一、碱性成纤维细胞生长因子促进周围神经侧枝生长的实验研究（论文文献综述）
刘振辉[1]（2021）在《仿生导电人工神经支架的研究》文中认为目的:（1）制备具有导电功能的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架,并对其进行表征,验证其生物相容性,利用支架进行细胞三维立体培养,研究电刺激对RSC96细胞生长的影响。（2）制备具有取向性纳米纤维的PLLA纤维膜,并对其进行表征,验证其生物相容性,研究纤维取向性对RSC96细胞信号蛋白的影响。（3）制备仿生导电人工神经支架,将支架植入大鼠坐骨神经缺损,探讨仿生导电人工神经支架对大鼠坐骨神经修复效果和机制。方法:（1）利用梯度冷冻和冷冻干燥技术制备出具有多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架。通过微结构、溶胀和脱溶涨、导电率、形状记忆功能、载药及药物释放性能、力学性能和生物相容性对制备的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架进行表征,对三维立体培养的RSC96细胞进行组织学评价,观察不同培养条件下细胞生长行为。（2）利用静电纺丝技术制备出具有取向纳米纤维的PLLA纤维膜。通过扫描电镜、力学性能、降解性和生物相容性对制备的PLLA纤维膜进行表征。利用免疫荧光技术研究纤维取向性对RSC96细胞ERK、P38MAPK、MEK和LRP4蛋白的影响。（3）利用定制的模具制备多微通道导电支架,将第二部分制备的高取向PLLA纤维膜和定制的多微通道导电支架组合成仿生导电人工神经支架,并将神经支架植入到大鼠坐骨神经缺损处。将实验动物分为支架组（S）、支架联合电刺激组（S&E）和自体神经移植组（AT）,通过坐骨神经功能指数、神经电生理检测、肌肉组织学检测、再生神经的组织学检测来分析仿生导电神经支架对周围神经再生的影响。结果:（1）加入的多壁碳纳米管没有影响琼脂糖支架的孔隙组成比和形状记忆功能,但0.025%wt多壁碳纳米管提高了支架在溶胀平衡状态下的溶胀率和保水能力。多壁碳纳米管改变了琼脂糖支架的电导率、载药及药物释放能力和力学性能。高浓度多壁碳纳米管对RSC96细胞和PC12细胞的增殖有一定影响。电镜下PC12细胞在多壁碳纳米管琼脂糖支架上生长状态良好。多壁碳纳米管的加入未改变RSCs细胞的S100β表达量。当电刺激存在时,RSC96细胞层沿支架纵轴排列较好,0.025%MWCNT-琼脂糖支架和0.05%MWCNT-琼脂糖支架表现出更好的细胞黏附性。（2）制备的PLLA纤维膜为多孔结构,纤维大部分为取向排列,高取向纤维膜的纤维取向性更高,其表面光滑,粗细均匀,纤维间形成立体的三维孔隙并分布于整个纤维膜。取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（59.06±2.49）MPa,取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（56.82±2.80）MPa,两种纤维膜拉伸强度没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（1037.07±133.30）MPa,高取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（971.45±112.39）MPa,两种纤维膜杨氏模量没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为364.48±53.79,高取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为356.89±40.21,两种纤维膜断裂伸长率没有统计学差异。增加PLLA纤维膜的取向,并未明显改变纤维膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂延伸率。改变纤维膜的纤维取向程度,对PLLA纤维膜的降解速率没有影响。取向PLLA纤维膜和高取向PLLA纤维膜对RSC96细胞的增殖均没有影响。和取向性纤维膜相比,高取向的PLLA纤维膜上的RSC96细胞呈现出现明显的丝状伪足,沿着排列整齐的纳米纤维延伸。和取向性PLLA纤维膜相比,高取向PLLA纤维增加了RSC96细胞ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白表达量（P<0.01）。（3）制备的仿生导电人工神经支架跟大鼠坐骨神经匹配良好,植入神经缺损出未见异物反应。S&E组坐骨神经功能指数、神经电生理结果、肌肉组织学结果、轴突和髓鞘再生效果接近AT组,好于S组。术后12周时免疫组化结果显示,NF-H蛋白和S00-β蛋白表达,S&E组和AT组的高于S组（P<0.01）,而S&E组接近AT组。LRP4蛋白和P38MAPK蛋白表达,AT组高于S组（P<0.01）,但AT和S&E组,S&E组和S组相比均无差异无统计学意义。ERK蛋白和MEK蛋白表达情况,AT组高于S组和S&E组（P<0.01）,S&E组和S组两者相比差异无统计学意义。结论:（1）多壁碳纳米管琼脂糖支架具有高的孔隙率、一定的形状记忆功能、载药及药物释放能力、导电能力,良好的生物相容性。在电刺激存在时,具有导电性能的多壁碳纳米管琼脂糖支架对RSC96细胞生长具有引导作用。（2）和取向性的PLLA纤维膜相比,高取向性的PLLA纤维膜未改变其力学性能、降解性和生物相容性,但增加了ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白的表达量,能引导RSC96细胞生长和迁移,这有利于其在周围神经再生中的应用。（3）仿生导电人工神经支架联合电刺激能够增强周围神经再生。电刺激可能通过ES通过与MAPK信号通路的激活促进周围神经再生,ERK、P38MAPK、MEK和LRP4可能参与周围神经再生。
邵帅[2]（2020）在《三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响》文中进行了进一步梳理[目的]为评价三法三穴对SNI大鼠坐骨神经SC增殖和神经瘢痕形成的影响而开展本实验,本实验从行为学、组织形态学与分子生物学三个层面,评价三法三穴干预能否通过调节TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,影响SNI模型大鼠坐骨神经损伤点SC增殖及神经瘢痕的形成,促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。以期进一步揭示推拿促进坐骨神经损伤后修复的机理,完善推拿治疗周围神经损伤的理论基础,为推拿治疗周围神经损伤疾病提供科学证据。[方法]1 动物分组、造模和干预方法选取健康雄性SD大鼠78只,随机分为假手术组、模型组、三法三穴组,每组各26只。采用坐骨神经夹持损伤法制备SNI模型大鼠。三法三穴组从造模后第8天（d）开始,对大鼠殷门穴、承山穴、阳陵泉穴进行点法、拨法、揉法干预,每穴每手法1min。干预10d休息1d,共干预20次。2行为学检测方法每组每个时间点随机选取6只大鼠进行行为学观察。在造模后7d、14d、21d、28d,检测各组大鼠斜板试验角度。在造模后7d、28d,检测各组大鼠SFI。3组织形态学检测方法每组随机选取4只大鼠,在造模后28d时运用HE染色法,观察SNI大鼠坐骨神经损伤点SC细胞数目和神经瘢痕厚度及染色深度的变化。4蛋白定量检测方法每组每个时间点随机选取4只大鼠,运用免疫荧光标记法,观察造模后7d、28d时坐骨神经损伤点中S100、TGF-β1、Smad2及造模后28d时坐骨神经损伤点Ⅰ/Ⅲ型胶原和FN的表达变化。每组每个时间点随机选取6只大鼠,运用Western-blotting技术,检测坐骨神经损伤点在造模后7d、14d、28d三个时间点TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达变化。5统计方法使用Image J 1.48u软件分析免疫荧光和Western-blotting图像。使用SAS 8.0软件对数据进行统计分析。[结果]1三法三穴干预对SNI大鼠运动功能恢复的影响SFI结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,大鼠SFI显着降低（P<0.01）。三法三穴组与模型组相比,大鼠SFI显着升高（P<0.01）,且接近假手术组水平。斜板实验结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d、21d、28d,大鼠斜板倾斜角度显着降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d、21d,大鼠斜板倾斜角度有升高趋势（P>0.05）,造模后28d,斜板倾斜角度显着升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢精细动作及后肢肌力的恢复,说明三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。2三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经SC增殖的影响HE染色结果:假手术组神经纤维轴索及髓鞘完整、排列紧密,SC核嵌于鞘膜外。模型组神经纤维稀疏、散乱,鞘膜外SC核数量较假手术组减少。三法三穴组坐骨神经可见再生的神经纤维,并有很厚的髓鞘包绕、轴索清晰,鞘膜外SC核数量较模型组明显增多。S100免疫荧光染色结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠坐骨神经损伤点SC标记物S100的平均光密度值明显降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,坐骨神经S100平均光密度值明显升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够增加神经损伤后期SC的数目。3三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经瘢痕形成的影响HE染色结果:造模后28d,假手术组坐骨神经损伤点神经外膜结缔组织深染,模型组神经外膜结缔组织深染,三法三穴组神经外膜结缔组织染色较模型组明显变浅。Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN免疫荧光染色结果:造模后28d,与假手术组相比,模型组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原、FN表达均明显增多（均有P<0.05）。与模型组相比,三法三穴组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN表达均明显减少（均有P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够抑制SNI大鼠坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN分泌,从而抑制神经外膜瘢痕形成。4三法三穴干预对TGF-β1/Smad2通路蛋白表达的影响免疫荧光染色结果:TGF-β1表达部位与S100高度重合,且在模型组、三法三穴组坐骨神经外膜也出现高表达,Smad2表达在DAPI表达位置附近。模型组与假手术组相比,造模后7d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量明显升高（P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。Western-blotting结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d,坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量出现下调趋势（P>0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。以上结果提示:坐骨神经损伤后,TGF-β1主要在SC和损伤神经外膜中表达,Smad2在细胞核周围表达。三法三穴干预在周围神经损伤早期对TGF-β1/Smad2通路蛋白有轻微的下调作用,可能与神经瘢痕形成有关。[结论]三法三穴干预能够增加损伤后期SNI大鼠坐骨神经SC的数目。三法三穴干预能够通过轻微下调TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,抑制SNI大鼠坐骨神经瘢痕的形成,以促进SNI大鼠运动功能恢复。
唐安群[3]（2020）在《定向诱导去分化脂肪（d-DFAT）细胞对大鼠面神经缺损的修复作用》文中认为面神经损伤是口腔颌面外科临床上一种常见且较为严重的创伤并发症之一,常伴随腮腺区域的外伤及手术相关创伤,进而导致面神经麻痹。继发于面神经损伤后引起的周围性面神经麻痹,是一种既影响患者面部运动功能（鼓腮无力,眼睑不能闭合等）又影响美观（口角歪斜,鼻唇沟消失等）的严重疾病,会给患者及家人带来了社交、审美等心理、精神障碍。近年来,随着组织工程和再生医学（Tissue engineering and regenerative medicine,TE/RM）飞速发展,针对长间断面神经缺损的问题研究出一系列组织工程神经移植物（Tissue engineered nerve grafts,TENGs）,其包含神经导管支架、支持细胞（种子细胞）、神经营养因子、细胞外基质以及细胞粘附分子等成分,通过模拟自体神经移植物的结构及生物学特点,建立理想的再生微环境以更好地促进再生神经轴突由近端向远端生长并再支配靶器官。临床上,脂肪组织可以通过反复使用安全、微创的吸脂术获得,因此其成为理想的种子细胞来源。成熟脂肪细胞是脂肪组织中最丰富的细胞类型,其占脂肪组织的90%以上。从脂肪组织中分离出的成熟脂肪细胞可以通过体外去分化（天花板培养）为成纤维细胞样细胞,称为去分化脂肪细胞（Dedifferentiated fat cells,DFAT cells）。与传统脂肪组织来源干细胞——脂源性干细胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）相比,DFAT细胞体现出相同的增殖活性以及多向分化的能力。DFAT细胞与ASCs虽然同样来自于脂肪组织,但两者来源的细胞群体不同,DFAT细胞来源于成熟的脂肪细胞,而ASCs来源于脂肪组织中基质-血管部分（Stromal-vascular fraction,SVF）,而SVF是由一组异质性的细胞群组成的,内含内皮细胞、非特征性的基质细胞、血液细胞和组织型巨噬细胞等。通过两者来源我们可以推测DFAT细胞具有较高的同质性（Homogeneity）,纯度远高于ASCs,并且来源于占脂肪组织90%以上的成熟脂肪细胞的它来说,初期即可获得大量的细胞基数,为快速进行面神经缺损修复提供可能。目的:本研究拟通过体外细胞因子诱导,将DFAT细胞在体外定向诱导为类雪旺细胞样细胞,称为定向诱导分化的去分化脂肪细胞（Direction-induced dedifferentiated fat cells,d-DFAT cells）,并进一步探讨其对促进面神经再生的作用。利用d-DFAT细胞并复合I型胶原凝胶与硅胶导管构建一种新型组织工程神经并评价其修复面神经缺损的效果。方法:1.分离DFAT细胞（天花板培养法）及ASCs（差速离心法）原代细胞,并进行培养传代。然后通过流式细胞表面抗原的鉴定、三系诱导分化以及细胞形态这3种方式观察DFAT细胞是否与ASCs一样具有“干细胞特性”。2.将第2代DFAT细胞及ASCs应用细胞因子进行体外诱导分化,通过鉴定SCs的细胞表面标志物神经组织蛋白S-100β（Nerve tissue protein S-100β,S-100β）及胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）来判断其是否具有向SCs分化的能力。3.将种子细胞（d-DFAT细胞、d-ASCs、DFAT细胞及ASCs）与Ⅰ型胶原蛋白混合后,与硅胶导管共培养形成TENGs。将其植入到SD大鼠面神经缺损模型中通过比较各组大鼠触须运动功能、再生面神经颊支神经电生理评估及再生面神经颊支形态学及组织学的情况,判断各组对SD大鼠面神经颊支缺损的再生能力。4.利用d-DFAT细胞构建3D细胞聚合体,并其进行组织学评估。结果:1.DFAT细胞与ASCs细胞形态成梭形的类成纤维细胞样;能够进行成骨及成脂诱导分化;流式细胞表面抗原鉴定显示CD44与CD90表达阳性而CD45表达阴性。2.DFAT细胞在神经诱导培养基作用下发生分化,形态上逐渐由梭形、扁平状多突起星状成纤维细胞样细胞,转变为纺锤形、细胞双极呈拉丝状延伸的SCs形态;免疫细胞化学（ICC）鉴定证实d-DFAT细胞与d-ASCs一样,均表达SCs表面标志物S-100β和GFAP。3.通过对SD大鼠触须运动的观察、神经电生理的检测以及组织学结构（髓鞘、轴突及胶质细胞）的评估,可知类雪旺样细胞组（d-DFAT细胞组与d-ASCs组）面神经功能及结构恢复的速度及程度均要优于干细胞组（DFAT细胞组与ASCs组）,但整体情况要略逊于自体神经组（Autograft组）。4.d-DFAT细胞培养形成3D d-DFAT细胞聚合体,并通过组织学评估我们可以发现,3D d-DFAT细胞聚合体由大量细胞组成,且细胞之间密度较高、排列较为均匀内含有大量的胶原纤维及I型胶原蛋白,细胞之间存在大量细胞外基质。结论:1.DFAT细胞与ASCs一样具有“干细胞特性”。2.DFAT细胞与ASCs一样能够向类雪旺细胞进行分化。3.建立了SD大鼠面神经颊支10mm缺损的模型;利用含种子细胞（d-DFAT细胞、d-ASCs、DFAT细胞及ASCs）的TENGs对大鼠面神经颊支缺损进行修复,通过大鼠触须运动、神经电生理及再生面神经颊支形态学及组织学的评价,发现d-DFAT细胞作为种子细胞与d-ASCs一样均能够很好的引导和支持轴突再生,并促进髓鞘的形成;与单纯的干细胞作为种子细胞（DFAT细胞、ASCs）进行比较,d-DFAT细胞在面神经颊支缺损修复的过程中具有显着的优势;但与自体神经移植相比下仍然有不足。4.成功构建3D d-DFAT细胞聚合体,通过对其进行组织学评估,发现其内细胞排列均匀且富含胶原纤维及I型胶原蛋白,细胞之间存在大量细胞外基质。
胡晓芳[4]（2020）在《有序导电纳米纤维支架促进骨髓间充质干细胞向施万细胞分化及其在组织工程修复周围神经缺损的应用》文中研究指明周围神经损伤是一个世界性的临床问题,常由创伤或手术引起,可导致部分或全部的运动功能和感觉知觉丧失,甚至终身残疾。自体神经移植作为轴突再生理想的免疫惰性支架,被认为是治疗不可逆神经缺损的“金标准”。然而,自体神经移植受限于来源的缺乏、供体部位的高发病率、移植物与宿主神经的尺寸不匹配等。为了克服这些局限性,各种生物材料和种子细胞被用来制造人工神经支架,用于神经缺损的桥接,并取得了不同程度的成功。在这些方法中,有序纳米纤维构成的人工神经受到广泛关注,被认为能显着促进轴突的再生。另有研究表明,线形对干细胞的黏附、增殖、迁移和分化均有影响。施万细胞（Schwann cells,SCs）作为周围神经组织工程最有前途的种子细胞,可以合成和分泌多种神经营养因子和细胞外基质,引导和促进轴突的生长。此外,再生的轴突必须通过SCs再髓鞘化才能作为功能神经传导冲动。遗憾的是,SCs仅分布于周围神经,且属于高度分化、增殖能力低的成体细胞。采用传统的SCs分离方法存在供体神经来源困难及细胞扩增慢等问题,故难以获得足够的SCs以满足治疗需要。已有资料表明,骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）可诱导分化为施万样细胞,且排列整齐的纳米纤维可显着促进其分化,这说明微环境的拓扑结构在SCs分化中起着重要的作用。考虑到SCs与导电性轴突共存,我们推测导电性也可能会对BMSCs向SCs的分化过程产生影响,但是我们并没有找到相关的文献报道。为此,我们设计本课题对这一假设进行了验证:我们将导电材料-胺功能化的多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes,MWCNT）与聚己内酯（Polycaprolactone,PCL）和明胶（gelatin）共混,电纺成有序或无序导电纳米纤维,研究评价其对BMSCs向SCs分化的影响。然后利用大鼠坐骨神经缺损模型,研究以MWCNT/PCL/gelatin静电纺丝纤维为基础的人工神经导管对周围神经损伤后再生的影响。研究方法:1.以MWCNT,PCL及gelatin为原料,利用静电纺丝法,制备4种纳米纤维膜:无序纤维膜（random,R）,有序纤维膜（aligned,A）,无序导电纤维膜（random and conductive,RC）,有序导电纤维膜（aligned andconductive,AC）。采用扫描电子显微镜对纳米纤维膜的表面形貌进行观察,利用Image J软件从图像中测量电纺纤维的直径,电化学工作站检测导电性,活死细胞染色评价纤维膜的生物相容性。2.体外分离培养BMSCs,并分别接种于4种纳米纤维膜或细胞培养板上,通过三个步骤向SCs诱导分化,通过免疫荧光染色、Western Blot验证诱导后的各组BMSCs（iBMSCs）表达SCs的特异性标记蛋白的差异。3.为检测iBMSCs对神经突生长的生物效应,体外分离培养背根神经节（DRG）,与iBMSCs共培养5 d后,免疫荧光染色检测轴突的走向及长度的区别。4.制备PCL导管,将培养有iBMSCs的静电纺丝纤维膜填充进导管中,移植到SD大鼠坐骨神经10 mm缺损处,移植后12 w通过免疫荧光染色检测神经丝蛋白（Neurofilament,NF）及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）的表达判断轴突再生及再髓鞘化的情况。通过腓肠肌湿重比,腓肠肌横截面的HE染色及神经电生理检测判断神经损伤后功能恢复及靶区肌组织修复情况。研究结果:1.材料的制备及表征:1.1采用静电纺丝技术制备了有序导电PCL/gelatin/MWCNT纳米纤维。作为对照,同时制备了无序导电的PCL/gelatin/MWCNT纳米纤维以及有序或无序不导电的PCL/明胶纳米纤维。扫描电子显微镜图像显示,这些纤维表面光滑,直径分布范围在200-900nm之间。1.2电化学工作站检测结果表明,与不导电纤维膜（R和A）相比,RC和AC纤维膜的导电性明显提高,说明MWCNT可以显着提高纳米纤维膜的导电性能。1.3活死细胞染色结果显示BMSCs在纤维膜上生长状态良好,与细胞培养板无显着差异,提示纤维膜具有良好的生物相容性。2.体外实验鉴定纤维膜对BMSCs向SCs诱导及对DRG神经突延伸的影响:2.1免疫荧光染色显示,向SCs方向定向诱导的BMSCs表达SCs的特异性标记物以及SCs的功能性蛋白S100,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）及神经生长因子（nerve growth factor,NGF）,Western blotting 和定量分析结果显示,所有诱导细胞的S100、GFAP和NGF水平均显着高于未诱导细胞。排列整齐的纳米纤维（A和AC）显着上调了 S100、GFAP和NGF的表达,而无序的纳米纤维（R和RC）与iBMSCs的表达水平相似。AC组水平高于A组,差异有统计学意义。2.1通过β微管蛋白Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ,Tuj1）的免疫荧光染色检测DRG神经突的长度,结果说明在有序导电纤维膜上诱导的iBMSCs显着促进共培养DRG的神经突生长。3.体内实验检测含有序导电纤维膜的人工神经可促进坐骨神经损伤后修复:3.1免疫荧光染色结果证明,有序导电纤维膜上诱导的iBMSCs可以分化为成熟的SCs并参与髓鞘的形成;含有序导电纤维膜的人工神经导管显着促进坐骨神经损伤后的轴突再生及再髓鞘化。3.2电生理及腓肠肌横截面HE染色结果证明,含有序导电纤维膜的人工神经导管促进坐骨神经传导功能及其支配的靶肌肉的功能的恢复。研究结论:相对于无序纤维,有序纤维能有效促进BMSCs向SCs的诱导分化,在有序纳米纤维上赋予导电性可以显着增强SCs的分化效率,但是导电性对无序纤维的诱导分化并无明显的影响。此外,体内外实验结果均表明,有序导电纳米纤维可通过促进BMSCs分化为SCs,加速周围神经轴突的再生。总之,在有序纤维赋予导电性促进BMSCs向SCs分化,进而提高神经组织工程的治疗效果。
李越[5]（2019）在《新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用》文中提出现代战争中各种火器的强大动能极易导致周围神经缺损,平时周围神经损伤则常见于交通事故、肿瘤切除、炎性疾病、先天性畸形等因素。缺损性周围神经损伤不仅难以修复,也给病人及社会带来沉重负担。与再生能力低下的中枢神经系统损伤相比,长度小于0.5cm的周围神经缺损可采用神经吻合术进行处理,预后往往较好。当神经缺损大于4cm时则首先采用自体神经移植进行修复,但以自体神经为供体不仅来源受限、匹配困难,也存在很多后遗症,且修复效果也并非尽如人意。同种异体神经虽已开展临床应用研究,但修复效果远不如自体神经,亦存在免疫排斥问题。近年来快速发展的组织工程神经技术为神经缺损修复带来了新希望,其优点在于:一是可以作为自体神经和同种异体神经的替代物,二是可以修复更长的神经缺损,三是可以根据神经缺损长度和直径“量身定做”。虽已有少量组织工程神经用于临床,但存在神经再生缓慢、神经结构和功能恢复欠佳等问题。从以往组织工程神经及其修复周围神经缺损的研究来看,目前学者正从以下几个方面对组织工程神经技术进行改进:一是支架材料的合成、筛选与神经导管制作,目前认为PLGA是较为理想的支架材料;二是选择更适宜的种子细胞,以往曾用种子细胞有ESCs、NSCs、BMSCs、ADSCs、DPSCs、SCs、OECs等多种,表皮神经嵴干细胞（Epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs）易于获取、自我更新能力强、且具有多向分化、分泌神经营养因子、致瘤风险低等优点,显示了较好的应用前景;三是选择更优秀的细胞外基质,以强化移植修复过程中对神经再生的诱导和促进作用。同时,人们还发现,炎性免疫反应对于神经缺损的修复有十分重要的影响,这也成为近年研究的一个热点,对其进行探讨将有助于从机制上突破现有神经缺损修复的困境。炎性免疫反应在组织创伤修复过程中具有重要作用,深刻影响着神经再生的病理生理过程。炎性免疫反应是由免疫活性细胞和炎性细胞因子构成的复杂网络,近年来人们逐渐认识到巨噬细胞是这一网络中关键的免疫活性细胞,它在神经缺损修复过程中既能向M1型极化从而产生神经毒性,也能向M2型极化而利于神经损伤修复。目前认识到炎性细胞因子主要有两类,一类是促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等,可加剧炎性反应;另一类是抗炎因子,如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1等,则可以抑制炎性反应。本研究在课题组既往建立的人工神经制备方法基础上,提出以EPI-NCSCs这样一种从自体毛囊获得的神经干细胞,结合PLGA支架及ECM细胞基质构建出新型组织工程神经,观察其桥接移植的修复效果,并着重从其对炎症反应调控的角度,研究其作用机制。首先将新型组织工程神经桥接于大鼠坐骨神经（Sciatic nerve,SN）缺损处（缺损总长度为15mm,该长度相当于人体神经缺损12.8-14.2cm）。再于桥接后9周内分别采用不同指标,观察新型组织工程神经在移植修复过程中对巨噬细胞的极化状态、炎性因子表达变化的调控及其对于缺损坐骨神经结构和功能的修复作用。拟解决的关键科学问题是:新型组织工程神经对局部神经组织内的巨噬细胞极化是否具有调节作用?新型组织工程神经能否调控局部炎性细胞因子的表达?调控后的炎性免疫微环境是否更有利于周围神经缺损的移植修复?材料与方法1.EPI-NCSCs培养与组织工程神经制作及坐骨神经桥接（1）细胞培养:EPI-NCSCs取自GFP转基因大鼠毛囊中,用DMEM/F12/FBS/bFGF培养液原代培养,PBS液洗涤覆有细胞的载玻片后,用Nestin/SOX10一抗工作液4℃孵育过夜,PBS漂洗后用Cy5-IgG/Alexa-Flour-594-IgG二抗工作液37℃避光孵育,然后计算SOX10+/Nestin+细胞数量。（2）PLGA支架:将PLA/PGA按85/15的比例混匀后溶于三氯甲烷制备5%溶液,玻璃培养皿中蒸发形成厚约25um的PLGA膜,然后卷膜制成PLGA导管,γ射线照射灭菌,用前以DMEM/F12浸润。（3）常规麻醉SD大鼠,暴露右侧坐骨神经,切除10mm坐骨神经,残端回缩形成长约15mm缺损。然后用PLGA导管套接于神经断端,注入25μL EPI-NCSCs/ECM,8-0缝线缝合断端,逐层缝合肌肉皮肤。2.调控巨噬细胞极化（1）免疫荧光鉴定:同上麻醉SD大鼠,暴露并取出长约20 mm坐骨神经,切为20μm冰冻切片,入TritonX-100 15分钟,山羊血清封闭1小时,用CD68/iNOS一抗（M1型巨噬细胞）和CD206/Arginase-1一抗（M2巨噬细胞）4℃孵育过夜,TRITC-IgG/FITC-IgG二抗避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,避光孵育30分钟。（2）成纤维细胞和SCs免疫荧光鉴定:SD大鼠麻醉后取出坐骨神经,制成20μm冰冻切片,用Vimentin一抗（成纤维细胞）和S-100一抗（SCs）孵育,二抗工作液为TRITC-IgG/FITC-IgG（1:200）,细胞核用Hoechst33342染色。3.炎性细胞因子调节（1）Western-blot测定:将所取坐骨神经匀浆后提取总蛋白,然后定量蛋白浓度,再进行SDS-PAGE电泳、转膜,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α/actin一抗孵育,再用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育,PVDF膜曝光后用Image J图像分析软件测算条带灰度值,actin内参作对照。（2）免疫组化染色:SD大鼠麻醉、取出坐骨神经后制作4μm石蜡切片,脱蜡水化后经3%过氧化氢室温10分钟,山羊血清封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,再用山羊抗兔/鼠IgG二抗孵育,链霉亲和素-过氧化物酶30分钟,DAB显色,光镜观察分析。（3）免疫荧光染色:SD大鼠麻醉、灌注固定、取出坐骨神经后后制作20μm冰冻切片,入0.3%TritonX-100室温15分钟,山羊血清室温封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,二抗TRITC-IgG/FITC-IgG避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,荧光显微镜下拍照与分析。4.缺损坐骨神经修复（1）组织学观察:术后9周时麻醉、固定大鼠、取出坐骨神经行石蜡包埋,切4μm切片,HE染色,光学显微镜观察分析。（2）运动终板检测:术后9周取腓肠肌制作30μm冰冻切片,AChE染色,光学显微镜观察,Image ProPlus图像软件分析。（3）感觉功能评估:术后9周时将大鼠两侧后足浸入50℃热水中,记录两侧后足的回缩反射时间,痛温觉用LFRT表示。（4）运动功能评估:术后9周时记录大鼠后足足印迹,分别测量TS、ITS、PL,然后根据公式计算SFI。（5）神经电生理检测:术后9周时麻醉大鼠,暴露实验侧和正常侧坐骨神经,双钩状电极（极间距2 mm）刺激,双极针形电极记录,刺激间期0.25 ms,刺激强度10mA,刺激频率1Hz,每只大鼠重复记录5次,结果用PowerLab软件分析。（6）腓肠肌湿重恢复检测:术后9周时,麻醉大鼠后切取实验侧和正常侧腓肠肌,吸去血迹后立即用电子天平称重,结果以实验侧腓肠肌重量/正常侧腓肠肌重量×100%表示。5.统计学分析以SPSS（版本22.0）数据统计软件进行统计分析,以均数±标准差表示,以独立样本t检验进行组间比较,P<0.05表示存在显着性差异,P<0.01表示存在极显着性差异。结果1.从GFP大鼠毛囊中获得EPI-NCSCs,经SOX10和Nestin双标鉴定,其纯度高达99.23±2.1%,移植到缺损10mm坐骨神经后,至少在宿主组织内存活9周。所制作的PLGA导管管壁表面为网状结构,间有很多直径约6μm左右的微孔,从而为EPI-NCSCs粘附生长提供了结构基础,也为种子细胞获得环境营养提供了结构保障。2.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1周,可明显提高M2巨噬细胞的比例,降低M1巨噬细胞的数量。桥接后3周时,有利于神经再生的SCs数量和活性被显着提高,而阻碍神经再生的成纤维细胞数量和活性则被明显降低。在所用组织工程神经各成分中,种子细胞EPI-NCSCs在这些有益效应中发挥了关键作用。3.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1、3、7、14、21天,Western-blot、免疫荧光和免疫组化实验证实,宿主组织抗炎因子IL-4和IL-13的表达呈逐渐增强的趋势,而促炎因子IL-6和TNF-α则呈逐渐下降的趋势。抗炎因子水平的提高和促炎因子水平的下降,为坐骨神经损伤后的神经纤维再生提供了更适宜的炎性免疫微环境。4.术后9周时,形态组织学观察证实组织工程神经桥接恢复了缺损坐骨神经的连续性,且神经直径更粗,组织结构更致密,神经纤维成分更多,运动终板数量更多体积也更大。LFRT测定表明感觉功恢复更好。SFI评估显示明显提高了运动功能的恢复水平。与此同时,肌肉湿重恢复率明显优于对照组动物。神经电生理检查证实电位的潜伏期缩短,电位幅度提高,说明神经传导速度更快,对刺激反应更强。结论本研究制备的组织工程神经中的种子细胞EPI-NCSCs至少可在宿主组织内存活9周。组织工程神经在移植过程中一方面促使宿主组织内巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子（IL-4,IL-13）表达,增加有利于神经纤维再生的SCs数量;另一方面降低M1巨噬细胞的数量,抑制促炎因子（IL-6,TNF-α）的表达,降低抑制神经纤维再生的成纤维细胞数量。组织工程神经调控的局部炎性免疫微环境提高了长节段缺损坐骨神经结构与功能的恢复水平。
吴秋丽[6]（2019）在《低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究》文中进行了进一步梳理【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是一种严重的创伤性疾病,修复手段主要有手术治疗、药物治疗、细胞移植等。神经干细胞移植能够有效促进SCI后神经功能的恢复,是当前研究的热点。iPSCs诱导的神经干细胞（induced Pluripotent Stem Cells-Neural Stem Cells,iPS-NSCs）是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,自体取材避免了伦理学争议和免疫排斥,应用于细胞移植治疗脊髓损伤具有显着的优势。然而干细胞在体内存活率低、向神经方向分化较难,因此如何更好的促进其增殖、定向分化是众多研究者关注的焦点。国内外研究表明低强度脉冲超声（Low Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS）是一种可以促进多种细胞增殖、分化的物理刺激手段,本研究旨在明确LIPUS对iPS-NSCs细胞特性的影响以及LIPUS介导的iPS-NSCs对脊髓损伤的修复作用,为干细胞的优化和SCI的治疗提供一种新的策略。本研究通过:1)体外培养iPS-NSCs,将自主研制的LIPUS激励系统作用于iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态学、增殖、分化和神经营养因子（Neurotrophic Factors,NTFs）分泌含量的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数,并初步探索LIPUS干预后细胞增殖的调控机制;2)建立脊髓损伤的动物模型,于脊髓损伤局部移植iPS-NSCs和LIPUS-iPS-NSCs细胞,评价细胞移植后SCI大鼠损伤局部组织学形态、神经营养因子含量以及运动功能的改变,初步探讨LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的效果。【方法】本实验研究分为体外实验和体内实验两部分:体外实验:利用自主搭建LIPUS细胞激励系统,以不同的刺激参数干预iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态,采用CCK-8检测其增殖活性的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数;借助最佳的激励参数,通过TUNEL、ELISA、Western Blot以及免疫组化等方法,观察LIPUS对iPS-NSCs细胞凋亡、分化以及NTFs分泌的影响,并初步探讨细胞增殖与Notch信号通路的潜在关系。体内实验:采用Impactor model-Ⅲ打击器建立Wistar大鼠脊髓损伤动物模型,分为假手术组、单纯损伤组、iPS-NSCs移植组和LIPUS-iPS-NSCs移植组,在大鼠脊髓损伤后7天进行细胞移植。术前1天、术后1天至8周,采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能恢复情况;术后8周大鼠进行灌注取材切片,采用HE染色观察损伤局部空洞的面积,免疫荧光染色观察神经再生和胶质瘢痕形成的情况,ELISA检测局部脊髓组织中营养因子的含量。数据由统计学软件SPSS20.0进行分析,结果以均数±标准差（Mean±SD）形式表示,p<0.05表示具有统计学意义。【结果】1.本实验成功搭建了LIPUS细胞激励系统,LIPUS体外刺激iPS-NSCs细胞可以提高其增殖活性,且最佳的刺激参数为1MHz、8V（69.3 mW/cm2）;2.在最佳刺激参数下,LIPUS可以提高iPS-NSCs细胞活性,而对细胞凋亡没有产生明显的影响,因此1MHz、8V（69.3 mW/cm2）的LIPUS是一种安全、无创的物理刺激因子,同时能够促进iPS-NSCs细胞向神经元方向分化,促进上清液中BDNF、NGF的表达;3.在最佳刺激参数下,LIPUS干预可以促进iPS-NSCs细胞中受体Notch1和靶基因HES1蛋白水平的表达;4.在脊髓损伤体内实验中,细胞移植后,尤其是LIPUS-iPS-NSCs移植组,脊髓组织的空洞减小,轴突增生活跃,反应性星形胶质细胞减少,脊髓组织局部BDNF、NGF表达水平提高;5.功能学评分结果显示LIPUS-iPS-NSCs移植组大鼠的后肢运动功能恢复明显优于其他损伤组,差异具有统计学意义。【结论】1.本研究中自主搭建的LIPUS激励系统可以明显提高体外培养的iPS-NSCs细胞的增殖活性,增加细胞中神经营养因子的表达,促进其向神经元方向分化,其中Notch信号通路可能是调控LIPUS促进iPS-NSCs细胞活性的潜在机制;2.移植LIPUS优化的iPS-NSCs种子细胞,可以明显的改善脊髓损伤大鼠的后肢运动功能,减少局部胶质瘢痕的形成,促进轴突的再生和NTFs表达。本研究证明LIPUS是一种安全、无创的体外激励方法,可以提高iPS-NSCs细胞在脊髓损伤修复中的作用,为优化细胞移植的种子细胞提供了新策略,为脊髓损伤修复提供新思路。
王宇强[7]（2019）在《透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究》文中研究表明目的:（1）体外分离新生SD大鼠雪旺细胞并培养,超速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体并进行特异性蛋白鉴定。透射电镜观察雪旺细胞外泌体的粒径和分布。（2）研究雪旺细胞外泌体对神经元及雪旺细胞的生物学作用。观察和研究透明质酸凝胶缓释外泌体的生物学特征参数。（3）探讨透明质酸水凝胶包裹缓释雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管修复大鼠坐骨神经长节段缺损的形态学和功能学效果。方法:（1）采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法提取原代大鼠雪旺细胞,并采用DMEM/F12完全培养基培养和纯化。采用S100和Sox10进行纯度鉴定。采用CCK-8试剂盒对雪旺细胞的增殖状态进行检测。采用超高速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体,利用BCA试剂盒检测外泌体中蛋白的含量。Western blot法对雪旺细胞分泌外泌体表面标志物CD63、TSG101、CD9、Rab5和Na+/K+ATP酶进行鉴定。（2）构建1%浓度的透明质酸水凝胶,并将雪旺细胞外泌体进行包裹。体外放置于PBS中采用BCA试剂盒检测外泌体的缓释曲线。应用雪旺细胞外泌体干预雪旺细胞和神经元,CCK-8试剂盒检测外泌体对雪旺细胞的增殖作用,以及对两种细胞生物活性蛋白分泌的作用。ELISA法检测培养第1、3、5天后,外泌体干预的雪旺细胞表达神经生长因子（NGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）、髓鞘零蛋白（P0）、细胞极性蛋白Par-3的水平。同时ELISA法检测外泌体干预后第1、3、5天时神经元中生长相关蛋白43（Growth-associatedprotein-43,GAP-43）、神经丝蛋白-200（Neurofilament-200,NF-200）、βIII–Tubulin的表达水平。（3）静电纺丝制备PCL神经导管,并采用扫描电镜观察导管的大体形态及显微结构,测量纤维丝的直径。采用小量程的力学仪器检测PCL神经导管的的杨氏模量、最大应力、最大载荷、最大断裂张力等力学参数。采用透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管,制备15mm长节段大鼠坐骨神经缺损,并进行端端吻合。采用单纯透明质酸填充PCL导管作为对照组,自体神经移植组也进行对照。在术后4、8、12周时检测大鼠坐骨神经指数、再生神经电生理功能。荧光金逆行示踪检测大鼠神经元胞体的存活情况及神经再生的情况。透射电镜观察三组再生神经的有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积。NF-200和S100对各组再生神经的免疫荧光染色,观察期神经结构再生情况。HE染色观察三组大鼠腓肠肌肌纤维直径的差异。结果:（1）雪旺细胞在光镜下可以看到呈梭型,体积不大,存在双极,细胞核在中间,比较明显,有折光性。细胞多呈纵行排列的形态。雪旺细胞在接种2小时后,贴壁的比率约为23.5%,6小时时的贴壁比率增加到47.9%,而在12小时的时候有88.9%的细胞贴壁,在16小时以后细胞贴壁的比率均高于99%。在培养3天时,雪旺细胞数量较最初增长了3.9倍,而培养7天时增长了11.4倍。S-100和Sox-10双标荧光染色对雪旺细胞鉴定的纯度为97%。外泌体粒径主要分布在100-160 nm之间,本研究测得的外泌体的平均直径在125 nm。Western blot检测显示外泌体特异性蛋白CD63、TSG101、CD9在本研究所提取的雪旺细胞外泌体中均有表达,而非外泌体表达蛋白Rab5和Na+/K+ATP酶则未见表达。（2）外泌体在透明质酸凝胶中前3天释放比率较大,第一天释放比率为34%,第三天达到41%,随着时间的延长,释放逐渐缓慢。在第4、5、6、8、16、32天时的累积释放比率为43%、47%、51%、53%、75%、90%,而在第64天时候检测得出累积释放率为99%,几乎完全释放。对照组轴突数量为35.4±4.3,而外泌体刺激组为126.3±14.4（P<0.05）。在轴突生长长度方面,外泌体组的平均长度长达（1563.0±132.5）μm,显着高于对照组的（864.3±77.4）μm（P<0.05）。外泌体干预组雪旺细胞在培养后的第3、5、7天时细胞增殖水平均显着高于对照组（P<0.05）。外泌体刺激后的雪旺细胞分泌NGF、BDNF、髓鞘零蛋白（P0）、细胞极性蛋白Par-3的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平（P<0.05）。外泌体刺激后的DRG神经元细胞分泌的标志性蛋白进行检测,结果发现GAP-43、NF-200、βIII–Tubulin的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平（P<0.05）。（3）PCL神经导管的内孔直径为1500μm左右,而管壁的厚度约为500μm,表面纤维丝均匀分布,纤维丝平均直径为4.9μm。PCL神经导管孔隙率为（89.7±2.6）%、最大应力为（7.5±0.6）MPa、杨氏模量为（22.4±2.1）MPa、最大断裂张力为（596.4±33.8）%、最大载荷为（5.6±0.8）N,符合神经再生要求。术后第4、8、12周时PCL/HA-EXO组大鼠的再生神经有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积显着高于PCL/HA组,而G-ratio值则显着低于PCL/HA组（P<0.05）。而三个时间点中,PCL/HA-EXO的有髓轴突的数量、再生轴突的面积和G-ratio值均与自体神经移植组差异无统计学意义（P>0.05）。术后12周时可见PCL/HA-EXO组大鼠轴突沿着导管顺行生长,有明显的方向性。并且神经轴突及雪旺细胞的表达显着高于PCL/HA组,与自体神经移植组差异不明显。各组大鼠术后随着时间的延长,复合肌动作电位幅度、神经传导速度及潜伏期均有所改善,但PCL/HA-EXO组和自体神经组较PCL/HA组改善更为明显,术后4、8、12周三个时间点均显着高于PCL/HA组（P<0.05）。在术后第8周时,PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的神经传导速度及潜伏期均无显着性差异,而复合肌动作电位仍存在一些差异（P<0.05）。而术后12周时,三个指标则在PCL/HA-EXO组和自体神经移植组中无统计学差异（P>0.05）。PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数在术后三个时间点均显着高于PCL/HA组（P<0.05）,并且在术后第8,12周时PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数相似,无统计学差异（P>0.05）。术后12周PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的腓肠肌纤维直径分别为（68.4±6.2）μm和（72.3±7.6）μm,显着高于PCL/HA组（P<0.05）,而PCL/HA-EXO组和自体神经移植组则无统计学差异（P>0.05）。结论:（1）本研究成功分离提取了新生SD大鼠雪旺细胞,纯度高,满足后续实验要求。采用超速离心法加超滤法能够成功提取雪旺细胞分泌的外泌体,经鉴定是雪旺细胞分泌的外泌体,纯度较高。（2）透明质酸水凝胶能够有效的包裹和缓释雪旺细胞分泌的外泌体,其缓释曲线与体内雪旺细胞增殖迁移及神经轴突再生的时间相似,能够更好的在体内应用。雪旺细胞分泌的外泌体能够有效的促进雪旺细胞增殖,促进雪旺细胞和神经元特异性蛋白分泌,能够较好的促进神经再生。（3）PCL/HA-EXO神经导管能够有效的促进大鼠长节段神经缺损的运动功能康复及组织学及电生理学明显改善。
冯保会[8]（2018）在《复合雪旺细胞组织工程材料促进三叉神经髓鞘修复的实验研究》文中认为原发性三叉神经痛是一种常见的颅神经综合症。微血管减压术是外科治疗三叉神经痛的首选,其核心技术是将血管从神经压迫部位分离,然后用Teflon垫开。但是,Teflon仅仅起到物理隔离的作用,对髓鞘的修复并无作用。而且在复发三叉神经痛再次手术中发现,Teflon与神经、血管存在粘连,甚至有肉芽肿形成。研究证实,复合雪旺细胞的组织工程材料具有促进周围神经轴突再生和髓鞘形成的作用。组织工程材料是否具有促进三叉神经髓鞘修复的作用,如有作用其可能的机制是什么,这些正是本研究希望解决的问题。实验目的:制备复合雪旺细胞的组织工程材料,植入脱髓鞘三叉神经周围,明确组织工程材料促进三叉神经髓鞘修复的作用及机制,为三叉神经微血管减压术植入材料的选择提供新思路,进一步提高三叉神经痛的手术疗效。实验方法:利用三叉神经颅内段定量损伤制备大白兔三叉神经痛动物模型,通过行为学、电生理学及病理学鉴定动物模型。运用坐骨神经体外预变性培养及纯化雪旺细胞,镜下观察、免疫荧光鉴定雪旺细胞数量及纯度。制备复合雪旺细胞的Teflon、胶原/壳聚糖组织工程材料,观察雪旺细胞在材料中的存活及增殖情况。制备三叉神经痛动物模型,将复合雪旺细胞的组织工程材料植入脱髓鞘的三叉神经周围,检测材料植入后雪旺细胞的存活率。观察三叉神经髓鞘修复情况,明确复合雪旺细胞的组织工程材料促进髓鞘修复的作用。RT-PCR、Western blot检测GDNF、BDNF转录和表达情况,揭示髓鞘修复的机制。实验结果:通过三叉神经颅内段定量损伤成功制备了三叉神经痛动物模型,三叉神经有脱髓鞘改变,模型稳定、重复性好。利用坐骨神经体外预变性可获得大量高纯度的雪旺细胞。实验成功制备了复合雪旺细胞的Teflon、胶原/壳聚糖组织工程材料,雪旺细胞在材料上生长良好。将复合雪旺细胞的组织工程材料植入动物模型的三叉神经周围,术后7天、14天雪旺细胞存活良好。组织工程材料组大白兔三叉神经功能显着改善,三叉神经髓鞘修复较好。RT-PCR、Western blot结果显示GDNF、BDNF转录和表达水平较其它组显着增高。实验结论:复合雪旺细胞的Teflon、胶原/壳聚糖组织工程材料植入大白兔三叉神经周围,雪旺细胞存活良好,且具有促进髓鞘修复的作用,其作用机制可能与分泌的GDNF、BDNF有关。
游华建[9]（2016）在《蚕丝微通道人工神经修复大鼠坐骨神经缺损》文中研究表明周围神经缺损是修复重建外科的常见疾病。对于神经断裂的修复,可以直接进行手术缝合。对于较长距离的神经缺损的修复,则必须要在断端间用神经移植体进行“桥接”。目前,自体神经移植能够达到最佳的修复效果,但其供体神经来源有限,并会导致供区功能障碍,因而其临床应用受到很大限制;异体神经移植除了上述问题外还面临免疫排斥反应等问题,由此可见,通过自体和异体神经移植修复周围神经缺损,在临床应用上都受到不同程度的限制。所以,采用组织工程方法修复周围神经缺损是解决这一难题的出路。目前,人工神经一般具有两种基本形态,即,中空的成管状结构的神经导管（Nerve conduit）和内部具有填充物的神经支架（Nerve scaffold）,人们设计神经导管的初衷是为轴突再生提供一个相对封闭的微环境。使用神经支架的目的可能在于让填充物为轴突再生起到一定的引导作用。对于神经导管的结构,目前主要的学术观点认为,需要在神经导管管壁预设一些孔隙,以便于神经再生过程中的物质交换。与此同时,也有观点表明,这些孔隙会对轴突的再生起到负面影响。现有研究中,在神经支架中所使用的填充物,从形态的角度讲,大多是无序的。也有在神经支架内部预设微通道的研究报道,但是这些微通道的数量不超过30个,直径为70-300μm。这些微通道在数量和直径的设置方面具有一定的盲目性,因为,如果这些微通道是为坐骨神经的分支所准备的,那么其数量应该在3个左右,如果是为单根轴突生长预留的,那么微通道的数量应该不少于5000个,因为据本课题组观察,大鼠坐骨神经横断面的轴突数量在5000根左右。基于以上原因,在本研究中设计了2种神经导管,即管壁具有和不具有孔隙的导管。在本实验所采用的神经支架中,我们预设了不少于5000个的微通道。其主要目的在于探讨在神经导管管壁预设孔隙是否必要,以及数量众多的微通道是否对轴突的再生有益。蚕丝是本研究中所使用的主要材料,为此,本文还开展了蚕丝的结构和体内、外降解性质的研究。本文以大鼠坐骨神经10 mm缺损为动物模型,分别进行了5种神经移植方案,即,自体神经移植组（Autograft,对照）,微通道管壁有孔组（Microchannl+Silk）,微通道管壁无孔组（Microchannl+PLA+Silk）,内部不具有微通道结构外周为管壁具有微孔的神经导管组（Silk）和内部不具有微通道结构外周为管壁不具有微孔的神经导管组（PLA+Silk）。移植后,在系列时间点进行行为学检测,组织学观察。在神经移植后,行为学检测结果表明,温觉反应和静态坐骨神经指数（SSI）,微通道管壁无孔组的修复效果与自体神经移植相近,且显着优于其余3组。腓肠肌湿重分析显示,在神经移植后的前4周,各组实验侧腓肠肌均有不同程度的萎缩现象。其中,自体移植组的萎缩程度最轻微,微通道管壁无孔组的萎缩程度显着轻微于其余3组。在移植后第20周时发现,自体移植组腓肠肌湿重率为83.16%为本实验中腓肠肌湿重率恢复最好组,与自体移植组相比较,微通道无孔组优于微通道有孔组优于不含微通道无孔组优于不含微通道有孔组。免疫荧光观察显示,在神经移植后的第1、2、3、4周,在5个手术组中,在移植体部位,均观察到了大量的成纤维细胞和巨噬细胞。在神经移植后第20周,在各移植体中,自体神经移植体中含有的轴突和雪旺氏细胞数量最多,在其余四组中,上述2种细胞在移植体中的数量由多至少的顺序依次为,微通道无孔组、不含微通道无孔组、不含微通道有孔组和微通道有孔组。成纤维细胞在5种移植体中的数量,不含微通道有孔组多于不含微通道无孔组,其余3组中,未观察到成纤维细胞。蚕丝降解实验结果提示,蚕丝体外降解的实质是水解作用,酶的作用并不显着。蚕丝在体内的降解不是一个匀速的过程,其降解进程应该与细胞的动员有关。在本研究中所开展的大鼠坐骨神经移植实验结果提示,在神经导管管壁预设孔隙,对大鼠坐骨神经的10 mm缺失修复有负面作用。在人工神经内部预设微通道,对大鼠坐骨神经的10 mm缺失修复有积极意义。在4种人工神经种,内部具有微通道,管壁无微米级孔隙的人工神经的修复效果最好,有望较好的修复周围神经缺损,是一种潜在的适用于周围神经缺损修复的人工神经。
李煜[10]（2016）在《雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管修复大鼠受损喉返神经的实验研究》文中指出目的:本实验旨在探索一种改良的,能快速获取高纯度雪旺细胞培养的方法,并评价利用改良后方法培养的雪旺细胞联合神经干细胞及Laminin-chitosan-PLGA导管修复受损大鼠喉返神经的效果。方法:采用改良后的胶原酶和中性酶复合消化法消化3-5d的大鼠坐骨神经,以获取原代雪旺细胞。再将制备好的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合雪旺细胞和神经干细胞、结合显微外科缝合技术来修复5mm长大鼠喉返神经缺损。术后8周及12周分进行组织学和功能学等方面的检查,并与导管+雪旺细胞组、导管+神经干细胞组、单纯导管组、自体神经移植组、假手术组对比。结果:1.通过胶原酶和中性酶复合酶消化法可快速获取高纯度的雪旺细胞,传代培养至第二代后,细胞纯度在98%以上,此方法优于传统的雪旺细胞培养法;2.术后12周神经电生理以及神经营养因子的分泌方面共培养组的结果优于自体神经移植组,而在术后再生髓鞘数目方面,自体神经移植组效果更佳;共培养组与自体神经移植组再生髓鞘面积无明显差异。结论:将体外构建的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞移植到大鼠喉返神经损伤处,能够促进大鼠喉返神经的修复。第一章一种改良的大鼠雪旺细胞体外培养的实验研究目的:本实验旨在探索一种改良的雪旺细胞培养的方法,以获取大量、高纯度的雪旺细胞,并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定。方法:采用改良后的胶原酶和中性酶复合消化法消化3-5d的大鼠坐骨神经,以获取原代雪旺细胞,然后使用中性酶纯化传代,并与传统雪旺细胞培养方法进行比较,最后使用S-100对培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果:1.通过胶原酶和中性酶复合酶消化法可快速获取高纯度的雪旺细胞,传代培养至第二代后,细胞纯度在98%以上,此方法优于传统的雪旺细胞培养法;2.培养细胞的免疫荧光鉴定显示S-100特异性标志物染色呈阳性。结论:改良后的复合酶消化法可以获取高纯度的雪旺细胞,此方法优于传统的雪旺细胞培养法。第二章Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞修复大鼠受损喉返神经的实验研究目的:本实验旨在评价Laminin-chitosan-PLGA复合导管联合雪旺细胞及神经干细胞修复受损大鼠喉返神经的效果。方法:取150g雌性SD大鼠120只,随机分为6组,分别为:Laminin-chitosan-PLGA神经导管+雪旺细胞+神经干细胞组（共培养组）;Laminin-chitosan-PLGA神经导管+雪旺细胞组（雪旺细胞组）;Laminin-chitosan-PLGA神经导管+神经干细胞组（神经干细胞组）;单纯Laminin-chitosan-PLGA复合导管组（空导管组）;自体神经移植组;假手术组。利用制备的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合雪旺细胞和神经干细胞、结合显微外科缝合技术来修复5mm长大鼠喉返神经缺损。术后8周及12周分进行组织学和功能学等方面的检查。结果:术后12周时,CO组透射电镜下可观察到生长较好的髓鞘,其髓鞘厚度和直径大于AUTOGRAFT组,髓鞘的面积方面两者无明显统计学差异;甲苯胺蓝染色下进行髓鞘计数,AUTOGRAFT组数目较CO组更多,肌电图检测显示:CO组潜伏期及波幅的恢复均优于AUTOGRAFT组。Real-time q PCR:CO组喉肌和再生神经中BDNF和GDNF的表达都高于其他各组。喉镜下表现:12周时CO组基本恢复杓状软骨外展功能,声门基本闭合,与AUTOGRAFT组相似,且明显好于除SHAM组以外的其他各组。结论:体外构建复合Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞到大鼠喉返神经损伤处,能够促进大鼠喉返神经的修复。
二、碱性成纤维细胞生长因子促进周围神经侧枝生长的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、碱性成纤维细胞生长因子促进周围神经侧枝生长的实验研究（论文提纲范文）
（1）仿生导电人工神经支架的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多微通道导电神经支架的设计和制备及物理性能和生物相容性能检测评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 聚左旋乳酸取向性纤维膜及其生物相容性的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 仿生导电人工神经支架修复大鼠坐骨神经缺损的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象和主要试剂 |
| 1.3 实验分组和方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复的细胞和分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（2）三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 推拿治疗周围神经损伤的机理研究进展 |
| 1 推拿能够促进SNI大鼠损伤神经超微结构修复 |
| 2 推拿能够促进SNI大鼠运动功能的恢复 |
| 3 推拿能够促进SNI大鼠感觉功能的恢复 |
| 4 推拿对SNI大鼠干预的最佳刺激参数 |
| 参考文献 |
| 综述二 转化生长因子-β1对周围神经损伤后修复的研究进展 |
| 1 转化生长因子-β1蛋白概述 |
| 2 TGF-β1参与周围损伤后修复 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 三法三穴对SNI大鼠行为学及坐骨神经瘢痕和SC的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 三法三穴对SNI大鼠TGF-β1/Smad2通路蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 附件1 三法三穴干预后坐骨神经HE染色结果 |
| 附件2 坐骨神经S100在不同时间点的表达情况 |
| 附件3 三法三穴干预后坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN的表达情况 |
| 附件4 三法三穴干预后坐骨神经TGF-β1的表达情况 |
| 附件5 三法三穴干预后坐骨神经Smad2的表达情况 |
| 附件6 三法三穴干预前后坐骨神经TGF-β1的表达变化 |
| 附件7 三法三穴干预前后坐骨神经Smad2的表达变化 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）定向诱导去分化脂肪（d-DFAT）细胞对大鼠面神经缺损的修复作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 DFAT细胞和ASCs的分离、培养及鉴定 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 实验试剂 |
| 1.2.3 实验器械 |
| 1.2.4 相关试剂 |
| 1.2.5 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 DFAT细胞及ASCs的体外培养及传代 |
| 1.3.2 DFAT细胞及ASCs成骨、成脂诱导结果 |
| 1.3.3 DFAT细胞及ASCs图像流式鉴定结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 脂肪来源干细胞诱导成类雪旺样细胞 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验器械 |
| 2.2.3 相关试剂 |
| 2.2.4 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DFAT细胞及ASCs诱导过程中细胞形态变化 |
| 2.3.2 类雪旺样细胞(d-DFAT细胞、d-ASCs)的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3部分 脂肪组织来源种子细胞与生物凝胶复合神经导管修复大鼠面神经颊支缺损的研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验器械 |
| 3.2.4 相关试剂 |
| 3.2.5 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 实验动物情况 |
| 3.3.2 触须运动评估 |
| 3.3.3 神经电生理评估 |
| 3.3.4 甲苯胺蓝染色 |
| 3.3.5 NF-200+GFAP+β-TubulinⅢ染色 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4部分 构建3D定向诱导去分化脂肪(d-DFAT)细胞聚合体 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验器械 |
| 4.2.3 相关试剂 |
| 4.2.4 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 3D d-DFAT细胞聚合体形成情况 |
| 4.3.2 3D d-DFAT细胞聚合体的组织学评估 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）有序导电纳米纤维支架促进骨髓间充质干细胞向施万细胞分化及其在组织工程修复周围神经缺损的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 静电纺丝纳米纤维膜的制备及其表征和生物相容性研究 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂与仪器 |
| 1.1.2 主要试剂配方 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 实验方法和步骤 |
| 1.2.1 实验流程图 |
| 1.2.2 静电纺丝法制备纳米纤维膜 |
| 1.2.3 扫描电镜检测纤维膜形貌 |
| 1.2.4 电化学工作站检测纤维膜导电性 |
| 1.2.5 BMSCs分离培养及在纤维膜上的生长情况 |
| 1.2.6 活死细胞染色鉴定纤维膜的生物相容性 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 纳米纤维膜的表面形貌及导电性 |
| 1.3.2 纳米纤维膜的生物相容性研究 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 有序导电纳米纤维对施万细胞定向分化的影响 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂与仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配方 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 实验流程图 |
| 2.2.2 BMSCs分离提取 |
| 2.2.3 BMSCs向SCs诱导分化 |
| 2.2.4 免疫荧光染色检测SCs特异性蛋白标记物 |
| 2.2.5 Western Blot检测 |
| 2.2.6 iBMSCs与DRG共培养 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BMSCs的形态 |
| 2.3.2 静电纺丝纳米纤维上BMSCs诱导分化成为SCs |
| 2.3.3 iBMSCs表达SCs特异性标记蛋白 |
| 2.3.4 转分化细胞促进共培养DRGs的神经突生长 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 含有序导电纳米纤维的神经导管修复周围神经缺损的实验研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂与仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配方 |
| 3.2 实验方法和步骤 |
| 3.2.1 实验流程图 |
| 3.2.2 iBMSCs联合含导电纳米纤维的人工神经导管治疗周围神经缺损 |
| 3.2.3 神经电生理检测 |
| 3.2.4 免疫荧光染色检测再生轴突和髓鞘 |
| 3.2.5 腓肠肌萎缩情况检测 |
| 3.2.6 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 含定向导电纳米纤维的NGC促进神经再生 |
| 3.3.2 含导电纳米纤维膜的NGCs促进损伤神经远端靶器官恢复 |
| 3.3.3 导电纳米纤维膜能够促进周围神经损伤后的功能恢复 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（5）新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 新型组织工程神经制作与大鼠坐骨神经长段缺损损伤模型的建立 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 组织工程神经对坐骨神经缺损损伤后巨噬细胞极化及炎性细胞的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 组织工程神经修复坐骨神经缺损过程中对炎性细胞因子的调节作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 组织工程神经对坐骨神经长段缺损的结构和功能修复作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞极化在神经系统损伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（6）低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LIPUS激励iPS-NSCs最佳物理参数的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验器械 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
| 1.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
| 1.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
| 1.1.6 CCK-8 检测iPS-NSCs增殖活性 |
| 1.1.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 成功搭建低强度脉冲超声激励系统 |
| 1.2.2 iPS-NSCs细胞的形态学观察及细胞鉴定 |
| 1.2.3 LIPUS对 iPS-NSCs增殖活性的影响以及最佳激励条件的确定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LIPUS在生物组织中的理学效应及其在骨科学中的应用 |
| 1.3.2 神经干细胞在神经系统中的起源、特点和作用 |
| 1.3.3 诱导神经干细胞的来源及诱导体系 |
| 1.3.4 LIPUS对细胞增殖的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、在最佳生物学参数下,LIPUS优化iPS-NSCs细胞特性的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验器械 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
| 2.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
| 2.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
| 2.1.6 TUNEL检测iPS-NSCs细胞凋亡的情况 |
| 2.1.7 ELISA检测iPS-NSCs细胞上清液中神经营养因子的含量 |
| 2.1.8 Western Blot检测Notch信号通路及细胞分化情况 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞凋亡率的变化 |
| 2.2.2 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞中NTFs含量的变化 |
| 2.2.3 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞分化的情况 |
| 2.2.4 LIPUS激励iPS-NSCs后 Notch信号通路相关蛋白含量的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 LIPUS对 iPS-NSCs细胞生物特性的影响 |
| 2.3.2 LIPUS激励iPS-NSCs可能的作用机制 |
| 2.3.3 LIPUS修复神经损伤的潜力 |
| 2.4 小结 |
| 三、LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验器械 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 脊髓损伤动物模型建立 |
| 3.1.4 细胞移植 |
| 3.1.5 BBB运动功能评分 |
| 3.1.6 脊髓标本取出及制作切片 |
| 3.1.7 石蜡切片的制备 |
| 3.1.8 HE染色 |
| 3.1.9 免疫荧光观察移植细胞在体内分化情况 |
| 3.1.10 ELISA检测测定脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 3.1.11 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HE染色结果 |
| 3.2.2 GFAP、NF200 免疫荧光染色结果 |
| 3.2.3 脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 3.2.4 BBB评分结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 脊髓损伤动物模型的制备及运动功能评价指标的选择 |
| 3.3.2 NSCs在脊髓损伤修复中的作用及应用 |
| 3.3.3 多潜能干细胞在神经损伤等再生医学方面的应用 |
| 3.3.4 LIPUS介导的iPSc-NSCs修复脊髓损伤可能的作用机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 低强度脉冲超声在神经修复中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、外泌体的分离与鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要材料与试剂 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂配置方法 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的形态 |
| 1.2.2 雪旺细胞在体外的贴壁和增殖活性 |
| 1.2.3 雪旺细胞体外培养纯度鉴定 |
| 1.2.4 雪旺细胞分泌的外泌体的形态和粒径鉴定 |
| 1.2.5 雪旺细胞分泌的外泌体表面标志物的鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、外泌体的体外生物学功能及体外缓释研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂配置方法 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体及体外缓释曲线 |
| 2.2.2 雪旺细胞外泌体促进DRG组织轴突生长 |
| 2.2.3 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞生物活性物质表达的影响 |
| 2.2.5 雪旺细胞外泌体对DRG神经元的生物活性物质表达影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、雪旺细胞外泌体促进大鼠长节段坐骨神经缺损修复 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料和试剂 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 实验动物及分组 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 扫描电镜观察电纺PCL导管大体及微细结构 |
| 3.2.2 静电纺丝PCL神经导管的力学参数和孔隙率 |
| 3.2.3 雪旺细胞外泌体促进神经轴突再生 |
| 3.2.4 NF-200和S100 对各组再生神经的免疫荧光染色 |
| 3.2.5 三组大鼠坐骨神经电生理参数比较 |
| 3.2.6 三组大鼠坐骨神经指数比较 |
| 3.2.7 三组大鼠荧光金逆行示踪 |
| 3.2.8 三组大鼠腓肠肌HE染色分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 外周神经损伤修复的材料与治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）复合雪旺细胞组织工程材料促进三叉神经髓鞘修复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 1.三叉神经痛的病因和发病机制 |
| 2.三叉神经痛的治疗现状 |
| 3.微血管减压术所面临的问题 |
| 4.组织工程技术的发展及复合雪旺细胞的组织工程材料促进三叉神经髓鞘修复的可行性 |
| 5.小结 |
| 第一部分 大白兔三叉神经痛动物模型的建立 |
| 1.引言 |
| 2.实验动物、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 坐骨神经体外预变性分离培养雪旺细胞的实验研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验动物、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 聚四氟乙烯、胶原/壳聚糖复合材料的制备及与雪旺细胞相容性研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验动物、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 复合雪旺细胞的组织工程材料促进大白兔三叉神经后根髓鞘修复的作用与机制 |
| 1.引言 |
| 2.实验动物、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间参与科研课题、发表论文及相关学术成果 |
（9）蚕丝微通道人工神经修复大鼠坐骨神经缺损（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 周围神经系统的结构和组成 |
| 1.2 周围神经损伤的原因和类型及损伤后的表现 |
| 1.3 周围神经的微环境和相关细胞的作用 |
| 1.3.1 雪旺氏细胞 |
| 1.3.2 成纤维细胞 |
| 1.3.3 巨噬细胞 |
| 1.4 周围神经损伤的修复 |
| 1.4.1 直接缝合修复 |
| 1.4.2 自体神经或异体神经移植 |
| 1.4.3 人工神经对于周围神经缺损的修复 |
| 1.5 蚕丝在组织工程中的应用 |
| 1.6 微通道在周围神经修复中的应用 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 拟解决的关键科学问题 |
| 2.4 本研究的创新点 |
| 3 蚕丝的结构和降解 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 天然蚕丝的形态与结构 |
| 3.2.2 蚕丝的体外降解 |
| 3.2.3 蚕丝的体内降解 |
| 3.3 小结 |
| 4 神经导管的制备与神经移植手术 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验用品及器械 |
| 4.1.3 方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 小结 |
| 5 行为学检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 感觉功能检测 |
| 5.1.3 运动功能检测 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.3 小结 |
| 6 形态学观察 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验用品及仪器 |
| 6.1.2 腓肠肌湿重的测定 |
| 6.1.3 石蜡切片，H?E染色观察 |
| 6.1.4 冰冻切片免疫荧光染色观察 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.3 小结 |
| 7 结论 |
| 8 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间的科研活动与成果 |
（10）雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管修复大鼠受损喉返神经的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 摘要 1 |
| Abstract 1 |
| 摘要 2 |
| Abstract 2 |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 一种改良的大鼠雪旺细胞体外培养的实验研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料和仪器设备 |
| 1.2.1.1 主要试剂 |
| 1.2.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 雪旺细胞培养及传代方法 |
| 1.2.2.3 雪旺细胞的计数 |
| 1.2.2.4 雪旺细胞的鉴定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 Laminin-chitosan-PLGA复合神经导管联合雪旺细胞及神经干细胞修复大鼠受损喉返神经的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂及主要实验设备 |
| 2.2.1.1 实验动物 |
| 2.2.1.2 实验试剂 |
| 2.2.1.3 实验仪器及器械 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 Laminin-chitosan-PLGA导管的制备 |
| 2.2.2.2 神经干细胞和雪旺细胞的体外培养 |
| 2.2.2.3 建模分组 |
| 2.2.2.4 喉返神经损伤模型的制备 |
| 2.2.2.5 各组动物的处理方法 |
| 2.2.2.6 检测方法 |
| 2.2.4 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录一 致谢 |
| 附录二 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
四、碱性成纤维细胞生长因子促进周围神经侧枝生长的实验研究（论文参考文献）
- [1]仿生导电人工神经支架的研究[D]. 刘振辉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [2]三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响[D]. 邵帅. 北京中医药大学, 2020(04)
- [3]定向诱导去分化脂肪（d-DFAT）细胞对大鼠面神经缺损的修复作用[D]. 唐安群. 南昌大学, 2020(08)
- [4]有序导电纳米纤维支架促进骨髓间充质干细胞向施万细胞分化及其在组织工程修复周围神经缺损的应用[D]. 胡晓芳. 南方医科大学, 2020
- [5]新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用[D]. 李越. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [6]低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究[D]. 吴秋丽. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究[D]. 王宇强. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]复合雪旺细胞组织工程材料促进三叉神经髓鞘修复的实验研究[D]. 冯保会. 上海交通大学, 2018(01)
- [9]蚕丝微通道人工神经修复大鼠坐骨神经缺损[D]. 游华建. 西南大学, 2016(02)
- [10]雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管修复大鼠受损喉返神经的实验研究[D]. 李煜. 上海交通大学, 2016(03)
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