一、Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene（论文文献综述）
郭艺[1]（2020）在《AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac25的功能研究》文中研究指明杆状病毒是一类有包膜的、大型双链DNA病毒,它的宿主主要是节肢动物（特别是昆虫）,而且在环境中普遍存在。研究最多的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）。杆状病毒被称为安全的生物杀虫剂,但因其杀虫谱窄,杀虫效率过低使它的应用极其受限。研究者通常利用基因工程的方法来增强杆状病毒的活性,提高其杀虫效率。AcMNPV orf 25编码一个含316个氨基酸残基的蛋白,该蛋白与BmNPV DNA结合蛋白DBP的同源性较高,推测Ac25是一种潜在的DNA结合蛋白,可能参与DNA复制的过程。有研究表明ac25是一个必需基因,缺乏ac25的病毒会产生有缺陷的核衣壳。Ac25不是病毒粒子结构蛋白,它是一种病毒发生基质的组分,敲除ac25基因的杆粒不会产生正常的病毒发生基质。为了明确和揭示Ac25在AcMNPV侵染宿主Sf9细胞过程中的作用机制,本研究开展了Ac25的功能分析。本研究主要分为三部分:第一部分:重组病毒vAcac25KO-EGFP、vAcac25KO-Ac25-EGFP、vAc-Ac25-EGFP的构建及Ac25-EGFP的表达分析我们首先利用λ-Red同源重组和Bac-to-Bac表达系统构建了ac25敲除型病毒vAcac25KO-EGFP,侵染Sf9细胞后发现几乎没有绿色荧光产生,表明敲除ac25以后可抑制子代病毒的增殖。为了验证这一现象是由于ac25的缺失所造成的,我们构建了ac25回补型病毒vAcac25KO-Ac25-EGFP,观察到一、二、三代病毒侵染细胞后所对应的绿色荧光逐渐增多,说明回补ac25后子代病毒的增殖能力得到了恢复,进而明确了ac25对子代病毒的产生是至关重要的。进一步,我们构建了过表达病毒vAc-Ac25-EGFP并测定各重组子代病毒的滴度,用5 MOI的vAcac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP分别侵染Sf9细胞,Western blot结果显示,在vAcac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP处理组中,Ac25-EGFP在24 h p.i.开始表达,且表达量从24-72 h p.i.均持续增加。vAc-Ac25-EGFP处理组中Ac25-EGFP的表达量在24、48、60和72h p.i.要显着高于vAcac25KO-Ac25-EGFP处理组。第二部分:Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能分析首先通过TCID50终点稀释法检测了vAcac25KO-EGFP、vAcac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP的子代病毒增殖情况。结果显示,敲除了ac25后基本上没有子代病毒的产生,回补型病毒vAcac25KO-Ac25-EGFP与vAc-EGFP的子代病毒产量基本一致,而过表达ac25后BV的产量要显着性地高于vAc-EGFP处理组,表明ac25对子代病毒的产生是必须的,而且过表达ac25能够促进子代病毒的增殖。接着,用5 MOI的vAc-Ac25-EGFP和vAc-EGFP分别侵染Sf9细胞24-96 h,通过绝对定量PCR检测了病毒基因组DNA的复制水平。结果显示,用vAc-Ac25-EGFP处理细胞后,细胞内病毒基因组的拷贝数从24-96 h p.i.逐渐增加。vAc-EGFP处理组中,病毒基因组的拷贝数也是呈上升趋势,但是总体水平略低于过表达病毒处理组,表明过表达Ac25能够促进病毒基因组的复制。通过qPCR检测了感染细胞中病毒晚期基因38k和vp39的转录水平,表明vAc-Ac25-EGFP处理组中38k和vp39的转录水平均显着高于vAc-EGFP对照组,说明过表达Ac25能够促进38k和vp39基因的转录。最后,通过MTT实验检测了vAc-Ac25-EGFP和vAc-EGFP对Sf9细胞增殖的影响,结果表明过表达Ac25能够抑制Sf9细胞的增殖。第三部分:Ac25的核定位信号序列的功能分析前两章我们明确了Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的重要性,证明了它对子代病毒的产生是必需的。Ac25主要定位在细胞核,本章我们预测到Ac25蛋白的19-23位氨基酸残基是一个典型的核定位信号序列,为了研究此序列对Ac25蛋白进核的作用,我们构建了突变型病毒vAcac25KO-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP以及过表达突变型病毒vAc-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP。首先通过TCID50实验检测了这两种突变型重组病毒的子代病毒增殖情况。相较于vAc-EGFP,vAcac25KO-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP抑制了子代病毒的增殖,vAc-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP所产生的子代病毒数量也显着低于过表达病毒vAc-Ac25-EGFP处理组。接着,用5MOI的vAcac25KO-Ac25-EGFP、vAcac25KO-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP、vAc-Ac25-EGFP和vAc-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP分别侵染Sf9细胞24-96 h。Western blot结果显示,vAcac25KO-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP处理组中Ac25-EGFP在细胞核内的积累丰度显着低于vAcac25KO-Ac25-EGFP处理组。同样,vAc-Ac25PKRER19-23AAAAA-EGFP处理组中Ac25-EGFP在细胞核内的积累量显着低于vAc-Ac25-EGFP处理组。因此,突变Ac25的核定位信号序列后,使得Ac25-EGFP在感染细胞的细胞核中聚集减少,进而导致子代病毒的产量降低,表明此核定位信号序列对于Ac25进入细胞核发挥着重要的作用。本研究揭示了Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能,它依赖其核定位信号在细胞核中高度积累,促进病毒DNA的复制以及晚期基因的表达,进而刺激子代病毒的产生。以上结果进一步完善了AcMNPV基因组功能的注释,为解析AcMNPV对宿主细胞的作用机制提供理论依据。
岳琦[2]（2019）在《宿主内吞途径相关因子在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒侵染中的作用》文中指出杆状病毒是一类大分子双链环状DNA囊膜病毒。在感染周期中,杆状病毒通常产生出芽型（budded virions,BV）和包埋型（occlusion-derived virions,ODV）两类形态各异的病毒粒子。ODV起始感染昆虫中肠上皮细胞,而BV能感染除中肠上皮细胞以外的其它组织细胞以及离体培养的细胞系。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple mucleopolyhedrovirus,AcMNPV）是目前较广泛深入研究的杆状病毒代表种,其出芽型病毒粒子BV通过网格蛋白介导的内吞途径（clathrin-mediated endocytosis,CME）进入宿主细胞。转录组数据分析表明,在AcMNPV BV侵染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）Tnms42细胞过程中显着上调了包括dynamin,rab5,rab11等内吞途径相关基因的表达水平,然而,关于这些宿主因子在BV入侵和出芽释放过程中的作用尚不清楚。在本文中,首先为了验证转录组数据,我们选用实时荧光定量PCR检测AcMNPV BV感染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9细胞后不同时间dynamin与4个rab基因（rab4,rab5,rab7,rab11）的转录水平变化,结果表明,在AcMNPV感染早期（0-6 h）,dyamin,rab5与ra11的表达水平显着上调。采用dynamin特异性抑制剂dynasore处理Sf9细胞或选用基于双链RNA的RNA干扰（RNA interference,RNAi）下调dynamin的表达水平均显着抑制感染性BV的产生;深入分析发现,抑制dynamin活性不影响BV与Sf9细胞结合,却显着降低BV的入侵效率。激光共聚焦分析显示,mCherry标记的BV在入侵过程中明显与GFP标签的Rab5及Rabll存在共定位现象,而过表达Rab5和Rab11的显性-负性突变体（dominant-negative mutants,DN）或RNAi下调rab5和rab11的表达水平,显着影响感染性BV的产生;进一步分析表明,过表达rab5与rab11的DN突变体不影响BV与Sf9细胞结合,但显着抑制BV入侵效率。采用同样类似方法的分析发现,过表达Rab4或Rab7的DN突变体或RNAi下调其编码基因的表达水平不影响感染性BV的产量。通过低pH诱导病毒囊膜与宿主细胞膜直接融合或通过重组bacmid转染Sf9细胞分析显示,在过表达Rab5与Rab11的细胞中,感染性BV产量与对照组（过表达GFP）比较没有显着差异,进一步揭示BV的入侵依赖于Rab5与Rab11,而感染性BV的出芽释放则与Rab5或Rab11无关。此外,RNAi下调Sf9细胞中内吞分选转运复合体Ⅲ（the endosomal sorting complex required for transportⅢ,ESCRT-Ⅲ）组分Vps2B,Vps20,Vps24,Snf7,Vps46及Vps60编码基因的转录水平显着抑制AcMNPV BV的入侵和出芽释放。综合上述实验结果,我们推测AcMNPV BV在早期内吞体（early endosome）或者在早期内吞体逐渐成熟的过程中发生了病毒囊膜与内吞体膜融合,在到达晚期内吞体（late endosome）之前就释放出了病毒核衣壳。另外,我们推测Rabll调控一部分入侵病毒粒子可能从早期内吞体直接进入循环内吞体（recycle endosome）并被转运至细胞膜释放,这种侵染策略可以快速传播病毒粒子到邻近细胞从而促进病毒感染效率。
王海萍[3]（2019）在《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究》文中提出杆状病毒（baculovirus）是一种昆虫特异性病毒,病毒粒子呈杆状,具有双链、环状、超螺旋DNA基因组。杆状病毒具有双相生活史,产生两种不同类型的病毒粒子,即出芽型病毒（budded virus,BV）和包涵体衍生型病毒（occlusion-derived virus,ODV）。BV主要负责宿主昆虫体内的全身系统性感染,而ODV则通过与宿主中肠上皮细胞的特异性结合,实现病毒的经口感染（原发感染）。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）属于杆状病毒家族q杆状病毒属,该病毒感染引起的血液型脓病对蚕丝业生产造成严重损害。目前,BmNPV的大多数基因在病毒生活史中的作用已被阐明,然而仍有部分基因的功能未知。本论文以BmNPV高度保守但功能未知的基因bm11作为研究对象,利用λ-red同源重组和Bac-to-Bac系统,对该基因的转录表达、亚细胞定位、生物学功能及作用机制进行了比较系统的研究。主要结论如下:1、对BmNPV bm11基因序列及编码蛋白进行了生物信息学分析。bm11位于BmNPV基因组10,459～10,791 nt,C末端保守性较高。蛋白质序列分析发现Bm11同源蛋白属于功能未知的DUF1477蛋白家族,且具有多个转录激活因子位点。反转录PCR等分析证实bm11是杆状病毒晚期基因。在病毒感染过程中,Bm11主要在细胞核内环状区域分布。病毒结构定位和液相分离实验表明Bm11既不是BV或ODV结构蛋白,也不是整合膜蛋白。2、通过λ-red重组系统构建bm11敲除型重组病毒,分析了 bm11基因缺失对BmNPV侵染的影响。实时定量PCR分析发现,敲除该基因并不影响病毒增殖及其基因组DNA复制。细胞及蚕体生物学实验表明,敲除bm11导致多角体产量显着降低。进一步的电镜观察显示,虽然bm11的缺失并不影响子代病毒粒子的形成、组装以及核内微泡的产生,但多角体内包埋的ODV病毒粒子数量显着减少,进而影响了病毒的有效经口感染。3、对该基因进行C端截短敲除、部分恢复和保守氨基酸位点突变,确定了 Bm11关键氨基酸序列及位点。结果表明,Bm11 C末端80-110 aa与多角体产量及ODV包埋密切相关。而进一步的点突变结果显示,Q94是介导上述过程的关键氨基酸。4、通过多种蛋白互作实验技术明确了与Bm11互作的病毒蛋白,并初步阐明了其入核机制。非病毒感染情况下,瞬时表达的Bm11主要分布在细胞质中;而病毒感染后,Bm11则弥散分布于整个细胞,暗示Bm11的入核需要其它病毒蛋白的辅助。通过与已知的12种病毒整合膜蛋白进行一对一酵母杂交,发现ODV囊膜蛋白PIF4和ODV-E66与Bm11存在相互作用,免疫共沉淀实验则进一步证实了PIF4与Bm11的互作关系。双分子荧光互补结果显示,PIF4与Bm11主要共定位于细胞质、核膜及核内环状区域。综上可知,Bm11通过与PIF4相互作用介导其自身入核。5、通过构建双荧光素酶报告系统,分析了Bm11转录因子的特性,并揭示了其影响多角体产量的分子机制。在BmNPV感染晚期,bm11基因的缺失导致病毒晚期与极晚期基因（包括多角体相关基因）的转录水平下调,但对ODV囊膜蛋白编码基因的转录无显着影响。利用双荧光素酶报告系统分析发现,Bm11对v-cath、fp和vlf-1启动子具有正调控作用。由此可知,敲除bm11导致fp及vlf-1启动子活性减弱,影响polh和p10等多角体相关基因的转录水平,最终使得多角体产量降低。
胡原[4]（2014）在《小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析》文中提出小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus, PlxyGV）属杆状病毒科β-杆状病毒属,是小菜蛾种群的重要天然控制因子。虽然PlxyGV已开发为商品化生物杀虫剂,但由于缺少支持PlxyGV离体复制的稳定受纳细胞系,PlxyGV分子生物学有关的研究工作相对滞后。本研究利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）构建了多个PlxyGV bacmids,试图建立PlxyGV基因操作和功能分析研究技术平台；在此基础上进一步开展了PlxyGV离体复制和基因表达分析。（1）通过直接克隆和λ-Red重组,在PlxyGV gran位点导入含F复制子、卡那霉素抗性基因（Kan）、lacZa基因和Tn7转座结合位点的细菌人工染色体载体片段构成PlxyGV bacmid vPxG。借助Bac-to-Bac系统,分别构建了由PlxyGV iel、vp39、gran或AcMNPV iel启动子控制egfp的PlxyGV荧光报告bacmid,依次为vPxGPiel-gfp、vPxGPvp39-gfp、vPxGPgran-gfp和vPxGPaciel-gfp。在vPxGPaciel-gfp转染的PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿以及vPxGPiel-gfp转染的Hi5培养皿中可见荧光细胞。vPxGPgran-gfp和vPxGPvp39-gfp分别转染的细胞培养皿中都未见荧光细胞。用四种PlxyGV荧光报告bacmids分别转染三种细胞系的上清液转接的新鲜细胞培养中均未见荧光细胞,表明在被转染细胞中未产生感染性病毒粒子。（2）通过基因克隆,构成含PlxyGV启动子控制egfp或luc的报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV早期基因iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105启动子,晚期基因vp39启动子以及极晚期基因gran启动子在三种细胞中表达活性分析。荧光观察结果显示,在pPiel-gfp或pPdnapol-gfp转染Hi5细胞培养皿以及报告质粒和bMON14272共转染PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿中可见荧光细胞。定量结果显示,iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105等PlxyGV早期基因启动子在Hi5细胞中均有高水平的转录。结果表明,这些PlxyGV早期基因启动子在三种昆虫细胞系中能够不依赖其它病毒基因产物启动报告基因表达。（3）构成含PlxyGV hr的早期启动子报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV hr序列的增强功能分析。结果显示,在PxE2细胞中,hrl、hr2、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子（Piel、Pdnapol、Plefl和Plef9）具有增强作用。在Sf9细胞中,对早期启动子具有增强作用的是hrl、hr4和AcMNPV hr5。在Hi5细胞中,hrl、hr3、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子具有增强作用,hr2对部分早期启动子（Piel、Pdnapol和Plefl）具有增强作用。结果表明,PlxyGV hr对早期基因表达具有增强作用。（4）通过瞬时表达实验,分析PlxyGV和AcMNPV iel蛋白对PlxyGV早期基因表达的调控作用。结果显示,PlxyGV iel抑制早期启动子控制报告基因表达；当PlxyGV hrl存在时这种抑制作用没有改变。AcMNPV iel对大多数PlxyGV早期启动子具有激活作用,而且当PlxyGVhr1存在时激活作用得到进一步加强。（5）利用AcMNPV bacmid系统分别完成了PlxyGV iap和f基因对AcMNPV p35和gp64基因的功能替代分析,发现PlxyGV iap不能功能性替代AcMNPV p35基因；证实PlxyGV f不能替代AcMNPV gp64。（6）构建了多个包含AcMNPV p35, iel和gp64基因单个或成对或全数的PlxyGV bacmids重组体。通过用所构建的PlxyGV bacmids重组体对三种昆虫细胞系的转染-感染实验发现AcMNPV p35无论是单独或其它两种基因一起插入PlxyGV基因组都能激活PlxyGV晚期基因vp39启动子控制的报告基因表达；AcMNPV iel增强p35的激活作用。AcMNPV p35、iel和gp64组合可以进一步增强报告基因表达；含AcMNPV p35、iel和gp64的PlxyGV bacmid转染Sf9和Hi5细胞可能产生了少量感染性病毒。
彭伟,陈爱春,汪生鹏[5]（2012）在《重组AcMNPV感染家蚕后造成宿主组织液化的机制分析》文中认为杆状病毒的组织蛋白酶（V-CATH）和几丁质酶（V-CHIA）是病毒感染宿主后造成宿主组织液化的关键酶。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染家蚕后会导致宿主组织的液化,而苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）感染家蚕后不会造成宿主组织的液化。为了分析AcMNPV不造成家蚕宿主组织液化的原因,利用Bac-to-Bac系统将BmNPV的v-cath（Bmcath）、v-chiA（BmchiA）同时或分别重组到AcMNPV的极晚期强启动子p10和polh下游,并以同样的方法将AcMNPV的v-cath（Accath）、v-chiA（AcchiA）同时或分别重组到AcMNPV的p10和polh下游,从而构建6种重组AcMNPV。结果显示6种重组AcMNPV均能感染家蚕,并造成家蚕宿主组织的液化,说明重组AcMNPV中v-cath和v-chiA的过量表达在病毒对家蚕组织液化过程中发挥了重要作用。通过对感染6种重组AcMNPV之间的蚕体液化发生时间和液化率进行比较,发现相对于v-chiA,v-cath对组织液化的作用可能更加直接。检测比较感染AcMNPV和重组AcMNPV家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性,两种酶的活性均随v-cath和v-chiA基因拷贝数的增加而增加。AcMNPV感染后不会造成家蚕宿主组织液化可能是由于病毒的组织蛋白酶活性太低,而不是由Bmcath和Accath、BmchiA和AcchiA之间的序列差异造成的。
彭伟[6]（2012）在《昆虫杆状病毒液化家蚕宿主组织的机制研究》文中研究指明杆状病毒感染昆虫后会造成虫体的液化现象，这有利于病毒向周围环境扩散。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）对家蚕的感染也证实了这一观点，而苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染家蚕后不会造成宿主组织的液化。虫体液化主要是由杆状病毒编码的组织蛋白酶（V-CATH）和几丁质酶（V-CHIA）活性造成的。为了调查AcMNPV不液化家蚕宿主组织的原因，首先利用大肠杆菌表达系统大量表达AcMNPV-CATH和BmNPV-CATH、AcMNPV-CHIA和BmNPV-CHIA，并利用Ni-NTA柱亲和层析技术对两组酶蛋白进行纯化。结果显示，两组酶蛋白均能在大肠杆菌BL21（DE3）plysS菌株中正确表达，但表达产物主要是以包涵体形式存在，而且与Ni-NTA柱结合较差；改用Ni-NTA柱变性亲和纯化和复性处理后，得到较高纯度的可溶性V-CATH，但仍未能得到V-CHIA。分别比较两组酶蛋白的活性，发现BmNPV-CATH活性纯化前较AcMNPV-CATH低27%，纯化后较AcMNPV-CATH低2%；BmNPV-CHIA活性与AcMNPV-CHIA没有明显差异。上述结果说明，家蚕感染AcMNPV后不出现液化现象可能不是AcMNPV v-cath和v-chiA基因序列与BmNPV v-cath和v-chiA基因序列差异所造成的。其次，利用Bac-to-Bac系统将BmNPV的v-cath（Bmcath）、v-chiA（BmchiA）同时或分别重组到AcMNPV的极晚期强启动子Pp10和Ppolh下游，并以同样的方法将AcMNPV自身v-cath（Accath）、v-chiA（AcchiA）同时或分别重组到AcMNPV上，从而构建6种重组AcMNPV。结果显示6种重组AcMNPV均能感染家蚕，并造成家蚕宿主组织的液化，说明重组AcMNPV中v-cath和v-chiA的过量表达在病毒对家蚕组织液化过程中发挥了重要作用。对感染6种重组AcMNPV之间的蚕体液化发生时间和液化率进行比较，结果显示相对于v-chiA，v-cath对组织液化的作用可能更加直接。对AcMNPV和重组AcMNPV感染家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性测定，结果表明组织蛋白酶和几丁质酶活性分别随v-cath和v-chiA基因拷贝数的增加而增加。AcMNPV感染后不能液化家蚕宿主组织可能是由于病毒的组织蛋白酶活性太低，不足以液化宿主组织。进一步调查了重组AcMNPV和BmNPV感染培养细胞和家蚕成体后对EGFP蛋白的降解情况。Western blot检测结果显示，重组BmNPV感染家蚕成体会造成EGFP蛋白的降解，而且该现象不因感染家蚕品种的改变而改变，可能是一种普遍现象。然而在重组BmNPV感染的BmN细胞以及重组AcMNPV感染的Sf21细胞和家蚕成体中，均未检测到EGFP蛋白的降解。利用EGFP-His融合蛋白的体外降解实验对EGFP蛋白的降解程度进行分析，结果显示EGFP蛋白的降解发生在距C末端约2kDa的位置。对感染重组AcMNPV和重组BmNPV的家蚕血淋巴中的V-CATH活性进行测定，发现V-CATH活性是造成EGFP蛋白降解的主要原因。V-CATH活性和体外降解实验均表明，重组BmNPV感染的家蚕血淋巴中的V-CATH在感染后期具有很高的活性，它造成EGFP蛋白降解；重组AcMNPV感染的家蚕血淋巴中的V-CATH可能是以无活性形式积累的或活性很低，即使在感染后期也不会造成EGFP蛋白的降解的原因。AcMNPV感染家蚕后具有不液化家蚕宿主组织和不降解所表达外源蛋白的特点，AcMNPV-家蚕表达系统用作一种进行家蚕成体水平基因功能验证的载体工具已得到广泛应用，而本研究从解析杆状病毒和宿主液化以及外源蛋白降解方面为AcMNPV系统的可行性提供了证据。
唐平[7]（2011）在《一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析》文中研究指明杆状病毒具有闭合环状双链DNA基因组，是一类主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫的病原物，杆状病毒作为生物杀虫剂具有对人畜安全，不造成环境污染，宿主专一性强，能有效控制田间害虫种群密度等优点。本文对一株分离自棉铃虫的核型多角体病毒进行电镜观察，表明其为多粒包埋型的核型多角体病毒，昆虫感染实验表明其与棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearSNPV）有不同的宿主域，细胞感染实验表明其与HearSNPV有不同的病理效应，因此对其基因组进行了分析，并与其它杆状病毒基因组进行了比较。对一株分离自棉铃虫的病毒纯化后进行电镜观察，发现其呈不规则多角体型，包涵体中有多个包含病毒核衣壳的囊膜，每个病毒囊膜内含有2个以上核衣壳，符合多粒包埋型核型多角体病毒特征，将其命名为棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HearMNPV）。荧光定量PCR结果分析表明HearMNPV的DNA在棉铃虫体内复制经历了减少期、隐晦期、增长期及稳定期４个时相，表明其宿主体内复制良好。HearMNPV对其它昆虫的感染性实验表明它对东方粘虫有较好的感染性，但不能感染斜纹夜蛾及甜菜夜蛾，而HearSNPV不能感染东方粘虫，表明两者有着不同的宿主域。HearMNPV对Hz-AM1细胞系感染后没有多角体产生，也不显示明显的细胞病理效应；对棉铃虫胚胎细胞系QB-Ha-E-5细胞系感染后有大量多角体产生，呈现较好的感染性。Hz-AM1是HearSNPV的敏感细胞系,用源自HearSNPV的HaBacmid-egfp对QB-Ha-E-5细胞系感染，细胞感染后有明显的荧光产生，表明HearMNPV和HearSNPV对宿主细胞感染性存在不同。为进一步分析HearMNPV，将Sau3AⅠ部分酶切HearMNPV基因组DNA，SalⅠ完全酶切pUC19载体，以Klenow酶分别对回收的片断和载体进行半补齐反应，经连接、转化后,得到用半补齐法构建的覆盖率大于99.9％的HearMNPV基因组文库。对HearMNPV基因组全序列进行测定并分析表明基因组的大小为154,196bp，G+C含量为40.07%，推测含有162个与相邻的ORF有最小重叠且大于150bp的ORF，占基因组全序列的90.16%，4个同源重复区等非编码区序列占整个基因组的9.84%。基因对等图表明HearMNPV与HearSNPV共线性较低，HearMNPV基因组结构与披肩粘虫核型多角体病毒B株（Mamestraconfigurata nucleopolyhedrovirus-B，MacoNPV-B）有很好的共线性；系统进化分析表明HearMNPV与HearSNPV不在同一簇中，而与MacoNPV-B存在同一簇中。HearMNPV与HearSNPV在基因组的大小、内容，同源基因的排列、一致性上存在着显着的差别，结合昆虫宿主域实验确定HearMNPV是一株不同于棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（HearSNPV）的新病毒种。与MacoNPV-B基因组结构相比，HearMNPV缺失了包含ORF54、55、56、57、58的片断，长度约为5.4kb，其基因组中HearMNPV orf66、orf17、bro基因、hr序列与MacoNPV-B存在明显的不同，表明其与MacoNPV-B的亲缘关系然很近，但在基因组的结构上存在明显的差异。
曹建斌,范晓军,付月君,梁爱华[8]（2009）在《重组杆状病毒Ac MNPV-BmKIT-vcath的构建及毒力分析》文中指出利用Bac-to-Bac载体系统,构建了含有东亚钳蝎Buthus martensii Karsch昆虫特异性神经毒素基因（BmKIT）和杆状病毒组织蛋白酶基因（vcath）的重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath,使这两个基因分别位于p10基因启动子（Pp10）和多角体基因启动子（Pph）的控制下高效表达.抗棉铃虫毒力分析表明,该重组病毒的LC50值为28 829.5 pfu/mL,比野生型病毒的LC50值（33114.5 pfu/mL）降低13%;重组病毒的LT50值为3.5 d,而野生型的LT50值为4.1 d,提高了14.6%,表明该重组病毒的活性比野生型病毒有明显的提高.
李轶女[9]（2008）在《东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析》文中提出杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群,呈杆状,仅感染无脊椎动物,具有大的双链,共价闭合,环状的DNA基因组。杆状病毒基因组的测序和分析对于我们理解基因功能和它们的进化是非常重要的,正是由于已经有大量的杆状病毒基因组已经被测序,方便了我们对病毒基因组的进一步的了解而进行详细的比较分析。本研究主要对两种杆状病毒:东方粘虫颗粒体病毒（PsGV）和斜纹夜蛾核型多角体病毒II（SpltNPV II）基因组进行序列测定和分析。1. PsGV和SpltNPV II的形态学特性根据包涵体形态的不同,将杆状病毒分为NPVs和GVs两类,NPVs的包涵体呈多角体形,内有多个病毒粒子,而GVs的包涵体呈颗粒体形,内只有一个病毒粒子。通过扫描电镜可以观察到纯化的PsGV的包涵体形状规则,大小比较均一,长度约为0.5μM,直径为0.3μM。通过透射电镜可以观察到每个包涵体内部有一个杆状病毒粒子,长约310nm,宽约40nm,每个病毒粒子内只有一个核衣壳。通过扫描电镜可以观察到纯化的SpltNPV II的包涵体形状不太规则,大小也不均一,直径约1.3μM。在透射电镜下可以观察到每个包涵体内部有多个杆状病毒粒子,长约260nm,宽约50nm,每个病毒粒子内含有多个核衣壳。2. PsGV的基因组全序列分析测定了东方粘虫颗粒体病毒病毒（PsGV）基因组全序列,PsGV基因组大小为176,677bp,是目前已经测序的杆状病毒基因组中仅次于XecnGV的第二大基因组。其G+C含量为39.79%,编码183个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。与已经测序的AcMNPV、XecnGV和HearGV基因组进行了比较,发现PsGV与XecnGV和HearGV基因组具有很高的序列相似性和共线性,而且这三个基因组均有9个hrs,它们的结构以及在基因组中的位置都非常保守。在183个预测的ORFs中有69个与AcMNPV具有同源性,占整个基因组的37.7%;有166和169个ORFs分别与XecnGV和HearGV具有同源性,分别占整个基因组的90.7%和92.3%。PsGV与XecnGV和HearGV的同源基因的氨基酸相似性为79%,远远高于与AcMNPV同源基因的相似性（34%）。除了PsGV基因组特有的7个ORFs以外,还确定了12个bro基因、2个helicase基因和3个enhancin基因。在PsGV基因组中有两个完全一致的反向互补的重复基因（ORF39和49）,并通过PCR扩增进行了验证。通过质谱分析,在PsGV（OB）中鉴定了12个颗粒体组成蛋白,包括6个ODVs特异性蛋白组分和1个ODVs和BVs共有的蛋白组分。其中ORF174由于它的功能至今未见报道,从本研究结果可以判定其属于一种新的颗粒体组成蛋白。3. SpltNPV II的基因组全序列分析测定和分析了斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltNPV II）基因组全序列,表明这是一个新的杆状病毒。该基因组大小为148,634bp,G+C含量为45%,编码149个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。其中141个ORFs（94.6%）与其它的杆状病毒具有一定的同源性,包括97个与AcMNPV同源,96个与SpltNPV I同源,133个与SeMNPV同源,这些同源基因的氨基酸相似性分别为41.4%、44.6%和76.5%。在SpltNPV II基因组中有8个特有的ORFs和7个hrs。除了2个bro基因以外,在SpltNPV II基因组中还有2个重复的ORFs:p26和odv-e56,系统进化分析结果表明这两个基因的每个重复的来源都不同。SpltNPV II和SpltNPV I是从相同的宿主分离到的两种杆状病毒,对它们的基因组进行了比较,包括基因组大小、ORFs数目、G+C含量、基因内容、基因顺序和氨基酸序列相似性,发现它们之间存在非常显着的差异。结合之前的杀虫效果和限制性酶切图谱分析结果（与苏州大学朱江教授交流）,认为SpltNPV II是一种不同于SpltNPV I的新病毒。4. PsGV和SpltNPV II的系统进化分析迄今为止,已知有45种杆状病毒的基因组全序列进行了测定,它们共有29个保守的基因,被认为是杆状病毒的核心基因,这些基因通常编码最基本的功能。本研究建立了基于这29个核心基因的氨基酸序列按照一定的顺序连接后的系统进化树,这个进化树支持了将杆状病毒分为鳞翅目NPVs、鳞翅目Gvs、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统,其中鳞翅目NPVs又分为Group I和Group II。根据这个系统进化树, PsGV属于鳞翅目GVs,PsGV与HearGV和XecnGV的进化关系最近,这与本文第四章中比较的结果是一致的。从这个系统进化树还可以看出:SpltNPV II属于鳞翅目Group II NPVs,与SeMNPV关系最近。虽然SpltNPV II与SpltNPV I共同属于鳞翅目Group II NPVs,但是关系却比较远,再次验证了SpltNPV II是一个不同于SpltNPV I的新病毒。
杜恩岐[10]（2006）在《Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究》文中研究表明p13基因由我们实验室于1995年首次报道。随着大规模基因组测序的发展,越来越多的杆状病毒全基因组被测定,目前已报道的杆状病毒p13基因多达二十多个。奇怪地是这些p13基因均特异地存在于II型核型多角体病毒和部分颗粒体病毒的基因组中。而I型核型多角体病毒基因组中则不存在。对于p13基因的启动子和编码区的结构功能目前已有预测,但尚无相关研究工作报道。本研究对p13基因的启动子活性、p13基因的进化、在天然系统及异源系统中的功能及其潜在的杀虫活性进行了研究,为p13基因进一步深入研究和杀虫潜力应用的开创之举。目前已有14类不同杆状病毒的22个p13基因序列报道,我们经DNASTAR软件对已报道的14类杆状病毒（每类各选一个序列）P13氨基酸同源性比较发现,不同杆状病毒P13之间的同源性在42.1%-74.7%,其中Ls-P13与HaNPV P13同源性最高（58.7%）与PoGV P13最低（44%）。对P13的氨基酸同源性比较和进化树分析表明P13可被分为两个群,I群为GV的P13,它们之间有高度同源性。II群为II型NPV的P13,它们之间同源性差异较大。其中II群根据同源性又可分为两个亚群:I亚群为LsNPV,HaNPV和SlNPV三种,其他II型NPVs的P13为第II亚群。p13基因5’UTR普遍存在早期启动子核心序列GTGTTATA及CAT/AT盒和晚期启动子核心序列TTAAG盒。在早晚期启动子之间有一3-30aa组成的小ORF,推测这一小顺反子可能具有重要的调控功能。在p13基因5’UTR的上游,有一个杆状病毒普遍存在的同源重复序列（Homologue repeat,简称hr）,一般hr有多个,而p13基因的hr的数目因病毒种类的不同而不同。已经证明,杆状病毒的hr是DNA复制的ori和转录激活的增强子,对早期基因的表达有增强作用。因此由p13基因的5’UTR结构,我们推测p13基因为一早晚期基因,并主要在早期发挥作用。以Ha-p13为例,我们证明p13基因启动子从2h.p.i到90h.p.i均有活性。不管在天然Hz-AM1细胞还是在异源Sf9细胞中,Ha-p13基因启动子本身并不是一个强启动子,但在hr4存在时,Ha-p13基因启动子活性在Hz-AM1细胞中提高了20倍,在Sf9细胞中则提高了2000倍。携带hr4增强子的Ha-p13基因启动子活性在天然细胞和异源细胞中存在的巨大差异可能受细胞的某些因子调控。为研究P13蛋白功能,我们以Ha-P13和Ls-P13为例,分别对P13蛋白在天然和非天然宿主昆虫细胞和幼虫中的作用进行了研究。由于携带eGFP的棉铃虫杆状病毒HaSNPV-G本身带有Ha-p13基因,因此我们通过dsRNA-Hap13来沉默Ha-P13的表达。流式细胞仪检测结果发现5μg dsRNA-Hap13可以有效地抑制Ha-P13在Sf9和Hz-AM1细胞中的表达。HaSNPV-G与5μg dsRNA-Hap13共感染发现棉铃虫的死亡率明显下降,而且与dsRNA-Hap13的使用剂量成正相关性。这表明p13在天然系统中是一个杀虫相关基因。另一方面,由于I型核型多角体病毒如AcMNPV中缺少p13基因,因此我们将Ls-p13基因插入AcMNPV基因组构建重组病毒rAc-hr5/IE1-Lsp13-G来检验异源系统中P13的杀虫活性。生物测定实验进一步证明,Ls-P13能够明显提早AcMNPV的杀虫时间。通过杆状病毒Ls-P13或Ha-P13与不携带Ls-p13的AcMNPV共同注射感染幼虫发现,一旦Ls-P13的亮氨酸拉链结构发生突变,Ls-P13的杀虫活性也会随之失去,尽管我们对这种确切机理还没有完全解释清楚,但是P13提早杀虫时间的特性很可能使其成为未来新型生物杀虫剂的侯选基因。为进一步研究P13在异源系统中提早杀虫的机理,我们构建了一系列重组病毒来研究P13对病毒在细胞中增殖的影响。我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显抑制多角体的产生,其抑制效率随P13表达时相的提前而加强,即P13的早期表达有更强的抑制作用。当P13的亮氨酸拉链发生突变时,P13对多角体的抑制效率随之丧失。而P13的跨膜区发生缺失时,对多角体的效应与Leu Zipper相反,即抑制效果明显提高。另一方面,P13对出芽病毒（BV）的效应与对多角体的效应不同,我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显增加出芽病毒（BV）的产生,当亮氨酸拉链突变时,P13对BV的增殖效率随之丧失;当P13的跨膜区发生缺失时,P13对BV的增殖略有下降。以上结果充分证明P13提前杀虫效果的机制是由于P13改变了BV和多角体之间的动态平衡,主要是由于P13的LZLD（Leucine zipper like domain）减少了多角体产量,增加了BV产量。跨膜区使P13晚期定位在质膜上,与LZLD效果相反的是,当TM缺失后P13的定位向核中转移,对多角体的抑制进一步加强,而对BV增加略有下降。BV的参加则加速了AcMNPV从细胞到细胞的次级感染,所以使注射感染时间大大提早。此外,我们对Ha-P13在天然Hz-AM1细胞和Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位进行了研究。得出了一致的结果,我们发现P13不管在天然细胞还是异源细胞中,转染48h后主要定位在细胞质膜上。Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位为一动态过程,即早期（12h）定位于细胞核中,随后（24h）从细胞核向细胞质膜移动,最后定位于细胞质膜上。当Ls-P13的I、II跨膜区依次缺失时,Ls-P13的晚期定位逐渐从细胞质膜向细胞核移动。尤其在跨膜区II发生缺失时,绝大部分P13蛋白已脱离了细胞质膜而进入核中。由于多角体在核中装配而BV主要在细胞质膜上装配,而且Ls-P13具有抑制多角体产生和促进BV生成的作用。因此当跨膜区缺失时,Ls-P13的定位从细胞质膜而向核移动,核中的Ls-P13的增加和细胞质膜上Ls-P13的降低很好地解释了为什么在跨膜区缺失后L s-P13对多角体的产生的抑制效果进一步加强而对BV的增强效果稍有下降。另一方面,由于L s-P13早期主要在核中表达,随后从核中向细胞质膜上移动,这也很好地解释了为什么L s-P13对多角体的抑制效果随表达时相的推迟而减弱。
二、Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene（论文提纲范文）
（1）AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac25的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.2 杆状病毒的分类 |
| 1.1.3 杆状病毒生活史 |
| 1.1.4 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.1.5 杆状病毒基因的表达 |
| 1.1.6 杆状病毒基因的分类 |
| 1.1.7 杆状病毒杀虫剂的应用 |
| 1.2 杆状病毒DNA复制和基因组加工 |
| 1.2.1 DNA合成所需基因 |
| 1.2.2 影响DNA复制的其他基因 |
| 1.2.3 杆状病毒DNA复制的位置:病毒发生基质的形成 |
| 1.2.4 基因组DNA的加工和包装 |
| 1.3 单链DNA结合蛋白DBP |
| 1.3.1 DBP的发现 |
| 1.3.2 DBP的特征与功能 |
| 1.4 核定位信号序列 |
| 1.5 论文设计思路 |
| 1.5.1 研究内容与意义 |
| 1.5.2 实验流程 |
| 1.5.3 研究方法 |
| 第二章 重组杆状病毒vAc~(ac25KO)-EGFP、vAc~(ac25KO)-Ac25-EGFP、vAc-Ac25-EGFP的构建及Ac25-EGFP的表达分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 菌株、载体、细胞及病毒 |
| 2.2.3 主要试剂及其配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 敲除型病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-EGFP和回补型病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-Ac25-EGFP的构建 |
| 2.3.2 过表达病毒杆粒Bacmid-Ac25-EGFP的构建 |
| 2.3.3 重组杆粒转染Sf9 细胞 |
| 2.3.4 Sf9 细胞的培养、复苏及冻存 |
| 2.3.5 噬斑实验测定病毒滴度 |
| 2.3.6 Western blot及荧光显微镜观察分析Ac25-EGFP的表达量 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 敲除型病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-EGFP和回补型病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-Ac25-EGFP的构建 |
| 2.4.2 过表达病毒杆粒Bacmid-Ac25-EGFP的构建 |
| 2.4.3 重组病毒vAc~(ac25KO)-EGFP、vAc~(ac25KO)-Ac25-EGFP和 vAc-Ac25-EGFP的获得 |
| 2.4.4 荧光显微镜和Western blot检测Ac25-EGFP在 Sf9 细胞中的表达水平 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Ac25在Ac MNPV侵染宿主细胞过程中的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂及其配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Sf9 细胞的培养 |
| 3.3.2 重组病毒的子代病毒增殖分析 |
| 3.3.3 病毒基因组的提取 |
| 3.3.4 绝对定量PCR检测重组病毒的基因组DNA复制水平 |
| 3.3.5 Real-time PCR检测重组杆状病毒对病毒晚期基因38k、vp39 转录水平的影响 |
| 3.3.6 MTT实验检测重组病毒对Sf9 细胞增殖的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组病毒的子代病毒增殖分析 |
| 3.4.2 Ac25 对病毒基因组DNA复制的影响 |
| 3.4.3 Ac25 对病毒晚期基因 38k、vp39 转录水平的影响 |
| 3.4.4 Ac25 对Sf9 细胞增殖的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Ac25 的核定位信号序列的功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要试剂及其配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Ac25 核定位信号序列的预测 |
| 4.3.2 重组病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP的构建 |
| 4.3.3 重组病毒杆粒Bacmid-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP的构建 |
| 4.3.4 Sf9 细胞的培养 |
| 4.3.5 重组杆粒转染Sf9 细胞 |
| 4.3.6 噬斑实验测定病毒滴度 |
| 4.3.7 重组病毒的子代病毒增殖分析 |
| 4.3.8 细胞核蛋白的提取 |
| 4.3.9 Western blot检测Ac25-EGFP在细胞核内的积累情况 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组病毒杆粒Bacmid~(ac25KO)-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP的构建 |
| 4.4.2 重组病毒杆粒Bacmid-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP的构建 |
| 4.4.3 vAc~(ac25KO)-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP和v Ac-Ac25~(PKRER19-23AAAAA)-EGFP的获得 |
| 4.4.4 重组病毒的子代病毒增殖分析 |
| 4.4.5 重组病毒侵染细胞后Ac25-EGFP在核内的积累量 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（2）宿主内吞途径相关因子在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒侵染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.1 杆状病毒感染周期 |
| 1.1.2 BV与ODV的区别 |
| 1.1.3 AcMNPV出芽型病毒BV的侵染过程 |
| 1.1.4 几个与AcMNPV出芽型病毒粒子入侵有关的病毒基因 |
| 1.1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.2 网格蛋白介导的内吞途径 |
| 1.2.1 网格蛋白介导的内吞系统与分子机制 |
| 1.2.2 Dynamin蛋白 |
| 1.3 Rab GTPase概述 |
| 1.3.1 Rab蛋白的亚细胞定位 |
| 1.3.2 Rab蛋白的结构和GTPase活性 |
| 1.3.3 Rab蛋白在细胞内吞、跨细胞转运以及胞吐中的作用 |
| 1.3.4 Rab蛋白与病毒侵染的关系 |
| 1.4 ESCRT-Ⅲ复合体概述 |
| 1.4.1 ESCRT系统 |
| 1.4.2 ESCRT-Ⅲ |
| 1.4.3 ESCRT系统与病毒侵染的关系 |
| 1.5 选题的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞转染与病毒感染 |
| 2.2.2 细胞总RNA提取 |
| 2.2.3 dynamin和rab基因的转录本分析 |
| 2.2.4 质粒和bacmid的构建 |
| 2.2.5 细胞毒力测定 |
| 2.2.6 Dynamin抑制实验 |
| 2.2.7 激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.2.8 病毒互补拯救实验 |
| 2.2.9 RNA干扰 |
| 2.2.10 标记基因表达和病毒基因组DNA复制分析 |
| 2.2.11 病毒入侵分析 |
| 2.2.12 cELISA(酶联免疫吸附实验)和嵌合体形成分析 |
| 2.2.13 直接膜融合(direct fusion)分析 |
| 2.2.14 病毒出芽释放分析 |
| 2.2.15 Western blot分析 |
| 第三章 Dynamin和Rab在AcMNPV侵染中的作用 |
| 3.1 AcMNPV侵染过程中宿主细胞dynamin和rab的转录水平分析 |
| 3.2 Dynamin在AcMNPV侵染过程中的作用 |
| 3.2.1 抑制dynamin对AcMNPV感染性病毒粒子产量的影响 |
| 3.2.2 Dynamin对BV入侵Sf9细胞起重要作用 |
| 3.3 草地贪夜蛾rab4,rab5,rab7,rab11基因克隆 |
| 3.3.1 Rab蛋白的氨基酸序列比对分析 |
| 3.4 Rab蛋白在AcMNPV侵染中的作用 |
| 3.4.1 GFP标签的Rab4,Rab5, Rab7和Rab11的表达 |
| 3.4.2 入侵的病毒粒子与Rab蛋白的共定位分析 |
| 3.4.3 Rab显性-负性突变体的表达 |
| 3.4.4 Rab5与Rab11参与感染性病毒粒子的产生 |
| 3.4.5 Rab5与Rab11对AcMNPV入侵宿主细胞起重要作用 |
| 3.4.6 Rab11对细胞表面GP64定位的影响 |
| 3.4.7 过表达DN Rab5或Rab11对AcMNPV出芽释放没有影响 |
| 第四章 ESCRT-Ⅲ复合体对AcMNPV侵染的影响 |
| 4.1 ESCRT-Ⅲ在内吞体成熟过程中的作用 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 RNA干扰 |
| 4.2.3 Western blot检测RNAi下调效率 |
| 4.2.4 RNAi下调ESCRT-Ⅲ组分对病毒DNA复制和基因表达影响分析 |
| 4.2.5 下调ESCRT-Ⅲ各组分表达对BV入侵的影响 |
| 4.2.6 下调ESCRT-Ⅲ各组分表达对感染性BV出芽释放的影响 |
| 4.3 ESCRT-Ⅲ在ACMNPV侵染中的作用 |
| 4.3.1 RNAi下调ESCRT-Ⅲ表达对AcMNPV感染性病毒产量的影响 |
| 4.3.2 RNAi下调ESCRT-Ⅲ各基因表达对BV入侵的影响 |
| 4.3.3 RNAi下调ESCRT-Ⅲ各基因表达对BV出芽释放的影响 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 柠檬酸钠缓冲液有效移除细胞表面病毒 |
| 附录B 草地贪夜蛾rab4,rab5,rab7和rab11基因序列 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 杆状病毒复制周期 |
| 1.1.3 杆状病毒包涵体衍生型病毒粒子研究简介 |
| 1.1.4 ODV病毒粒子形成所需的相关基因 |
| 1.1.5 杆状病毒编码整合膜蛋白及内核膜分选基序 |
| 1.1.6 真核生物转录因子及其研究方法 |
| 1.2 本研究的目的与科学意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 BmNPV bm11基因的生物信息学分析、表达规律与定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 bm11在基因组中的位置 |
| 2.3.2 Bm11的蛋白质序列特征 |
| 2.3.3 Bm11氨基酸序列比对和进化树分析 |
| 2.3.4 Bm11转录时相分析 |
| 2.3.5 Bm11在病毒感染晚期表达 |
| 2.3.6 Bm11的亚细胞定位 |
| 2.3.7 Bm11在液油两相中的分布 |
| 2.3.8 Bm11在病毒粒子结构组分中的定位 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 BmNPV bm11基因的功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组病毒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 病毒复制分析 |
| 3.3.3 bm11基因敲除对病毒DNA复制的影响 |
| 3.3.4 bm11敲除对病毒多角体粒子产量的影响 |
| 3.3.5 bm11敲除对虫体感染的影响 |
| 3.3.6 对虫体内病毒感染力及多角体产量的影响 |
| 3.3.7 透射电子显微镜观察 |
| 3.3.8 bm11敲除对病毒ODV粒子包埋的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Bm11蛋白关键氨基酸位点的确定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分段截短型和恢复型重组病毒的构建 |
| 4.3.2 Bm11不同的片段截短与恢复对OB产量的影响 |
| 4.3.3 Bm11不同的片段截短与恢复对ODV包埋的影响 |
| 4.3.4 生物学分析 |
| 4.3.5 Bm11突变氨基酸位点确定及突变型重组病毒构建 |
| 4.3.6 单个氨基酸位点突变对ODV包埋的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 BmNPV Bm11蛋白入核机制的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm11的细胞内定位 |
| 5.3.2 酵母双杂交载体的构建和自激活检测 |
| 5.3.3 Bm11截短体与整合膜蛋白互作的酵母双杂交验证 |
| 5.3.4 免疫共沉淀验证蛋白质互作 |
| 5.3.5 Bm11与PIF4在核膜上相互作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 BmNPV bm11基因的转录调控分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 bm11敲除对病毒基因转录的影响 |
| 6.3.2 荧光素酶表达载体构建与鉴定 |
| 6.3.3 不同基因启动子的活性检测 |
| 6.3.4 最佳转染剂量的确定 |
| 6.3.5 最佳酶活测定时间的确定 |
| 6.3.6 bm11对不同基因启动子活性的调节 |
| 6.3.7 蚕体液化现象分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论、创新点和工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 发表论文 |
| 博士期间获得荣誉 |
| 致谢 |
（4）小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 本文缩写符号 |
| 目录 |
| 1. 绪论 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 两相复制周期 |
| 1.1.2 基因表达调控 |
| 1.1.3 同源重复区和IE1 |
| 1.1.4 抗细胞凋亡基因 |
| 1.1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.2.1 β-杆状病毒 |
| 1.2.2 β-杆状病毒的离体复制 |
| 1.3 杆状病毒基因操作 |
| 1.3.1 早期研究使用的方法 |
| 1.3.2 bacmid构建方法与Bac-to-Bac系统 |
| 1.3.3 λ-Red重组技术 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2. 小菜蛾颗粒体病毒荧光报告Bacmid的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 2.2.2 细胞系和病毒株 |
| 2.2.3 常用质粒 |
| 2.2.4 培养基和抗生素 |
| 2.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 2.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 2.2.7 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 2.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 2.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 2.3.4 细菌菌株构建 |
| 2.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PlxyGV bacmid vPxG的构建 |
| 2.4.2 荧光报告PlxyGV bacmids的构建 |
| 2.4.3 PlxyGV bacmid对三种昆虫细胞系的转染-感染实验分析 |
| 2.5 讨论 |
| 3. 小菜蛾颗粒体病毒在三种昆虫细胞系中的基因表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 3.2.2 细胞系和病毒株 |
| 3.2.3 常用质粒 |
| 3.2.4 培养基和抗生素 |
| 3.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 3.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 3.2.7 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 3.3.2 瞬时表达质粒构建 |
| 3.3.3 瞬时表达实验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PlxyGV早、晚期启动子和hr序列的转录因子结合位点 |
| 3.4.2 PlxyGV早、晚期启动子在三种昆虫细胞系中转录活性分析 |
| 3.4.3 PlxyGV hrs对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.4.4 iel蛋白对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 4. AcMNPV p35、iel和gp64基因对PlxyGV重组体的功能拯救 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 4.2.2 细胞系和病毒株 |
| 4.2.3 常用质粒 |
| 4.2.4 培养基和抗生素 |
| 4.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 4.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 4.2.7 引物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 4.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 4.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 4.3.4 细菌菌株构建 |
| 4.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 4.3.6 透射电子显微镜分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 PlxyGVf不能功能性替代AcMNPV gp64 |
| 4.4.2 PlxyGV iap1和iap2不能功能性替代AcMNPVp35 |
| 4.4.3 AcMNPV p35和ie1基因对PlxyGV离体复制的拯救 |
| 4.5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 为本论文提供支持的国家自然科学基金项目 |
| 致谢 |
（5）重组AcMNPV感染家蚕后造成宿主组织液化的机制分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 家蚕品种、菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 目的基因片段的PCR扩增 |
| 1.3 重组AcMNPV Bacmid的构建 |
| 1.4 重组AcMNPV的构建和接种方法 |
| 1.5 感病家蚕血淋巴中的病毒滴度测定 |
| 1.6 感病家蚕血淋巴中的酶活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组转移载体的鉴定 |
| 2.2 重组AcMNPV Bacmid的鉴定 |
| 2.3 感病家蚕的组织液化情况 |
| 2.4 感病家蚕血淋巴中的重组AcMNPV滴度 |
| 2.5 感病家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性 |
| 3 讨论 |
（6）昆虫杆状病毒液化家蚕宿主组织的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景和选题意义 |
| 1.1.1 昆虫杆状病毒的研究现状 |
| 1.1.2 昆虫液化机制的研究现状 |
| 1.1.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 |
| 1.1.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在基因功能研究上的应用 |
| 1.2 本文的主要内容 |
| 第2章 昆虫杆状病毒组织蛋白酶和几丁质酶的原核表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.3.2 基因的原核表达质粒的构建 |
| 2.3.3 表达菌株的选择 |
| 2.3.4 外源基因的诱导表达 |
| 2.3.5 表达产物的纯化 |
| 2.3.6 表达产物的活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组AcMNPV感染家蚕后造成组织液化的机制分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组转移载体的构建 |
| 3.3.2 重组Bacmid获得及鉴定 |
| 3.3.3 重组Bacmid转染Sf21细胞 |
| 3.3.4 感病家蚕血淋巴中的重组AcMNPV滴度 |
| 3.3.5 感病家蚕的组织液化情况 |
| 3.3.6 感病家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组杆状病毒感染家蚕后造成外源蛋白的降解分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组AcMNPV和BmNPV感染细胞后的比较分析 |
| 4.3.2 重组AcMNPV和BmNPV感染家蚕后的比较分析 |
| 4.3.3 感病家蚕血淋巴中的病毒滴度 |
| 4.3.4 EGFP蛋白在培养细胞和家蚕成体中的降解分析 |
| 4.3.5 EGFP蛋白的降解与组织蛋白酶活性的关系 |
| 4.3.6 EGFP蛋白的体外降解 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 两种病毒组织蛋白酶和几丁质酶的氨基酸序列比对分析 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒分类学 |
| 1.1.2 杆状病毒对宿主的侵染过程 |
| 1.1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.1.4 影响宿主功能的杆状病毒基因 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 第二章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株和多角体病毒纯化 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 2.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 扫描电镜观察 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 第三章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 昆虫细胞及病毒 |
| 3.1.3 试验昆虫 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 细菌培养基 |
| 3.1.6 昆虫细胞培养基 |
| 3.1.7 常用溶液及缓冲液 |
| 3.1.8 实验仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的传代 |
| 3.2.2 细胞的冻存 |
| 3.2.3 细胞的复苏 |
| 3.2.4 病毒感染细胞 |
| 3.2.5 昆虫添食病毒 |
| 3.2.6 碱法少量快速抽提质粒 DNA |
| 3.2.7 限制性内切酶反应 |
| 3.2.8 玻璃奶法纯化回收 DNA 片段 |
| 3.2.9 DNA 的连接 |
| 3.2.10 感受态细胞的小量制备 |
| 3.2.11 感受态细胞的大量制备 |
| 3.2.12 质粒 DNA 的转化 |
| 3.2.13 快速细胞破碎法鉴定重组质粒 |
| 3.2.14 绝对定量 PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HearMNPV 对宿主细胞的感染（体外复制） |
| 3.3.2 HearMNPV 在棉铃虫体内的复制 |
| 3.3.3 HearMNPV 对其它昆虫的感染 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 半补齐法构建棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组文库 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HearMNPV 的扩增 |
| 4.2.2 多角体病毒 DNA 的提取 |
| 4.2.3 用 Sau3AⅠ酶对 HearMNPV 基因组 DNA 随机切割 |
| 4.2.4 半补齐反应 |
| 4.2.5 连接与转化 |
| 4.2.6 插入片断大小鉴定及文库覆盖率 |
| 4.2.7 DNA 测序 |
| 4.2.8 基因组序列组装 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 ORF 的确定 |
| 5.1.2 启动子基序搜索 |
| 5.1.3 同源重复区（hrs）的寻找 |
| 5.1.4 基因组内容、组织及排列分析 |
| 5.1.5 系统进化分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 HearMNPV 基因组核苷酸序列分析 |
| 5.2.2 基因对等图分析 |
| 5.2.3 系统进化分析 |
| 5.2.4 HearMNPV 与 MacoNPV-B 基因组结构的比较 |
| 5.2.5 HearMNPV ORF6644 |
| 5.2.6 HearMNPV ORF1746 |
| 5.2.7 HearMNPV unique ORF |
| 5.2.8 bro genes |
| 5.2.9 hrs |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 6.2 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 6.3 半补齐法构建 HearMNPV 基因组文库 |
| 6.4 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）重组杆状病毒Ac MNPV-BmKIT-vcath的构建及毒力分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、质粒及菌株 |
| 1.2 病毒、细胞和昆虫 |
| 1.3 寡聚核苷酸 |
| 1.4 重组载体的构建及转座 |
| 1.5 重组穿梭载体Bacmid-BmK IT-vcath转染Sf9昆虫细胞 |
| 1.6 棉铃虫幼虫的饲养与病毒感染 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath的构建及鉴定 |
| 2.2 重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath对棉铃虫的感染 |
| 2.3 重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath的活性测定 |
| 3 讨论 |
（9）东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒的生物学和分类学 |
| 1.2 杆状病毒基因组 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组的测序概况 |
| 1.2.2 杆状病毒基因组结构 |
| 1.2.3. 杆状病毒的基因结构 |
| 1.2.4. 保守基因及其功能 |
| 1.2.5. 可变基因 |
| 1.2.6. 基因组的重组 |
| 1.3 杆状病毒的系统发生和进化 |
| 1.3.1 杆状病毒的系统发生史 |
| 1.3.2 杆状病毒的进化 |
| 第二章 本研究的立题依据、意义和研究方案 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究意义 |
| 2.3 研究方案 |
| 第三章 东方粘虫颗粒体病毒的形态特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒株和颗粒体病毒纯化 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 3.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扫描电镜观察 |
| 3.3.2 透射电镜观察 |
| 第四章 东方粘虫颗粒体病毒基因组全序列分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒株和颗粒体纯化 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 工具酶 |
| 4.1.4 试剂 |
| 4.1.5 培养基及有关溶液的配制 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 颗粒体病毒DNA 的提取 |
| 4.2.2 碱法少量快速抽提质粒DNA |
| 4.2.3 碱法大量制备质粒DNA |
| 4.2.4 DNA 浓度测定 |
| 4.2.5 限制性内切酶反应 |
| 4.2.6 玻璃奶法纯化回收DNA 片段 |
| 4.2.7 DNA 的连接 |
| 4.2.8 质粒DNA 的转化 |
| 4.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.10 随机文库的建立 |
| 4.2.11 DNA 测序 |
| 4.2.12 基因组序列分析 |
| 4.2.13 基因组中2 个同源基因位置的确定 |
| 4.2.14 PsGV（ODVs）颗粒体组成蛋白的制备 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PsGV 全基因组的核苷酸序列分析 |
| 4.3.2 PsGV 的ORFs 与其它杆状病毒的比较 |
| 4.3.3 PsGV 特有的ORF |
| 4.3.4 同源区（hr） |
| 4.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes） |
| 4.3.6 PsGV 基因组中的两个同源基因 |
| 4.3.7 PsGV 基因组中最大的基因 |
| 4.3.8 PsGV 增效蛋白基因（enhancin） |
| 4.3.9 PsGV（OBs）颗粒体组成蛋白分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 的形态特征研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒株和多角体纯化 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 扫描电镜观察 |
| 5.3.2 透射电镜观察 |
| 第六章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 基因组全序列分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 病毒株和多角体纯化 |
| 6.1.2 菌株和质粒 |
| 6.1.3 工具酶 |
| 6.1.4 试剂 |
| 6.1.5 培养基及有关溶液的配制 |
| 6.1.6 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 SpltNPV II 全基因组的核苷酸序列分析 |
| 6.3.2 SpltNPV II 的ORFs 与其它杆状病毒的比较 |
| 6.3.3 SpltNPV II 特有的ORFs |
| 6.3.4 同源区（hr） |
| 6.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes） |
| 6.3.6 SpltNPV II 中含有两个同源序列的基因 |
| 6.3.7 SpltNPV II 与SpltNPV I 比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 东方粘虫颗粒体病毒(PsGV)的形态特性研究 |
| 8.2 东方粘虫颗粒体病毒(PsGV)基因组序列分析 |
| 8.3 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II(SpltNPV II)的形态特性研究 |
| 8.4 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II(SpltNPV II)基因组序列分析 |
| 8.5 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 杆状病毒相关研究进展 |
| （一） 杆状病毒的分子生物学 |
| （二） 杆状病毒的表达系统 |
| （三） 杆状病毒杀虫剂 |
| （四） 粘虫杆状病毒基因组研究 |
| 第二章 杆状病毒Ⅱ型NPV p13 基因的启动子活性和分子进化 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 杆状病毒Ⅱ型NPV p13 基因是一个杀虫相关基因 |
| 摘要 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 LsNPV P13 蛋白对AcMNPV 多角体和BV 产量的影响 |
| 摘要 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 P13 蛋白在细胞中的定位 |
| 摘要 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 研究总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 发表及待发表文章 |
| 致谢 |
四、Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene（论文参考文献）
- [1]AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac25的功能研究[D]. 郭艺. 山西大学, 2020(01)
- [2]宿主内吞途径相关因子在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒侵染中的作用[D]. 岳琦. 西北农林科技大学, 2019(08)
- [3]家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究[D]. 王海萍. 浙江大学, 2019(11)
- [4]小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析[D]. 胡原. 华中师范大学, 2014(07)
- [5]重组AcMNPV感染家蚕后造成宿主组织液化的机制分析[J]. 彭伟,陈爱春,汪生鹏. 蚕业科学, 2012(04)
- [6]昆虫杆状病毒液化家蚕宿主组织的机制研究[D]. 彭伟. 江苏科技大学, 2012(03)
- [7]一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析[D]. 唐平. 中国农业科学院, 2011(03)
- [8]重组杆状病毒Ac MNPV-BmKIT-vcath的构建及毒力分析[J]. 曹建斌,范晓军,付月君,梁爱华. 山西大学学报(自然科学版), 2009(01)
- [9]东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析[D]. 李轶女. 中国农业科学院, 2008(10)
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