白的高糖高脂组的炎症症状显着改善,具有统计学意义。结论:本次研究首次将Wnt信号通路家族中的Wnt7a蛋白与糖尿病创面联系起来,特别强调了高脂代谢对糖尿病创面延迟愈合中的影响,并展示了该蛋白对于这两种代谢异常状态下受损血管功能上的调节以及炎症应激反应的平衡方面的重要作用,以及对局部应用于糖尿病创面促进其愈合的潜在可能。
二、永生化人脐静脉内皮细胞重建成功（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、永生化人脐静脉内皮细胞重建成功（论文提纲范文）
（1）猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化（论文提纲范文）
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 人骨髓间充质干细胞的培养、传代 |
| 1.4.2 携带猴空泡病毒40大T抗原基因的慢病毒包装 |
| 1.4.3 永生化人骨髓间充质干细胞株的建立 |
| 1.4.4 永生化人骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 细胞形态学特征 |
| 2.2细胞生长曲线 |
| 2.3 q RT-PCR检测人骨髓间充质干细胞中猴空泡病毒40大T抗原基因的表达 |
| 2.4 Western blot检测人骨髓间充质干细胞中猴空泡病毒40的表达 |
| 2.5 永生化人骨髓间充质干细胞表面标记的表达 |
| 2.6 永生化人骨髓间充质干细胞株的分化潜能 |
| 3 讨论Discussion |
（2）仿生构建功能化小口径组织工程血管（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 仿生内皮细胞功能构建抗血栓组织工程血管 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 仿生构建定向排列纤维结构的双网络水凝胶血管 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 细胞化三层复合材料小口径血管的生物打印 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血管与血管化组织的生物打印 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（3）CRISPR/Cas9介导可逆永生化内皮细胞系建立及主动脉瓣疾病潜在应用分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 1.HUVEC简介 |
| 2.HUVEC细胞系建立的意义及难点 |
| 3.SV40 LT可诱导正常细胞永生化 |
| 4.永生化HUVEC现阶段困境 |
| 5.CRISPR/Cas9可建立可逆性永生化HUVEC模型 |
| 6.可逆性永生化HUVEC模型的潜在应用 |
| 二、研究材料 |
| 1.研究所用细胞 |
| 2.研究所用菌株 |
| 3.质粒 |
| 4.培养基 |
| 5.抗体 |
| 6.引物 |
| 7.试剂 |
| 8.主要实验溶液的配制 |
| 9.主要实验耗材 |
| 10.主要仪器设备 |
| 三、研究方法 |
| 1.细胞培养 |
| 2.质粒转化、扩增 |
| 3.质粒小提 |
| 4.琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.琼脂糖凝胶回收 |
| 6.质粒大提 |
| 7.慢病毒包装 |
| 8.永生化HUVEC细胞株的建立 |
| 9.流式分选GFP阳性的HUVEC细胞 |
| 10.细胞总蛋白的提取 |
| 11.蛋白质免疫印迹(Western Blotting) |
| 12.细胞基因组DNA提取 |
| 13.细胞基因组PCR检测SV40 LT/Cas9基因 |
| 14.细胞爬片间接免疫组织化学 |
| 15.Lectin结合试验 |
| 16.Matrigel检测微血管管型形成 |
| 17.细胞总RNA提取 |
| 18.Lv-EF1α-Cas9-IRES-SV40 LT质粒的构建 |
| 19.Cas9稳定表达细胞株的建立 |
| 20.IentiGuide-SV40 LT-gRNA-mcherry质粒的构建 |
| 21.CRISPR/Cas9技术敲除SV40 LT基因 |
| 22.数据收集 |
| 23.基因差异表达分析 |
| 24.主成分分析(Principal Component Analysis,PCA) |
| 25.差异基因聚类 |
| 26.miRNA差异表达分析 |
| 27.miRNA与差异基因调控网络 |
| 28.统计学方法 |
| 四、研究结果 |
| 1.两步法构建表达Cas9蛋白的永生化HUVEC细胞株 |
| 1.1 永生化HUVEC细胞株的建立 |
| 1.2 HUVEC2-TG内皮细胞性质的鉴定 |
| 1.3 利用HUVEC2-TG转染Cas9建立Cas9和SV40 LT双表达的永生化HUVEC细胞株 |
| 1.4 HUVEC2-CTG内皮细胞性质的鉴定 |
| 2.一步法构建表达Cas9蛋白的永生化HUVEC细胞株 |
| 2.1 Lv-EF1α-Cas9-IRES-SV40 LT质粒的构建 |
| 2.2 表达Cas9蛋白的永生化HUVEC细胞株的建立 |
| 3.CRISPR/Cas9技术可逆性调控人脐静脉内皮细胞的永生化 |
| 3.1 CRISPR/Cas9技术敲除SV40 LT基因 |
| 3.2 利用自身表达的Cas9蛋白gRNA引导SV40 LT切除后内皮细胞功能特性研究 |
| 4.主动脉瓣钙化患者基因表达与microRNA调控研究 |
| 4.1 差异基因筛选及PCA分析 |
| 4.2 差异基因聚类 |
| 4.3 miRNA-差异基因调控网络 |
| 4.4 CAVD相关原因分析 |
| 五、讨论 |
| 小结 |
| 缩略语表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 膝骨关节炎的治疗与研究进展(文献研究) |
| 1. 现代医学对膝骨关节炎的治疗进展 |
| 1.1 骨关节炎的发病机制 |
| 1.2 骨关节炎的危险因素 |
| 1.3 骨关节炎的治疗进展 |
| 2. 传统医学治疗膝骨关节炎的研究进展 |
| 2.1 中医对膝骨关节炎病因病机的认识 |
| 2.2 膝骨关节炎的中医辨证施治研究现状 |
| 2.3 温经通络法治疗膝骨关节炎的研究现状 |
| 第二部分 靶向抑制血管侵袭治疗骨关节炎的理论基础及研究现状(文献研究) |
| 1 血管生成在骨关节炎发病中的作用 |
| 1.1 血管生成与VEGF |
| 1.2 VEGF信号异常在骨关节炎中的作用研究 |
| 2. 靶向抑制血管生成治疗骨关节炎研究现状 |
| 2.1 靶向抑制血管生成调控骨关节炎的实验研究 |
| 2.2 靶向抑制血管生成调控骨关节炎的临床研究 |
| 第三部分 温经通络汤对永生化人脐静脉内皮细胞功能的调控作用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 人脐静脉永生化内皮细胞 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 温经通络汤含药血清制备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 永生化人脐静脉内皮细胞的培养 |
| 2.2 CCK8检测永生化人脐静脉内皮细胞增殖情况 |
| 2.3 划痕实验观察永生化人脐静脉内皮细胞增殖情况 |
| 2.4 Transwell实验观察永生化人脐静脉内皮细胞迁移情况 |
| 2.5 管腔形成实验 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 CCK8检测不同浓度温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)增殖的影响 |
| 3.2 划痕实验观察4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)迁移的影响 |
| 3.3 Transwell细胞迁移实验观察4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)迁移的影响 |
| 3.4 4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)管腔形成能力的作用 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四部分 基于蛋白组学研究温经通络汤对永生化人脐静脉内皮细胞的调控作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及干预 |
| 2.2 蛋白质提取 |
| 2.3 电泳 |
| 2.4 TMT标记 |
| 2.5 蛋白质谱分析 |
| 2.6 数据分析 |
| 2.7 生信分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 含药血清和空白血清干预后两组细胞差异蛋白比较 |
| 3.2 Gene Ontology(GO)富集分析 |
| 3.3 KEGG通路富集分析 |
| 3.4 亚细胞定位分析 |
| 3.5 结构域注释及富集分析 |
| 3.6 聚类分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第五部分 网络药理学研究温经通络汤治疗膝骨关节炎的作用机制 |
| 1. 实验方法 |
| 1.1 温经通络汤主要活性成分及基因靶点的查询与筛选 |
| 1.2 膝骨关节炎疾病的相关靶点筛选 |
| 1.3 温经通络汤治疗膝骨关节炎靶标网络构建 |
| 1.4 PPI蛋白质相互作用网络构建及核心基因筛选 |
| 1.5 GO功能与KEGG通路富集分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 温经通络汤有效成分的筛选 |
| 2.2 温经通络汤治疗KOA靶点的韦恩图 |
| 2.3 药物活性成分-疾病靶点网络构建 |
| 2.4 温经通络汤治疗膝骨关节炎的靶点蛋白相互作用分析 |
| 2.5 温经通络汤治疗膝骨关节炎的GO富集分析 |
| 2.6 温经通络汤治疗膝骨关节炎的KEGG通路富集分析 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第六部分 ACLT模型鼠术后不同病理阶段血管生成及相关信号通路的变化情况 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 动物分组 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 前交叉韧带横断手术诱导的膝骨关节炎模型构建 |
| 2.2 化学染色分析骨关节炎病变程度 |
| 2.3 免疫组化分析ADAMTS5及COL- Ⅱ表达情况 |
| 2.4 免疫荧光分析CD31阳性表达情况 |
| 2.5 Western blot检测COX2、iNOS、VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT通路表达情况 |
| 2.6 RT-PCR检测VEGF-A、VEGFR-2、ADAMTS5及Ⅱ型胶原表达情况 |
| 2.7 Elisa检测血清中IL-6,TNF-a,IL-1β,COMP表达 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 术后不同时间各组H-E及Safranin-O染色结果 |
| 3.2 术后不同时间各组小鼠血清COMP表达情况 |
| 3.3 术后不同病理阶段软骨及循环血中炎症因子表达情况 |
| 3.4 术后不同病理阶段软骨ADAMTS5和COL-Ⅱ表达特点 |
| 3.5 术后不同病理阶段软骨中血管生成情况 |
| 3.6 术后不同病理阶段软骨中VEGF-A/VEGFR2信号通路表达规律 |
| 3.7 术后各病理阶段PI3K/AKT通路在软骨中的表达变化 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第七部分温经通络汤调控VEGF-A/VEGFR2相关通路介导的血管生成干预膝骨关节炎进程的作用研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 动物分组 |
| 1.3 药物制备 |
| 1.4 试剂及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HE染色分析骨关节炎病变程度 |
| 2.2 Western blot检测软骨COX2、iNOS、COL-X、VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT、ERK1/2通路蛋白表达情况 |
| 2.3 RT-PCR检测软骨中VEGF-A/VEGFR2信号通路表达情况 |
| 2.4 免疫组化检测软骨COL-Ⅱ表达情况 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 温经通络汤延缓膝骨关节炎小鼠病理进程作用 |
| 3.2 温经通络汤调控膝骨关节炎小鼠软骨基质中COL-Ⅱ及COL-X的作用 |
| 3.3 温经通络汤调控膝骨关节炎小鼠软骨基质中炎症介质INOS及COX-2的作用 |
| 3.4 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织VEGF-A/VEGFR2信号通路表达的影响 |
| 3.5 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织ERK1/2信号通路表达的影响 |
| 3.6 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织PI3K/AKT信号通路表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 结语 |
| 1. 结论 |
| 2. 创新之处 |
| 3. 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 共培养模型的构建及模型中细胞活性的测定 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 共培养细胞基本情况与共培养分组 |
| 1.3 细胞生长情况的测量 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 共培养细胞生长状况 |
| 2.2 CCK-8法比较单独培养与共培养细胞的生长情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 模型中肝细胞主要代谢相关酶基因表达情况 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 细胞基本情况和共培养及单独培养组别设置 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 主要Ⅰ相代谢酶基因的表达情况 |
| 2.2 主要Ⅱ相代谢酶基因的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 共培养模型代谢活化能力的初步验证 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 细胞基本情况 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 微核试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 HepaRG肝细胞的基本特征和应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及在学期间发表论文 |
（7）丹参多酚酸B对心脑血管疾病的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 丹参多酚酸B通过促进心肌血管生成改善糖尿病心肌病的心脏功能和心室重构 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 创新点和限制性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 丹参多酚酸B通过促进血管生成改善脑卒中大鼠的神经损伤 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 创新点和限制性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 附英文论文Ⅰ |
| 附英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）HUVECs来源的外泌体治疗缺血性脑卒中的实验性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 一、绪论 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 研究对象、实验仪器、试剂及试剂的配置 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 主要试验试剂 |
| 2.1.4 液体的配置 |
| 2.2 HUVECs细胞的复苏、培养、传代、冻存 |
| 2.2.1 配置主要试剂 |
| 2.2.2 HUVECs细胞复苏 |
| 2.2.3 HUVECs细胞换液 |
| 2.2.4 HUVECs细胞传代 |
| 2.2.5 HUVECs细胞冻存 |
| 2.3 HUVECs外泌体的提取与鉴定 |
| 2.3.1 HUVECs外泌体的提取 |
| 2.3.2 透射电子显微镜观察HUVECs外泌体的形态及大小 |
| 2.3.3 NTA检测HUVECs外泌体粒径 |
| 2.3.4 Western Blot检测HUVECs外泌体特征性标志物 |
| 2.4 栓线制备及小鼠短暂性大脑中动脉栓塞模型制作 |
| 2.5 小鼠尾静脉注射人脐静脉内皮细胞来源外泌体 |
| 2.6 小鼠BrdU腹腔注射给药 |
| 2.7 小鼠认知损伤的行为学检测 |
| 2.8 小鼠灌注断头取脑 |
| 2.9 小鼠脑冰冻切片的制备 |
| 2.10 小鼠脑片焦油紫染色及脑梗体积的计算 |
| 2.11 小鼠脑组织免疫荧光染色 |
| 2.12 Western Blot检测Synaptophysin及 PSD-95 表达 |
| 三、统计分析 |
| 四、结果 |
| 4.1 培养HUVECs细胞 |
| 4.2 HUVECs-exo特征鉴定 |
| 4.2.1 Nanosight检测粒径及浓度 |
| 4.2.2 透射电镜观察外泌体形态 |
| 4.2.3 HUVECs-exo总蛋白浓度及表面标志物检测 |
| 4.3 评价小鼠大脑中动脉闭塞造模结果 |
| 4.4 HUVECs-exo促进脑缺血性卒中后的神经功能恢复 |
| 4.5 HUVECs-exo能够减少缺血性卒中后梗死体积 |
| 4.6 HUVECs-exo促进缺血性卒中后神经元新生 |
| 4.7 HUVECs-exo促进脑缺血性卒中后血管新生 |
| 4.8 HUVECs-exo促进缺血性卒中后突触的再生 |
| 五、讨论 |
| 六、研究不足及展望 |
| 七、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（9）人脐静脉内皮细胞永生化的研究进展（论文提纲范文）
| 1 原代HUVECs培养技术 |
| 2 永生化的定义及途经 |
| 3 HUVECs永生化相关载体 |
| 4 HUVECs永生化的方法 |
| 4.1 hTERT与HUVECs永生化 |
| 4.2 SV40LT与HUVECs永生化 |
| 4.3 其他方法 |
| 4.4 可回复性永生化 |
| 5 永生化HUVECs的检测 |
| 6 结语 |
（10）高糖高脂环境下Wnt7a对创面血管生成及炎症表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语及符号 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 DU的病理基础及可能病因 |
| 1.2 Wnt信号通路与DU的关系 |
| 1.3 慢性炎症与DU的关系 |
| 1.4 Wnt信号通路与炎症的可能关系 |
| 1.5 研究目的及设想 |
| 参考文献 |
| 第二章 糖尿病慢性创面与WNT信号通路的联系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.3 统计方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 糖尿病大鼠及高脂糖尿病大鼠皮肤的基本属性及WNT7A对皮肤血管生成的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法及步骤 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 WNT7A蛋白对创面愈合炎症反应的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 实验方法及步骤 |
| 4.2.3 统计方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
四、永生化人脐静脉内皮细胞重建成功（论文参考文献）
- [1]猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化[J]. 张露文,戴鹏秀,张翊华,陈奕静,王璟璐,李佳锴. 中国组织工程研究, 2022(13)
- [2]仿生构建功能化小口径组织工程血管[D]. 霍达. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]CRISPR/Cas9介导可逆永生化内皮细胞系建立及主动脉瓣疾病潜在应用分析[D]. 邵晗琪. 北京协和医学院, 2021
- [4]基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制[D]. 钱佳佳. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]长江江豚脐带永生化成纤维细胞系建立及细胞生长特性研究[J]. 李颖,王丁,肖武汉. 水生生物学报, 2021(01)
- [6]人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究[D]. 蔡文建. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [7]丹参多酚酸B对心脑血管疾病的作用及其机制的研究[D]. 李昌玲. 山东大学, 2020
- [8]HUVECs来源的外泌体治疗缺血性脑卒中的实验性研究[D]. 张晓星. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]人脐静脉内皮细胞永生化的研究进展[J]. 李盛波,郑勇斌. 医学综述, 2018(22)
- [10]高糖高脂环境下Wnt7a对创面血管生成及炎症表达的影响[D]. 王薇. 南京大学, 2018(01)