一、慢性压力超负荷对兔左心室结构及功能的影响（论文文献综述）
介希[1]（2021）在《氧化应激介导心力衰竭时病理性心肌细胞自噬的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:在生理情况下,心肌细胞自噬在维持正常心肌结构和功能起着重要作用。在饥饿和心肌缺血等应激状态下,心肌细胞自噬增加起保护作用。然而,在心肌缺血-再灌注时,心肌细胞自噬增加起恶化作用。自噬功能异常介导心肌肥厚和心力衰竭的发生和发展。前期研究发现氧化应激介导自噬功能异常导致心肌肥厚。然而,氧化应激是否介导压力超负荷诱导心力衰竭时心肌细胞自噬和心肌重构尚未阐明。本研究利用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）探究是否氧化应激介导压力超负荷诱导心力衰竭时病理性心肌细胞自噬及其机制。方法:1、动物模型:雄性Sprague–Dawley大鼠（7-8周龄,体重180–200g）随机行腹主动脉缩窄（Abdominal aortic constriction,AAC）或假手术,术后给予抗氧化剂NAC（500mg/kg/day,腹腔注射）或生理盐水（安慰剂）干预治疗连续4周,每日1次。2、实验分组:大鼠随机分为4组,每组8只:（1）假手术+安慰剂组（sham placebo）、（2）假手术+NAC（sham NAC）、（3）AAC+安慰剂组（AAC placebo）、（4）AAC+NAC（AAC NAC）组。3、实验方法:超声心动图检测评价心脏结构和功能;经导管检测血压;实验末处死动物,取心脏、肝脏、肺脏称重;免疫组化测定氧化应激指标8-OHd G;免疫组织化学和免疫蛋白印迹法检测心肌组织自噬相关蛋白LC3 II,Beclin-1的表达,利用RT-PCR方法检测Atg4b、Atg5的mRNA表达水平。苏木精-伊红染色测定心肌细胞大小,Masson三色染色法检测心肌纤维化。结果:大鼠AAC术后4周,与假手术组对比,AAC palcebo组,室壁明显增厚,左室缩短分数（LV FS）降低,平均动脉血压（MAP）增加。与AAC palcebo组相比,AAC+NAC组的室壁厚度,LVFS和MAP均得到了改善,表明NAC减轻了慢性压力负荷诱导的心肌肥厚和心功能不全。与假手术组对比,AAC palcebo组,心脏重量,左室重量,肺重量增加,NAC干预明显减轻这些变化。AAC palcebo组,心肌细胞大小和心肌纤维化程度明显增加,NAC干预治疗可减轻心肌细胞肥大和心肌纤维化。较假手术组,AAC placebo组,心肌氧化应激指标8-OHd G表达增加,AAC+NAC组结果提示氧化应激降低。免疫蛋白印迹和免疫组化检测自噬指标LC3 II和Beclin1,与假手术组相比,AAC placebo组显着增加,而NAC干预可显着减轻这些指标的变化。此外,RT-PCR发现AAC placebo组,心肌Atg4b和Atg5基因表达水平明显增多,NAC干预治疗可减轻AAC所致Atg4b和Atg5基因表达的增加。结论:抗氧化剂NAC减轻慢性压力负荷诱导的心肌重构和心功能不全,抑制氧化应激,减少心肌细胞自噬。这些结果提示氧化应激介导心力衰竭时病理性心肌细胞自噬,进而促进心功能不全。应用抗氧化剂抑制病理性自噬的策略可能有益于改善慢性心衰时左室重构和心功能。
陈栩科[2]（2021）在《不同程度的压力超负荷对新生小鼠心脏结构和功能的影响》文中研究指明【研究背景和目的】慢性心力衰竭是由不同病因引起的器质性心血管病的临床综合症,其发生发展过程与压力超负荷引起的心肌肥大、纤维化密切相关。心脏再生能修复受损的心肌组织,被认为是极具前景的心力衰竭治疗方法。很多年前已经有研究报道新生小鼠心尖切除和心肌梗死后可以引起心脏再生。但是,很少提及新生小鼠对压力超负荷的反应。在这项研究中,我们研究了新生小鼠在不同程度压力超负荷的条件下心功能和心肌的反应,这为心脏再生和压力超负荷提供了一个新的研究方向。【实验方法】1.通过使用不同规格的针进行横向主动脉弓缩窄术（TAC）构建新生小鼠不同程度的压力超负荷模型,并追踪术后小鼠生长速度及死亡率的变化。2.超声心动图用于检测射血分数、缩短分数、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径,评估手术后小鼠心功能及心脏结构的变化。3.免疫荧光技术用于检测pH3、Ki67、CD31的表达情况、Brdu的结合情况,评估心肌细胞增殖和血管新生程度。4.WGA、TUNEL、Masson染色用于评估心肌肥大、凋亡和纤维化情况。5.透射电子显微镜用于观察心肌纤维和线粒体的结构变化情况。6.RT-qPCR用于检测心脏组织中纤维化相关m RNA Timp1、Fn1、MMP9、COL1A1,心肌肥大相关m RNA Myh7、BNP、Acta1、Fhl1及管家基因β-actin的表达。7.Western blotting用于检测心脏组织中细胞外基质成分COL1A1、COL3、MMP9,纤维化信号转导通路TGF-β、Smad3、p-Smad3和管家基因β-tubulin的表达。【实验结果】1.随着压力超负荷程度的增加,小鼠的生长速度随之减缓。轻度的压力超负荷不增加死亡率,而中度的压力超负荷明显增加死亡率,重度的压力超负荷在术后早期导致新生小鼠大量死亡。2.轻度的压力超负荷对心功能无明显影响,而中度的压力超负荷明显损害心功能。3.轻度的压力超负荷可以刺激心肌细胞增殖和促进血管新生,而中度的压力超负荷则产生抑制作用。4.轻度的压力超负荷诱导的是适应性肥大,而中度的压力超负荷诱导的是病理性肥大。5.中度的压力超负荷损害肌节和线粒体的结构。6.中度的压力超负荷激活TGF-β/Smad3信号通路,进而引起心脏纤维化的发生。【结论】适度的压力超负荷可以有效刺激心肌细胞增殖并且使心功能维持在正常水平。
王栩越[3]（2021）在《靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究》文中提出目的:靶向干预NF-κB-p65对压力超负荷所致心功能不全大鼠心肌重塑的作用。方法:（1）细胞实验:选用血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导H9C2细胞损伤模型。MTT实验检测细胞活性,筛选最优给药浓度。细胞六孔板中常规培养,生长至六孔板面积的80%弃去原有培养基将细胞分为（1）Control组:常规高糖培养基培养;（2）AngⅡ组:AngⅡ（1μmol/L）作用24h;（3）AngⅡ+PDTC组:PDTC（100μmol/L）预处理1h后PBS清洗3次,AngⅡ（1μmol/L）作用24h;（4）PDTC组:PDTC（100μmol/L）处理1h后PBS清洗3次,常规培养24h。收集细胞,分别选用流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测各组凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、心肌细胞损伤相关蛋白心房钠尿肽（ANP）和细胞核内P65的表达。（2）动物实验,选取6周龄血压相对稳定的SD大鼠以每组10只随机分为4组（1）Sham组:大鼠开腹后直接关闭腹腔;（2）AAC组:通过腹主动脉缩窄术（abdominal aortic coarctation,AAC）复制大鼠压力超负荷性心肌损伤模型;（3）AAC+e GFP组:腹主动脉缩窄术后3天尾静脉注射空载9型腺相关病毒;（4）AAC+e GFP-p65组:腹主动脉缩窄术后3天尾静脉注射沉默p65的腺相关病毒。8周后,测定体重、血压,处死动物,测量左心指数,留取心脏和血液标本;q RT-PCR检测感染病毒后各组m RNA水平p65的表达;免疫组织化学检测心肌组织总P65的表达;Western blot检测病毒荧光标记蛋白GFP、细胞核内P65、Cleaved caspase-3表达水平;Masson染色、HE染色、TUNEL染色检测心肌病理改变;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的含量。结果:（1）细胞实验:Western blot结果显示:与Control组比,AngⅡ组细胞核内P65表达增高、ANP表达增高、Bcl-2表达降低、Bax表达增高（P<0.05）;与AngⅡ组比,AngⅡ+PDTC组细胞核内P65表达降低、ANP表达减低,Bcl-2表达增高,Bax表达降低（P<0.05）;与Control组比,PDTC组细胞核内P65表达降低（P<0.05）,其它蛋白水平均无明显变化（P>0.05）。流式细胞术检测结果显示:与Control组比,AngⅡ组细胞凋亡数量百分比增高（P<0.05）;与AngⅡ组比,AngⅡ+PDTC组细胞凋亡数量百分比减低（P<0.05）;与Control组比,PDTC组细胞凋亡数量百分比无明显变化（P>0.05）。（2）动物实验:q RT-PCR检测结果显示:与Sham组比,AAC+e GFP-p65组大鼠p65减低（P<0.05）,而AAC组和AAC+e GFP组大鼠p65无明显变化（P>0.05）。血流动力学和心脏质量检测结果显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠收缩压（SBP）、舒张压（DBP）上升（P<0.05）,左室压力最大上升速率（+dp/dtmax）、左室压力最大下降速率（-dp/dtmax）降低（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP-p65组SBP、DBP无差异（P>0.05）,左室+dp/dtmax、-dp/dtmax增高（P<0.05）。病理组织学检测显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠HE染色显示细胞横截面积变大、TUNEL染色显示心肌凋亡百分比增高（P<0.05）、Masson染色检测心肌旁胶原纤维增多（P<0.05）、免疫组织化学检测P65含量无明显变化（P>0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠各项病理组织学检测均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠HE染色显示细胞横截面积减小、TUNEL染色显示心肌凋亡百分比减低（P<0.05）、Masson染色检测心肌旁胶原纤维减少（P<0.05）。Western blot结果显示:与Sham组比,AAC+e GFP组和AAC+e GFP-p65组GFP表达量明显增高（P<0.05）。与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠细胞核内P65表达增高、Cleaved-caspase-3表达增高（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠以上两种蛋白表达均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠细胞核内P65表达降低、Cleaved-caspase-3表达降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量升高（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠血清中TNF-α含量降低（P<0.05）,但IL-6含量无差异（P>0.05）。结论:靶向干预NF-κB-p65减轻压力超负荷所致心功能不全大鼠心肌重塑。
祁磊[4]（2020）在《CYLD通过抑制心肌细胞自噬溶酶体外排加剧压力超负荷诱导的心肌病》文中研究表明研究背景:泛素蛋白酶体系统（UPS）的组成包含泛素激活酶（Els）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）、蛋白酶体（Proteosome）和去泛素化酶（DUBs）。自20世纪70年代早期发现泛素以来,研究表明UPS实际上参与了细胞生物学的所有方面。蛋白泛素化为可逆的翻译后修饰,在此过程中,E1、E2和E3按顺序发挥作用,将泛素（Ub）通过本身末端的甘氨酸残基（G76）通过共价键连接到底物蛋白的赖氨酸残基（K）上。单个泛素分子连接称为单泛素化。多个赖氨酸残基同时连接单个泛素分子称为多单泛素化或多泛素化。泛素分子自身有7个赖氨酸残基（K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63）,可以通过迭代反应形成不同类型的泛素链,称为多聚泛素化。一般情况下,K48连接的多聚泛素化常意味着被修饰底物将由蛋白酶体降解,而单泛素化和K63连接的多聚泛素化作为建立蛋白质-蛋白质相互作用和调节细胞功能的信号装置。DUBs执行泛素连接的水解过程。在人类中迄今发现了八种E1s、十几种不同类型的E2s、几百种E3s和约一百种有功能的DUBs。在过去的几十年中,UPS中其他组分在心脏内环境稳态和功能紊乱中作用已得到深入研究,而DUBs在心肌中的功能并未阐明。已有研究证明A20（也称为TNFAIP3）是心脏失代偿性重构和功能紊乱的负调控因子,但是泛素特异性蛋白酶（USP）15在心肌病中发挥介导作用。圆柱瘤蛋白（Cylindromatosis,CYLD）对K63连接的多聚泛素化具有高度特异的去泛素酶活性,并且能抑制NF-κB、MAPK和TGFβ信号通路,然而本课题组之前的研究表明CYLD可通过与NF-κB信号通路无关的机制对压力超负荷诱导的心肌病发挥重要的介导作用。这些发现强调了在心脏中不同DUBs的功能特异性,支持了 DUBs与底物接头蛋白、脚手架蛋白和抑制因子结合所形成的调节性相互作用引发其特异性的观点。尽管如此,各个DUBs在心脏内环境稳态和疾病中的重要功能尚不明确。自噬将细胞质组分,例如细胞器、蛋白聚集体或特定的单个蛋白运送至溶酶体进行降解,此分解代谢活动在不同物种间进化保守。完整的自噬是高度动态的过程,具有双层膜的自噬小体形成后,包裹目标待降解物质,随后自噬小体和溶酶体融合,形成自噬溶酶体,继而发生自噬溶酶体降解（自噬溶酶体外排）。自噬在心脏中的作用仍有争议。根据应激的性质和检测时机的不同,在心脏中激活自噬有时是保护性的,有时是损伤性的。最近的研究已经表明,在压力超负荷的心脏中自噬的激活很有可能是适应性反应。然而,目前仍缺少在压力超负荷的成体心脏中自噬介导心脏保护作用的确凿证据。近来研究表明,自噬底物和蛋白组分的泛素化修饰在自噬引发到终止的多个阶段发挥作用,成为自噬的中心调控机制。因此,可以预想DUBs对自噬具有调节作用。泛素标签如何通过改变蛋白信号和指引调节性蛋白降解来调控自噬尚未阐明。另外,在控制自噬时,将K63或K48连接的多聚泛素链加到自噬蛋白组分上的E3s和具有相反作用的DUBs之间的交互对话也没有研究清楚。目前,DUBs在心脏中调节自噬的病理生理相关性尚无报道。我们的研究证明,CYLD在心肌细胞自噬溶酶体外排阶段抑制自噬,因而加剧压力超负荷引起的心脏病理性重构和功能紊乱。这些结果揭示了 CYLD作为应激心脏中自噬抑制因子的新作用,第一次为DUBs介导的自噬调节和心肌病的直接关联提供了证据。研究目的:1、研究心肌特异性过表达CYLD在压力负荷引起的心脏重构和功能紊乱中的作用;2、研究心肌特异性过表达CYLD在压力负荷心脏中对泛素化蛋白积累和自噬功能的影响;3、确定在压力超负荷的心脏中激活自噬对心脏具有保护作用;4、探讨在压力超负荷背景下CYLD调节自噬,进而影响心脏重构和功能的具体机制。研究方法:1、对心肌特异性过表达CYLD转基因小鼠、心肌特异性过表达ATG7转基因小鼠、心肌特异性CYLD和ATG7双重过表达转基因小鼠、CYLD敲除小鼠和野生型对照组小鼠实施主动脉弓缩窄术（TAC）,建立压力超负荷动物模型,分析术后存活率,通过超声心动图检测心功能,通过病理学检测,包括EBD染色、qPCR、WGA染色、Masson染色和TUNEL法评价心脏重构状况;2、通过Western blot检测心肌特异性过表达CYLD转基因小鼠和野生型对照组小鼠TAC术后心脏中泛素化蛋白积累、自噬流、自噬过程相关的蛋白表达水平;使用透射电子显微镜观察心脏中的自噬性小泡;3、在体外通过Western blot检测对照组细胞和CYLD敲除细胞中的自噬流,通过瞬时转染mCherry-GFP LC3报告质粒和带HA-Flag标签的Cyld质粒分析CYLD在细胞自噬流和自噬溶酶体外排中的作用。4、在体外运用碘化丙啶染色和乳酸脱氢酶活性测定检测CYLD敲除和过表达对细胞死亡的影响。研究结果:1、心肌特异性过表达CYLD加剧压力超负荷引起的心肌病;2、心肌特异性过表达CYLD加剧心脏中K48连接的泛素化蛋白的积累,恶化压力超负荷引起的自噬功能不全;3、通过心肌特异性过表达ATG7激活自噬保护心脏,抵抗压力超负荷引起的心肌病;4、在压力超负荷背景下,上调心肌CYLD的表达将ATG7依赖的心脏保护作用转变为ATG7介导的心肌病;5、心肌细胞中CYLD在自噬溶酶体外排阶段抑制自噬;6、CYLD抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）的再激活、上调大鼠脑组织Ras基因蛋白7（Rab7）,加剧压力超负荷心脏中心肌细胞的死亡。研究结论:1、CYLD在心肌细胞中抑制自噬溶酶体外排,是心脏病理性重构和功能紊乱的新型介导因子。2、在机制方面,CYLD有可能通过削弱心肌细胞中mTORC1的再激活、阻断Rab7从自噬溶酶体释放,抑制自噬溶酶体外排。
曾庆炜[5]（2020）在《碘化N-正丁基氟哌啶醇通过ROS/JNK/Brf1通路拮抗压力超负荷小鼠病理性心肌肥厚》文中认为病理性心肌肥厚早期是心肌组织适应心脏负荷增加出现的一种代偿性反应,但长此以往,可导致心衰、心律失常、心肌缺血甚至猝死等风险,是心血管疾病发生的独立危险因素之一。目前认为ROS引起的氧化应激及线粒体功能不足在病理性心肌肥厚发生发展中扮演着重要角色,临床上,钙通道阻滞剂是治疗病理性心肌肥厚的经典药物之一。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butylhaloperidol iodide,F2）是我课题组合成的一种新型钙通道阻滞剂。以往研究表明,F2可通过阻断L-型Ca2+通道保护缺血再灌注心肌;进一步研究发现F2也可通过抑制ROS/JNK信号通路并由此阻抑线粒体氧化应激来改善心肌细胞和心脏微血管内皮细胞的缺氧复氧损伤。鉴于F2对心肌细胞内钙、对ROS及线粒体的作用,我们推测F2可能像其它钙通道阻滞剂甚至优于经典的钙通道阻滞剂,具有良好拮抗病理性心肌肥厚的新作用。我们近期在离体细胞模型上证明了 F2可通过ROS/JNK/Brf1信号通路拮抗病理性心肌肥厚,但F2对更接近病理状态的心肌肥厚整体模型作用如何,尤其是对肥厚心脏组织结构和功能有何作用,都不清楚。因此,本研究借助横向主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction,TAC）手术引起小鼠病理性心肌肥厚模型,探讨F2能否改善TAC小鼠心脏形态结构异常,保护其心功能,在此基础上,研究F2的保护作用是否与其对ROS/JNK/Brf1信号通路的调节作用和保护线粒体的作用有关。方法:1.通过TAC手术建立小鼠病理性心肌肥厚模型:小鼠麻醉开胸后于头臂干和左颈总动脉起源之间结扎升主动脉。术后小鼠继续正常饲养4周即完成模型制作。2.以维拉帕米（Verapamil,Ver）为阳性对照药,实验分组如下:（1）sham组;（2）TAC组;（3）TAC+溶剂DMSO组;（4）TAC+0.125 mg/kg Ver组;（5）TAC+0.031 mg/kg F2组;（6）TAC+0.062 mg/kg F2 组;（7）TAC+0.125 mg/kg F2 组;（8）TAC+0.25 mg/kg F2组;（9）TAC+0.50 mg/kg F2组。3.小鼠给药方式及时间:F2和Ver以尾静脉注射给药的方式于术后1周开始给药直至第4周,共给药3周。4.小鼠心脏重量指标的变化,包括心脏重量/体重（HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（HW/TL）。5.小动物超声仪测评小鼠心功能变化:包括射血分数（ejection fraction,EF）,短轴缩短率（short axis shortening rate,FS）,左心室收缩末期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness at end-systole,LVAWs）,左心室舒张末期前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness at end-diastole,LVAWd）,左心室收缩末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at end-systole,LVPWs）,左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at end-diastole,LVPWd）,左心室收缩末期容积（left ventricular volume at end-systole,LVESV）,左心室舒张末期容积（left ventricular volume at end-diastole,LVEDV）,左心室收缩末期内径（left ventricular inner diameter at end-systole,LVIDs）和左心室舒张末期内径（left ventricular inner diameter at end-diastole,LVIDd）。6.Western Blot法检测小鼠心肌组织内磷酸化JNK（p-JNK）、总JNK、Brf1、肥厚因子（atrial natriuretic peptide,ANP）以及线粒体合成、功能调节因子PGC-1α蛋白的表达。7.制作心肌组织石蜡切片,通过HE染色观察心脏横截面大小,Masson染色检测心肌组织内胶原纤维表达情况。8.制作心肌组织冰冻切片,通过DHE染色检测心肌组织内ROS水平。9.透射电子显微镜观察心肌组织超微结构:包括线粒体的形态和结构以及胶原纤维的增生情况。结果:1.与sham组比较,TAC组小鼠ANP蛋白水平明显升高。五个剂量F2能不同程度地抑制TAC所致ANP蛋白水平升高,且随着F2剂量的增加,对ANP表达的抑制效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组ANP抑制作用最明显,且与同剂量Ver组比较,ANP蛋白水平差异无统计学意义。2.与sham组比较,TAC组小鼠心脏重量指标（HW/BW和HW/TL）明显升高。五个剂量F2能不同程度地抑制TAC所致小鼠心脏重量的增加,且随着F2剂量的增加,对小鼠心脏重量的抑制效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组心脏重量抑制作用最明显,且与同剂量Ver组比较,小鼠心脏重量指标差异无统计学意义。3.与sham组比较,TAC组小鼠心肌组织形态结构发生明显变化,包括心脏体积、心脏横截面均明显增大,胶原纤维显着增生。五个剂量F2能不同程度地改善TAC所致小鼠心脏体积、心脏横截面的增大,其中中剂量0.125 mg/kg F2组改善作用最明显;五个剂量F2也能不同程度地改善TAC所致小鼠心脏胶原纤维的增生,且随着F2剂量的增加,对胶原纤维增生的抑制效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组抑制作用最明显,且与同剂量Ver组比较,小鼠胶原纤维增生水平差异无统计学意义。同时,透射电子显微镜可以明显观察到,与sham组比较,TAC组大量排列紊乱的胶原纤维堆积在细胞之间。而给予剂量均为0.125 mg/kg F2组和Ver组时,TAC组所诱导的胶原纤维增生能被明显改善。4.与sham组比较,TAC组小鼠EF和FS均明显下降,而LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、LVESV和LVEDV却明显上升。五个剂量F2能不同程度地改善TAC所致小鼠心脏功能障碍,且随着F2剂量的增加,对EF和FS的促进效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组促进作用最明显,且与同剂量Ver组比较,小鼠EF和FS水平差异无统计学意义;对LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、LVESV和LVEDV的抑制效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组抑制作用最明显,且与同剂量Ver组比较,小鼠上述因子水平无统计学意义。5.与sham组比较,TAC组小鼠ROS生成增多、JNK异常激活和Brf1蛋白水平高表达。五个剂量F2能不同程度地抑制TAC所致上述因子的异常,且随着F2剂量的增加,对上述因子的抑制效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组抑制作用最明显,且与同剂量Ver组比较,上述因子水平差异无统计学意义。6.与sham组比较,TAC组小鼠心肌组织内PGC-1α蛋白水平表达明显降低。五个剂量F2能不同程度地促进TAC小鼠PGC-1α蛋白表达,且随着F2剂量的增加,对PGC-1α表达的促进效应呈现先逐渐增强再逐渐减弱的趋势,其中中剂量0.125 mg/kg F2组PGC-1α促进作用最明显,且与同剂量Ver组比较,PGC-1α蛋白水平差异无统计学意义。同时,透射电子显微镜可以明显观察到,与sham组比较,TAC组线粒体肿胀、空泡样变,嵴扭曲变形和断裂。而给予剂量均为0.125 mg/kg F2组和Ver组时,TAC组所致的线粒体结构异常能被明显改善。结论:1.F2具有拮抗TAC引起的病理性心肌肥厚作用,其药理作用呈现倒“U”型量效曲线,最佳效果的剂量组与同等剂量的Ver组药理效应相当。2.F2具有下调ROS/JNK/Brf1信号通路及保护线粒体的作用,这可能是其阻抑病理性心肌肥厚的重要机制。
郑荣华[6]（2020）在《胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究》文中提出动物实验和临床观察结果证实,各种药理学手段干预抑制心脏肥大和纤维化,可以延缓心脏功能的恶化。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽产物,通过与其血管紧张素II 1型受体（AT1R）的结合,对心血管系统的变化、起着重要的病理生理调节作用。尽管AngII转换酶抑制剂或受体阻断剂,已常规用于临床并取得了良好的治疗效果,但病人观察的结果表明,此类药物的使用可产生一系列的副作用。因此,寻求通过调节AngⅡ系统的变化,进而减少心脏重塑并促进心脏功能恢复的辅助疗法,仍值得进一步研究。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种肠降血糖激素,体内半衰期较短,使用外源性GLP-1协同剂利拉鲁肽已广泛用于糖尿病人的治疗。近年来的研究结果表明,不依赖降血糖调节机制的利拉鲁肽疗法,也可用于高血压,心肌梗塞,心肌病和其它多种心血管疾病的治疗。但有关GLP-1疗法对压力性负荷所致心力衰竭的疗效和作用机理,尚缺少足够的系统性评价和探索。因此,本研究选择了大鼠腹主动脉缩窄在体心脏模型,观察了利拉鲁肽对由压力负荷增加所致AngII系统活化的干预特征（研究第一部分）,包括:1)心肌氧化应激和抗氧化酶的作用;2)AngII AT1/AT2受体平衡的调节;3)纤维细胞的迁移和增生的影响;4)心肌细胞肥大和心脏收缩和舒张功能的调节。为了解调节的可能机制,实验进一步分析了利拉鲁肽疗效的作用环节（研究第二部分）,包括:1)观察血液中GLP-1水平的变化;2)心脏形态和重量的作用;3)纤维化反应调节蛋白表达如mTOR/p70S6K的影响;4)自噬调节蛋白表达如LC3,Beclin-1,p62的影响;5)心肌纤维化和心功能改变的调节。在培养的H9C2心肌细胞,观察了利拉鲁肽对AngⅡ诱导下心肌细胞反应特征的直接作用（研究第三部分）,包括:1)细胞增殖和肥大的作用;2)AngII受体表达的调节;细胞氧化反应水平如ROS和纤维化介导蛋白TGFβ1和α-SMA的调定;3)纤维化调节蛋白如mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响;4)胶原蛋白表达变化的作用。在上述研究中,为澄清利拉鲁肽调定AngII受体和纤维化的传导机制,实验采用AngII AT1受体阻断剂替米沙坦和mTOR特异性抑制剂雷帕霉素进行了对比性观察,证实了利拉鲁肽受体通路和氧化应激的直接细胞效应。本研究的结果表明,GLP-1疗法对压力负荷增加所致的心肌纤维化和功能紊乱,有显着的抑制作用;这种保护效应是通过调定AngII受体和纤维化反应过程来实现的。这些研究结果也为GLP-1疗法在心衰病人的治疗,提供了新的实验基础和应用前景。第一部分胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑并改善心脏功能目的:血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）通过引起心脏重塑和功能障碍而导致心力衰竭的发生,在心力衰竭的发病机制中具有重要的作用。已证明胰高血糖素样肽1（GLP-1）对动物和患者具有心脏保护作用。本研究想证实GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是否通过改变AngⅡ1型受体（AT1R）受体表达来抑制腹主动脉缩窄（AAC）引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）替米沙坦治疗组（Telmi组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以10mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠替米沙坦。2.定期测量大鼠体重和血糖值。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.酶标仪检测:通过丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）和人N端前脑钠素（NT-pro BNP）试剂盒检测大鼠心脏MDA和NT-pro BNP的含量以及SOD的活性。5.免疫组化法:定位及评估心脏组织的ACE2、巨噬细胞、肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。6.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。7.Western-blot法:测定心肌组织中AT1R、AT2R、TGF-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3、smad4、smad7、collagenI和collagenⅢ的蛋白定量表达。8.采用2D Vivid7超声仪测定大鼠的心功能。9.采用BL-410生物信号采集与处理系统:检测大鼠心率、血压及左心室血流动力学指标。结果:1.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响:从术后第2周开始定期测量大鼠体重和血糖值,随着时间的推移,虽然两种数据均出现上升趋势,但各组同一时间的数值之间并无显着的统计学差异。2.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW的比值的影响:腹主动脉缩窄术16周后,相对于Sham组大鼠HW/BW比值（3.38±0.17vs.2.46±0.05,p<0.05）和MSA（1512±99 vs.586±98μm2,p<0.05）明显升高,利拉鲁肽和替米沙坦可分别减少HW/BW比值（2.63±0.09和2.77±0.05vs.AAC组,所有p<0.05）和MSA降至766±61μm2或871±51μm2（与AAC组相比,p<0.05）。3.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭的影响:相对于Sham组,AAC组在实验16周后检测发现NT-pro BNP（48.4±8.6pg/ml）表达水平显着提高,给予利拉鲁肽和替米沙坦治疗后,NT-pro BNP的表达水平分别为（10.3±0.8pg/ml和14.8±1.3pg/ml vs.AAC组,所有p<0.05）。4.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响:与Sham组相比,AAC组心肌组织中的MDA表达显着提高（23.4±1.3vs.16.3±0.6nmol/mg,p<0.05）,SOD表达水平却降低（8.1±0.8 vs.10.4±0.4U/mg,p<0.05）。相对于AAC组,给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后可使MDA水平分别降低至15.9±1.6和17.2±1.4nmol/mg（相对于AAC组,p<0.05）,且SOD酶活性分别提高至11.9±1.2和11.6±1.1U/mg（与AAC组相比,p<0.05）,结果提示给药后心脏抗氧化能力增强。5.利拉鲁肽和替米沙坦降低术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2的影响:实验结束时,相对于Sham组,AT1R的蛋白表达水平显着提高10.55±2.5%,而AT2R的蛋白表达则降低了36.43±5.6%,p<0.05。在手术后给予利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AAC组呈现相反的表达水平。在抑制AT1R表达的同时刺激AT2R的表达,体现为AT1R/AT2R比例的降低。免疫组织化学染色显示,相对于Sham组,AAC组中血管周围和心肌间质中ACE2的表达显着减弱。相对于AAC组,在术后给予利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗可逆转ACE2的表达下降。6.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1的影响:免疫组织化学法检测AAC组心脏切片结果表明,在血管周围区域和心肌间质中聚集了大量巨噬细胞,而利拉鲁肽或替米沙坦治疗可减轻这些巨噬细胞的聚集数量,Sham组则很少见巨噬细胞在心肌组织间隙中聚集。与AAC组巨噬细胞浸润增强相一致,心肌中TGF-β1的表达也显着增加。WB检测TGF-β1的蛋白质水平,进一步证实了TGF-β1表达的变化。与AAC组相比,在腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦可使心脏中巨噬细胞浸润和TGF-β1的表达均降低。7.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白的影响相对于Sham组,AAC组在心肌血管周围出现大量的α-SMA阳性肌成肌纤维细胞。而在Sham组,在心肌细胞间隙中仅有很少的α-SMA阳性细胞表达。在进行腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦的药物治疗,α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显减少。在Sham组中,Smad2和Smad3几乎没有被磷酸化。然而AAC组,Smad2/3的磷酸化显着增强,与Smad2/3的总蛋白水平增加相一致。相对于Sham组,AAC组中Smad4的总蛋白水平显着上调,而Smad7的总蛋白表达下调。然而,通过利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗后明显逆转了所测Smad家族成员蛋白质表达的变化趋势。8.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响:与Sham组相比,AAC组中胶原蛋白I和Ⅲ的蛋白水平显着增加。利拉鲁肽或替米沙坦的给药组I型和Ⅲ型胶原蛋白的产生相对AAC组显着减少。AAC组Masson结果显示由胶原蛋白面积百分比来表示的沉积胶原蛋白区域在血管周围和间质心肌中显着扩展。在整个实验中,在假手术对照中均未检测到新合成的胶原蛋白。腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙药物组,心脏中血管周区域和心内膜均显示胶原沉积显着减少。9.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响:超声结果显示相对于Sham组,AAC组在实验的16周时导致LVIDd显着增加,LVEF和LVFS降低。与AAC组的结果相比,利拉鲁肽或替米沙坦治疗可增强心脏功能。BL-410生物信号采集和处理系统结果显示:相对于Sham组,AAC组中大鼠的MAP,HR和LVEDP各项指标都显着增加,LVSP降低。此外,左室压力的最大增加速率(+dp/dtmax)和左室压力的减小速率(-dp/dtmax)明显降低。利拉鲁肽和替米沙坦治疗16周可有效预防心脏功能减退,与抑制心脏肥大和纤维化的结果相一致。结论:1.利拉鲁肽对心肌重塑和心功能具有保护作用;2.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和ACE2的表达,进而减少自由基产生有关;3.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第二部分胰高血糖素样肽1通过抑制mTOR/p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用目的:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）介导组织纤维化并负面调节自噬。本部分旨在研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过抑制mTOR/p70S6K信号传导并促进自噬活性来保护心脏免受腹主动脉缩窄引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）雷帕霉素治疗组（Rapa组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以0.2mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠雷帕霉素。2.检测大鼠血糖和血浆中GLP-1含量,利用GLP-1试剂盒酶标仪检测。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织进行固定、包埋后,HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.免疫组化法:定位及评估心脏组织的肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。5.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。6.Western-blot法:测定心肌组织中GLP-1R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、LC3、Beclin-1、p62、collagen I和collagenⅢ的蛋白定量表达。7.无创评估大鼠心脏整体功能。8.有创大鼠血流动力学测定。结果:1.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠基本状态的影响各组血糖和体重均有增高趋势,但是在四个实验组之间没有发现统计学差异。2.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏形态和HW/BW比值的影响相对于Sham组,AAC组在实验结束后发现心脏重量显着增加,并引起结构性扩张,利拉鲁肽和雷帕霉素给予治疗后明显减轻。相对于Sham组,AAC组HW/BW比显着增加（4.07±0.22 vs.2.68±0.21,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗显着降低了HW/BW比（与AAC组相比,分别为2.98±0.20和2.85±0.18,所有p<0.05）。相对于Sham组,AAC组的MSA明显增加（553±23 vs.232±25μm2,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗可将MSA相对降低至294±24μm2或322±23μm2,与AAC组相比,所有p<0.05。3.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠血浆GLP-1水平和GLP-1受体表达的影响与Sham组相比,AAC组导致血浆GLP-1水平显着降低（0.10±0.01vs.0.15±0.01ng/ml,p<0.05）,GLP-1受体的表达下调了26.1±5.6%。相对于AAC组,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药使血浆GLP-1水平显着升高（相对于AAC组分别为0.15±0.01和0.14±0.01ng/ml,所有p<0.05）,在这些组中与GLP-1水平升高相一致,GLP-1受体的表达水平升高。4.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠肌成纤维细胞增殖的影响相对于Sham组,AAC组心肌间质含有丰富的α-SMA阳性肌成纤维细胞。然而与AAC组相比,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药抑制了α-SMA阳性的肌成纤维细胞的出现数量。5.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响相对于Sham组,AAC组没有改变mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但是明显提高了其磷酸化水平。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用。6.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠LC3,Beclin-1和p62表达的影响相对于Sham组,腹主动脉缩窄后LC3-I稳定增加（p<0.05）,而自噬抑制的标志物LC3-Ⅱ/LC3-I比率降低。与Sham组相比,AAC组心肌Beclin-1的表达下降（p<0.05）。与Sham组的大鼠相比,AAC组p62的蛋白水平显着升高（p<0.05）。利拉鲁肽作用后逆转AAC组的LC3,Beclin-1和p62蛋白表达,和雷帕霉素的表达调节相一致。7.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠胶原合成和组织纤维化的影响相对于Sham组,AAC组胶原I和Ⅲ的蛋白质水平增加。Masson三色染色法结果显示,AAC组心肌中纤维化区域在心肌间质和血管周围区域明显增加。在整个实验中,在Sham组心肌间质和血管周围区域均未检测到新合成的胶原蛋白。用利拉鲁肽或雷帕霉素治疗等效地抑制了胶原的表达,并减少了心肌间质和血管周围区域的纤维化沉积。8.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏整体功能的影响相对于Sham组,AAC组LVSs,LVIDd,LVIDs,LVPWd明显增加,EF和FS降低,利拉鲁肽或雷帕霉素治疗增强心脏功能逆转了AAC组的心脏功能指标变化。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏收缩和舒张功能的影响与Sham组相比,AAC组HR和MAP显着增加,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax分别降低了24±3%、32±2%和27±3%（p<0.05）,LVEDP增加了230±12%（p<0.05）。利拉鲁肽和雷帕霉素改变了AAC组代表心脏功能变化的趋势,从而保护心脏功能。结论:1.利拉鲁肽通过增加血浆GLP-1水平和GLP-1R表达对长期压力超负荷大鼠的心脏具有保护作用;2.利拉鲁肽对大鼠的心脏保护作用主要通过下调mTOR/p70S6K信号激活自噬,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第三部分胰高血糖素样肽1对血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用及机制研究目的:选用AngⅡ诱导H9C2心肌细胞为研究对象,观察利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2细胞肥大和纤维化的影响作用。以血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦作对照,进一步验证利拉鲁肽对心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用是通过影响AT1R信号传导的激活而进行,以mTOR的特异抑制剂雷帕霉素和mTOR的特异兴奋剂MHY1485作对照,进一步验证利拉鲁肽可通过抑制mTOR/p70S6K通路抑制心肌细胞肥大和纤维化的形成。方法:1.AngⅡ诱导H9C2心肌细胞模型建立2.分组:第一部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）替米沙坦组（AngⅡ+Telmi）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的Telmi;第二部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）雷帕霉素组（AngⅡ+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-6mol/L的Rapa;（5）MHY1485组（AngⅡ+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的MHY1485;（6）AngⅡ+Lira+Rapa组（AngⅡ+Lira+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-6mol/L的Rapa;（7）AngⅡ+Lira+MHY1485组（AngⅡ+Lira+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-5mol/L的MHY1485。3.实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测H9C2心肌细胞中ANP和BNP的m RNA含量。4.鬼笔环肽染色心肌细胞面积。5.Western-blot法:测定心肌细胞中AT1R、AT2R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、TGF-β1、collagen I的蛋白定量表达。6.流式检测心肌细胞中ROS水平表达。7.细胞免疫荧光染色:定位及评估心肌细胞中TGF-β1、α-SMA、collagen I的表达。结果:1.AngⅡ诱导H9C2模型建立10-6 mol/L AngⅡ作用心肌细胞24h后,不论是增殖率还是细胞表面积都相对最大。因此根据实验结果选取10-6 mol/L AngⅡ作用24h用于后续实验。2.不同浓度利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2心肌细胞增殖的影响在降低AngⅡ引起的H9C2心肌细胞增殖率实验中选取10-7 mol/L liraglutide进行实验。3.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞肥大的影响利用鬼笔环肽对细胞进行染色测量细胞表面积。结果显示与Control组细胞表面积811.8±64.1μm2相比,AngⅡ组心肌细胞表面积为1191.8±69.1μm2,明显增大。而加入利拉鲁肽和替米沙坦后,面积分别减少到1007.8±62.3μm2和902.3±64.3μm2（所有数据,p<0.05）。心肌细胞ANP和BNP含量可反映心肌细胞的肥大程度,利拉鲁肽和替米沙坦均可降低AngⅡ引起心肌细胞的ANP和BNP的m RNA含量的增高。4.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞AT1R和AT2R蛋白表达的影响使用蛋白印迹法检测AngⅡ受体的表达程度。在AngⅡ组AT1R表达增高,AT2R降低,在AngⅡ给药的基础上分别加入利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AngⅡ组呈现相反的表达水平。5.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内ROS表达水平的影响镜下拍照结果显示与Control组细胞相比较,AngⅡ组的ROS荧光亮度明显增高,加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,ROS荧光亮度下降（见图3-8）。流式结果显示与镜下观察结果相一致,AngⅡ组心肌细胞的ROS免疫荧光值为5546±202,相对于control组3264±205明显增高（p<0.05）。加入利拉鲁肽和替米沙坦后,ROS荧光平均免疫荧光值降为4804±203和3781±218（见图3-9）。6.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内TGF-β1水平的影响AngⅡ组TGF-β1免疫荧光平均光密度（AOD）为0.08±0.007,明显高于Control组细胞TGF-β1的AOD为0.02±0.008。加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,TGF-β1的AOD为0.05±0.010和0.03±0.011。相对于AngⅡ组明显降低,具有统计学意义。通过蛋白质印迹测定法检测各组细胞水平的TGF-β1的蛋白水平,和荧光结果一致,进一步证实了TGF-β1表达的变化趋势。7.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内α-SMA水平的影响免疫荧光结果定位显示α-SMA在心肌细胞中的表达主要位于心肌细胞质中。进行平均光密度值结果统计,结果显示AngⅡ组心肌细胞中α-SMA的表达显着增加（AOD为0.11±0.01 vs.0.05±0.01 Control,p<0.05,见图3-10A）。在给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后心肌细胞中α-SMA的表达平均光密度值为0.08±0.01和0.06±0.01,与AngⅡ组相比均降低（见图3-10B）。8.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内Collagen I表达水平的影响免疫荧光法检测细胞内胶原蛋白I主要表达在心肌细胞质中,在给予AngⅡ后collagen I的表达增多。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗有效地抑制了胶原I的平均光密度值,并减少了心肌细胞质中荧光亮度。使用蛋白质印迹法进一步确定了各组细胞胶原蛋白I的蛋白表达。和荧光结果相一致,如图3-12C典型条带及平均灰度值结果分析显示,AngⅡ组的胶原I的蛋白质水平表达增加,加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗均有效地抑制了胶原I的蛋白表达水平。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞面积的影响鬼笔环肽染色心肌细胞表面积和前面的结果相一致。在此组实验中,在AngⅡ给药基础上加入雷帕霉素也明显减少了由于AngⅡ造成心肌细胞表面积增大,结果为884.2±84.5μm2,在AngⅡ给药基础上混合给予利拉鲁肽和雷帕霉素,进一步减少了雷帕霉素组的细胞表面积。相反在加入MHY1485（mTOR的特异兴奋剂）后,增加了AngⅡ造成的心肌肥大表面积为1318.0±80.1μm2。在加入利拉鲁肽和MHY1485药物后,逆转MHY1485增加AngⅡ造成的心肌肥大的程度。10.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞mTOR和p70S6K蛋白表达的影响相对于Control组,AngⅡ组没有改变mTOR的总蛋白水平,但是明显提高了磷酸化的mTOR的水平（Ser2448处的磷酸化）。另外,心肌细胞中p70S6K的总蛋白水平在AngⅡ刺激后没有改变,但是检测到了明显的磷酸化的p70S6K（在Thr389磷酸化）（p<0.05,图3-14B）。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用（p-mTOR和p-p70S6K）。利拉鲁肽或雷帕霉素混合给药后加强了这一现象的发生,但在AngⅡ基础上加入MHY1485再加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485的结果,降低mTOR和p70S6K的磷酸化水平（p<0.05,图3-14）。11.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞内Collagen I水平的影响蛋白质印迹法确定了胶原蛋白I的表达,在AngⅡ组相对于Control组增加。免疫荧光结果显示,AngⅡ组中心肌细胞质中荧光亮度明显增加,在Control组心肌细胞质中collagen I表达较少。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或雷帕霉素治疗有效地抑制了collagen I的表达,并减少了心肌细胞质中荧光亮度,在MHY1485组加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485组collagen I的表达水平。结论:1.利拉鲁肽通过降低AT1R,上调AT2R的表达,进而减少自由基,抑制心肌细胞肥大;2.利拉鲁肽通过抑制TGF-β1的表达,减少肌成纤维细胞的表达,进而减少心肌细胞纤维化的形成;3.利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K通路降低心肌细胞肥大和纤维化的形成。
王辉波[7]（2020）在《MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究》文中认为背景心力衰竭是各种类型心血管疾病的最终归宿,是严重威胁人类健康和生活质量的常见疾病。心肌重构是指心脏为适应各种类型心血管疾病引起的心脏前后负荷增加、多种细胞因子及神经体液的作用下,其结构和功能上发生的适应性代偿作用,这些负荷和神经体液因子长期持续最终失代偿引起心力衰竭。心肌重构主要表现为心肌肥厚（心脏体积、重量、心室壁厚度、心肌细胞横截面积的增加,几何形状的改变）、心肌间质和血管周围纤维化（细胞外基质的增加、心脏顺应性改变）、常常伴有心脏收缩功能改变（射血分数、左室短轴缩短率的降低）、心脏电重构（各种类型的房性和室性心律失常的发生率增加）。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是一种存在于所有组织中的三维非细胞结构,其不仅发挥维持组织完整性的机械支持作用,而且还作为信号中枢和生长调控因子的储存库,传递对各种细胞功能调控发挥重要作用的级联信号,以调节细胞活动和修复程序。心肌纤维化的主要病理特征是ECM成分在心肌血管周围和间质中过度积聚,ECM的形态和生化变化可能与HF发病机制和预后密切相关。微纤维相关蛋白4（microfibrillar-associated protein 4,MFAP4）,是纤维蛋白原相关蛋白超家族一种36 k Da的ECM糖蛋白,其有一个短的N-末端区域,该区域含有一个与整合素相结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid,RGD）序列。MFAP4在富含弹性蛋白的组织中高度表达,在心脏相对表达量较高,MFAP4的具体生物学功能尚未完全阐明,但其通过整合素介导血管SMCs激活和增殖,导致动脉狭窄和促炎作用已在体内得到证实。MFAP4与重构相关疾病密切相关,包括肝纤维化、动脉粥样硬化、动脉损伤刺激重构、哮喘等。然而,到目前未有相关文献报道MFAP4在心肌重构中发挥何种生物学作用。本课题旨在通过生物信息学技术,筛选心肌重构中的差异表达基因,预测MFAP4在心肌重构过程中表达升高,结合MFAP4在肝脏纤维化、血管重构、气管重构等疾病的作用及机制,提示MFAP4可能参与了心肌重构发生与发展过程。本实验采用压力超负荷和异丙肾上腺素构建小鼠心肌重构模型,观察MFAP4在重构的心肌组织中的表达改变情况;并且构建MFAP4基因敲除小鼠,研究MFAP4在心脏结构性重构和电重构中的作用及其机制,为心力衰竭过程中心脏病理性重构的防治提供一定的理论基础。方法实验一:通过GEO数据库搜索并下载关于小鼠心肌重构的芯片数据集,使用R软件Limma包进行数据处理,包括背景校正、归一化处理、对数转换和差异表达基因（DEGs）的筛选。在本研究中,将有统计学意义的DEGs定义为log2FC>1或者log2FC<?1（FC=fold change）,且调节后的P值<0.05;使用R软件分别绘制这些筛选出的DEGs的火山图和热图;使用Venny网站对多组芯片数据集取交集,得到共同的DEGs;我们通过DAVID 6.8网站对筛选出来的DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用STRING网站分析蛋白质-蛋白质相互作用;建立压力超负荷心肌重构模型,运用RT-PCR对筛选的DEGs进行初步验证;通过Western blot和免疫组化对确定的MFAP4进行进一步实验验证。实验二:构建MFAP4基因敲除小鼠,选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠（KO）和相应的同窝对照野生型小鼠（WT）,将其随机分为异丙肾上腺组（ISO）和对照组（Control）,分别注射50 mg/kg ISO或等体积生理盐水,连续注射2周后用心脏超声评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织（分生或病理）,记录心重（HW）、体重（BW）和胫骨长度（TL）的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的心肌细胞横截面积（CSA）（HE染色、WGA染色）和心肌间质区内的胶原含量（PSR染色）;通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平。实验三:选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠（KO）和相应的同窝对照野生型小鼠（WT）,将其随机分为主动脉缩窄组（AB）和假手术组（Sham）,AB术后8周采用心脏超声和血流动力学评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织（分生或病理）,记录HW、BW和TL的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的CSA（HE染色、WGA染色）和心肌间质区内的胶原含量（PSR染色）;通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平;Western blot检测各组小鼠心肌组织中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;体表心电图记录各组小鼠RR间期、PR间期、QRS波和QT持续时间;制备各组小鼠Langendorff离体心脏模型,记录离体心脏左室前游离壁的单相动作电位（MAP）,用S1-S1起搏刺激确定APD90和APD交替阀值（ALT）;用Burst刺激诱导室性心动过速（ventricular tachycardia,VT）,计算VT的诱发率;Western blot检测各组小鼠缝隙连接蛋白（connexin,Cx43）的表达。实验四:提取大鼠乳鼠原代心肌细胞（CMs）和原代成纤维细胞（CFs）,RT-PCR比较CMs和CFs的MFAP4基础表达水平;分别用Ang II、PE、TGFβ刺激CMs和CFs,RT-PCR检测纤维化或肥厚标志物,以及MFAP4的表达水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因沉默（Ad-sh MFAP4）,并使用TGFβ刺激,RT-PCR比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物（α-SMA、Col1α、Col3和FN）表达水平;Western blot检测各组细胞中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因过表达（Ad-MFAP4）,通过加入FAK信号通路的抑制剂（PND-1186）和TGFβ刺激,比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物表达水平,判断MFAP4发挥其生物学作用是否依赖于FAK及下游信号通路。结果实验一:从GEO搜索并下载到4组芯片数据集（GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348）;利用R软件从GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348中分别筛选出188、293、253和67个DEGs;利用Venny网站选出在这4个不同的实验中共同差异表达的基因,有23个基因表达升高（Ltbp2、Postn、Cilp、Mfap4、Thbs4、Col8a1、Timp1、Nppa、Gdf15、Pamr1、Lox、Acta1、Itgbl1、Ctgf、Cnksr1、Frzb、Mfap5、Meox1、Tgfb2、Aqp8、Fstl1、Aspn、Srpx2）,1个基因表达降低（Retnla）;通过DAVID 6.8网站对24个DEGs进行GO功能富集分析,发现它们显着富集于细胞外纤维组织、细胞粘附、伤口愈合、胞外区、胞外基质、生长因子活性等生物学功能;我们建立TAC介导的心肌重构模型,对未被证实的15个DEGs基因进行RT-PCR验证,发现显着升高了Itgbl1、Aspn、Fstl1、Mfap5、Col8a1、Ltbp2、Mfap4、Pamr1、Cnksr1、Aqp8、Meox1、Gdf15、Srpx基因的表达,降低了Retnla（P<0.05）;对确定的MFAP4进行进一步实验验证,MFAP4水平在AB后1周略有升高,在AB后2、4、6和8周显着上调（P<0.05）;同时免疫组织化学染色显示,AB后8周MFAP4在左心室的表达均明显高于假手术组。实验二:腹腔注射ISO较对照组显着增加了MFAP4基因在心肌中的表达,注射ISO 2周后较注射生理盐水组相比,小鼠心功能明显恶化（P<0.05）,而MFAP4缺乏可显着改善ISO诱导的心功能降低（P<0.05）;WT-ISO组小鼠的HW/BW、HW/TL比值显着高于WT-Con组小鼠（P<0.05）,然而KO-ISO组和WT-ISO组之间没有显着差异（P>0.05）;对比CSA,KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有显着差异（P>0.05）;此外,心肌肥厚的标志物的表达在KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有差异（P>0.05）;WT-ISO心脏与WT-Con相比,血管周围和间质胶原容积显着增加（P<0.05）,MFAP4基因缺失小鼠会使得ISO刺激后胶原容积显着减少（P<0.05）;RT-PCR和Western blot检测心肌纤维化标志物在野生型小鼠ISO组中明显上调（P<0.05）,MFAP4基因敲除能够降低上述基因的上调的程度（P<0.05）。实验三:AB术后8周的WT小鼠的心功能和血流动力学出现了显着恶化（P<0.05）,MFAP4基因敲除后心功能得到相应的缓解（P<0.05）;压力超负荷WT小鼠的HW/BW、HW/TL、心肌细胞CSA、心肌肥厚标志物显着增加（P<0.05）,然而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均没有显着差异（P>0.05）;AB 8周后,血管周围和间质胶原容积、心肌组织纤维化标志物显着增加（P<0.05）,而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均显着下降（P<0.05）;AB 8周后,FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而其磷酸化水平在MFAP4-KO小鼠中被强烈下调（P<0.05）;AB 8周后,4组小鼠之间PR间期和RR间期均没有显着改变（P>0.05）;WT-AB组小鼠较WT-Sham组相比显着增加了QRS波时间和QTc间期（P<0.05）,而MFAP4缺失后会显着降低AB手术介导的QRS波时间和QTc间期的延长（P<0.05）;AB诱导的野生型小鼠组与野生型Sham组的离体心脏灌流实验相比,APD90和ALT显着延长、VA诱导率显着增高、Cx43的表达降低（P<0.05）,而MFAP4-KO组在AB后与WT-AB组相比APD90和ALT显着缩短、VA诱导率显着降低、Cx43的表达升高（P<0.05）。实验四:CFs的MFAP4 m RNA表达水平较CMs相比高43.90倍（P<0.001）;Ang II、PE和TGFβ刺激CFs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.743倍（P<0.001）、1.397倍（P<0.05）、2.895倍（P<0.001）;Ang II、PE和TGFβ刺激CMs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.253倍（P<0.05）、1.26倍（P>0.05）、1.485倍（P<0.001）;TGFβ刺激显着增加了CFs纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平（P<0.05）,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组明显降低了纤维化标志物表达水平;免疫荧光显示,TGFβ刺激增加了纤维化标志物α-SMA的荧光强度,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了α-SMA的荧光强度;TGFβ刺激增加FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了这些蛋白的磷酸化活化（P<0.05）;而Ad-MFAP4进一步增加了TGFβ刺激CFs的纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平,而使用了FAK抑制剂（PND-1186）则弱化了Ad-MFAP4对TGFβ刺激CFs的纤维化标志物的增加作用（P<0.05）。结论1.MFAP4在发生重构的心肌组织中明显升高,且在心脏成纤维细胞表达显着高于心肌细胞表达;2.MFAP4基因缺失在异丙肾上腺素诱导的心肌重构中发挥了改善心功能、抑制纤维化的作用,对肥厚无显着影响;3.MFAP4基因缺失在压力负荷诱导的心肌重构中发挥了改善心功能和血流动力学、抑制纤维化、降低室性心律失常发生率的作用,对肥厚无显着影响;4.MFAP4基因缺失发挥抑制心肌重构是通过抑制FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活发挥作用;
邹书帆[8]（2019）在《KLF15抑制小鼠心室超负荷所致心功能衰竭的作用及机制研究》文中研究表明背景与目的风湿性主动脉瓣狭窄是常见的导致左心室超负荷的疾病,是造成心力衰竭的主要病因之一;但是,通过人工瓣膜置换解除心室负荷并不能使所有患者同等受益。患者术后心脏形态、功能的恢复情况与术前心功能情况呈正相关。我们在前期动物实验中也发现,升主动脉缩窄50%的左室超负荷大鼠心脏功能会经历一段相对正常甚至轻度增加的代偿期以及进行性降低的失代偿期,并在进一步的去负荷手术中发现代偿阶段的左室超负荷大鼠心脏形态恢复佳,而失代偿阶段却不能有效的恢复初始水平。虽然我们的前期研究很好的验证了临床现象,但对于左室超负荷致心功能代偿向失代偿的转变的具体机制尚未明确,有待进一步研究。在超负荷所致机械应力作用下产生包括:心肌细胞肥大、间质纤维化、微血管结构破坏、间质胶原沉积等变化统称为心肌重塑,是心肌结构改变的主要病理学特征。在心肌组织中,约70%的细胞都是非心肌细胞,成纤维细胞及内皮细胞是其中数量最多的细胞种类。我们推测心肌细胞除了自身的适应性肥大之外,可能对间质重塑的发生发展也起到重要的调控作用,而间质重塑导致的基质结构的改变可能是心脏功能从代偿到失代偿转变的标志。因此,研究超负荷过程中不同时期心肌重塑的变化特点及分子机制具有重要的意义。大量研究表明,Krüppel样因子家族成员KLF15对间质纤维化有重要的抑制作用,但具体机制不清楚。有研究表明,慢性主动脉瓣狭窄患者心肌组织TGF-β显着增加,同时,受TGF-β调控的CTGF的表达也增强并证实了Smad3的磷酸化是TGF-β调控CTGF表达的关键环节,推测可能与KLF15竞争性抑制磷酸化Smad3对CTGF转录启动子的促进作用。另一方面,有研究发现:慢性压力超负荷会导致p38-MAPK活化进而抑制KLF15的表达。推测KLF15低表达可能是心肌细胞对间质纤维化调控的关键因素。最新研究显示:KLF15对心肌间质血管生成中有着重要的作用,可能是KLF15抑制心功能失代偿性转变的另一关键途径,其机制可能与KLF15正性调控VEGF的分泌有关,有待进一步研究。基于前期研究及国内外进展,我们推测在超负荷疾病的病理生理发展过程中不同时期心肌重塑的变化各有特点,而间质性重塑是导致心功能衰竭的重要环节。KLF15作为关键性负性调控因子抑制间质重塑从而抑制心功能衰竭。本研究引入KLF15过表达转基因小鼠,并通过构建左室压力超负荷小鼠模型,对KLF15抑制左心室压力超负荷所致心功能衰竭作用及机制进行深入研究,有助于我们深入理解瓣膜疾病等压力超负荷疾病的病理生理过程,并为改善慢性重症瓣膜疾病的临床转归提供理论依据。研究方法1.选用8-10周龄野生型（WT）健康雄性SPF级饲养C57/BL6J小鼠,在非人工通气条件下行升主动脉缩窄术构建左室压力超负荷小鼠模型。分别于术前及术后1周、2周、3周、4周、5周、6周行心脏超声检查其射血分数（EF）及短轴缩短率（FS）,明确在不同时间点左室超负荷小鼠的心功能情况。在确定小鼠心功能代偿期及失代偿期的具体时间点后,进一步采用M型心脏超声及电子天平对其左室厚度、左室内径、心脏重量、肺重量等具体指标进行检测,从大体形态上评价左室超负荷小鼠在不同阶段心脏的形态学变化特点。2.在左室超负荷野生型小鼠心功能代偿期及失代偿期分别对其心肌组织行HE、Masson染色及血管内皮特异性标志物CD31免疫组化染色;ELⅠSA检测其心肌组织Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原含量;WB检测心肌组织KLF15及其相关蛋白CTGF、VEGF的表达情况,p38、Smad3的磷酸化水平;并设置假手术组为空白对照。从心肌显微结构及分子表达层面进一步阐明心功能代偿期及失代偿期的不同特点,并对KLF15与其相关蛋白CTGF、VEGF表达水平及p38、Smad3磷酸化水平的内在关系进行更深入的研究。3.引入心脏过表达KLF15转基因（TG）小鼠为研究对象建立左室压力超负荷模型,以野生型小鼠左室压力超负荷模型为阴性对照,并分别设置假手术组作为空白对照。通过应用超声心动图、心脏重量、肺重量、病理学及免疫组化染色、ELISA及WB等检测方法从大体标本、微观结构及分子生物学三个层面对KLF15如何调控相关因子的表达从而抑制左室超负荷所致心功能衰竭的具体机制进行更深一步的探讨研究结果1.超声心动图提示,在升主动脉缩窄术后2周时,与假手术组相比,超负荷组EF及FS均有一定程度的增加,且达到代偿高峰,但差异无统计学意义。2周之后超负荷组心功能随缩窄时间延长呈下降趋势,且在缩窄5周及6周与假手术组出现明显差异（P<0.05）。从心脏形态变化来看,心功能代偿期小鼠心脏主要呈现出以IVS、LVPW增加为特征的向心性肥厚表现,而心功能失代偿期小鼠主要呈现以LVID增加为特征的离心性肥厚表现。心脏重量及肺重量的检测结果表明,心功能代偿期主要表现为心脏重量的增加,而在心功能失代偿期心脏重量与肺重量均有增加且肺重量增加更为显着。2.HE染色显示:心功能代偿期小鼠心肌细胞出现肌纤维横截面增粗、间距增加,细胞核深染等肥大表现,心功能失代偿期小鼠在肌纤维增粗的同时,其间距进一步增加,且出现胞质断裂,碎片样改变及肌纤维排列不规则等表现。Masson染色显示:心功能失代偿期小鼠心肌组织出现了严重的纤维化反应。CD31免疫组化染色显示心功能代偿期小鼠心肌组织CD31密度增加,而心功能失代偿期小鼠CD31密度明显降低。ELISA显示:心功能代偿期小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与假手术组相比差异无统计学意义（P﹥0.05）;心功能失代偿期小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与假手术组相比明显增加（P<0.01）。WB显示:心功能代偿期小鼠心肌仅表现出Smad3磷酸化水平的增加（P<0.01）,而心功能失代偿期小鼠心肌KLF15及VEGF表达水平降低（P<0.01）、CTGF表达水平及p38、Smad3磷酸化水平均明显增加（P<0.01）。3.在左室超负荷6周的条件下,超声心动图提示,与WT小鼠相比,TG小鼠LVID的增加及EF、FS的降低均有明显减轻。肺重量增加相对轻微。病理学染色显示野生型小鼠表现出更为严重的间质纤维化反应。CD31免疫组化染色显示WT及TG小鼠心肌组织CD31密度均明显降低,TG小鼠心肌组织CD31密度降低程度更为轻微。ELISA显示:左室超负荷WT小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与左室超负荷TG小鼠相比明显增加（P<0.01）。WB显示:与左室超负荷WT小鼠相比,左室超负荷组TG小鼠CTGF表达水平明显降低（P<0.01）;VEGF及KLF15表达水平均明显增加（P<0.01）。结论1.本研究采用的非人工通气升主动脉缩窄术可成功构建左室超负荷动物模型,且在应用该建模方法后2周和6周两个不同时相点,分别可成功构建出心功能代偿模型及心功能失代偿模型;2.在心功能代偿期,心肌重塑的特点主要表现为心肌细胞肥大及间质微血管密度一定程度的代偿增加,无明显间质纤维化,心功能可维持正常甚至一定程度代偿增加;其机制与KLF15抑制p-Smad3对CTGF转录的促进作用及对VEGF的正性调控有关。3.在心功能失代偿期,除了心肌细胞本身的肥大之外,还出现了心肌间质严重的纤维化、胶原蛋白沉积及间质血管生成障碍等复杂的立体的重塑,并伴随着心功能的降低。其机制与p38磷酸化抑制KLF15表达,低表达的KLF15失去了对CTGF转录的抑制作用及VEGF转录的促进作用有关。4.心脏特异性KLF15过表达转基因小鼠可明显改善左室压力超负荷6周所导致的心功能衰竭,其作用途径与抑制间质纤维化、胶原沉积及促进血管生成作用有关。具体机制与KLF15过表达补偿了上游磷酸化p38对其的抑制作用,并通过正性调控VEGF表达与负性调控CTGF表达实现。
朱锦星[9]（2019）在《去甲乌药碱抗心肌纤维化的作用及其机制探索》文中提出研究背景及目的:心肌纤维化（cardiac fibrosis,CF）是大多数心血管疾病的一个共同的病理变化,如心肌梗塞、心脏肥大等,最终诱发心力衰竭（heart failure,HF）。心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）激活转化为肌成纤维细胞（myofibroblasts,myo CFs）被认为是心肌纤维化的关键步骤,其导致的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白沉积被认为是心肌纤维化的基础。附子作为治疗心力衰竭症状的关键药物,其水溶性强心碱类去甲乌药碱（higenamine,HG）被研究的最多。在心血管领域,各研究发现HG可以治疗心律失常、抗凋亡和抗氧化应激,有正性肌力和正性频率的作用等。然而,目前尚无HG干预心脏成纤维细胞激活从而抑制心肌纤维化的研究。本研究目的是,1、证明去甲乌药碱在体内可以抑制心肌结构重塑和改善心功能的作用;2、证明去甲乌药碱抑制心脏成纤维细胞激活转化为肌成纤维细胞的作用;3、证明去甲乌药碱抑制心脏成纤维细胞激活与β2-AR信号无关,初步探索其新的药理学靶点。研究方法:体内实验采用胸主动脉缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）,建立小鼠慢性压力超负荷心力衰竭模型,术后第2天开始给予HG（10mg/kg/day）,10周后应用心脏超声检测心脏结构和功能变化;应用WGA和Masson染色评估心肌肥大和心脏纤维化。q RT-PCR检测心脏胚胎基因ANP,BNP和β-MHC m RNA的表达。体外实验采用原代新生大鼠心脏成纤维细胞和心肌细胞,用TGF-β诱导心脏成纤维细胞激活,q RT-PCR检测ACTA2、Collagen I、III和Fibronectin m RNA的表达,Western blotting和细胞免疫荧光检测α-SMA表型蛋白及T-Smad和P-Smad通路蛋白的表达。用AngⅡ诱导心肌细胞肥大,细胞免疫荧光检测心肌细胞α-actin蛋白的表达,q RT-PCR检测ANP,BNP m RNA的表达。结果:在体内HG可以改善TAC诱导的心脏功能障碍,抑制心肌细胞肥大和心肌间质纤维化,以及心脏胚胎基因的表达增加。在体外HG可以抑制TGF-β诱导的心脏成纤维细胞激活及激活后基质蛋白的沉积;此作用机制与其在心肌细胞上已知的β2受体信号无关,而与TGF-β/Smad经典信号通路相关。HG可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大并降低心脏胚胎基因的表达增加。结论:（1）本研究揭示了HG在心血管领域新的作用——在体内、体外均能抑制心肌间质纤维化和心肌细胞肥大,改善心脏功能;（2）HG新的作用机制:HG抑制心脏成纤维细胞激活的机制与其已知的在心肌细胞上作用于β2受体信号无关,而是通过调节TGF-β/Smad信号通路抑制心脏成纤维细胞的激活及细胞外基质蛋白的沉积,从而抑制心肌纤维化。
邵帅[10]（2019）在《If通道抑制剂对心力衰竭心肌纤维化的作用及机制研究》文中认为背景及目的:心力衰竭（Heart failure,HF）一直以来都是心血管病医生在临床中治疗的难题,具有发病率高、再入院高以及死亡率高的特点,严重影响患者的生活质量。近年来,射血分数保留性心力衰竭（Heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF）逐渐得到人们的关注,如能在HFpEF阶段将HF加以控制,则能够延缓向射血分数下降性心力衰竭（Heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF）发展的进程。HF的发病机制尚不明确,多认为与心室重构和心肌纤维化有关。依伐布雷定（Ivabradine,IVA）是一种窦房结If电流选择性特异性抑制剂,有研究提出IVA能够抑制HF动物模型心肌纤维化,具有逆转心室重构的作用,但其机制鲜有报道。本研究拟通过建立主动脉弓结扎术（Transverse aortic constriction,TAC）模型,模拟HF由HFpEF向HFrEF发展的过程,阐明IVA对压力超负荷导致的心肌纤维化及心室收缩及舒张功能障碍的影响,探讨IVA调控心室成纤维细胞（Ventricular fibroblasts,vFBs）增殖及转分化的分子机制,探讨其对miR-133a及TGF-β/Smad信号通路的作用,为HF心肌纤维化的防治提供新的理论基础。方法:1、将20只8周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为假手术组（Sham组,n=10）和TAC模型组（TAC组,n=10）。记录术前及术后两组小鼠的体重、心率和鼠尾动脉压力变化。应用超声心动图与血流动力学检查分析术后4周、8周、12周、17周两组小鼠心脏结构和功能变化,应用H-E、Masson染色、天狼星红染色和免疫荧光染色观察心脏结构和心肌纤维化程度,应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）和免疫蛋白质印迹（Western Blotting）检测miR-133a及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。应用ELISA检测血浆NT-proBNP水平。2、将TAC术后4周小鼠随机分为TAC-EFp模型组（n=8）、IVA-L组（10mg/kg/d,n=8）、IVA-H组（20mg/kg/d,n=8）,TAC术后9周小鼠随机分为TAC-EFr模型组（n=8）、IVA-L组（10mg/kg/d,n=8）、IVA-H组（20mg/kg/d,n=8）,给药8周。应用超声心动图与血流动力学检查分析不同组间小鼠心脏结构和功能变化。应用H-E、Masson染色、天狼星红染色和免疫荧光染色观察心脏结构和心肌纤维化程度。应用qRT-PCR和Western Blotting方法检测miR-133a及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。应用ELISA检测血浆NT-proBNP水平。应用Mapping lab和Langendorff心脏离体灌流技术检测心室电传导速度、传导方向、传导异质性和室性心动过速（Ventricular tachycardia,VT）诱发率。3、提取和培养新生SD大鼠vFBs,运用AngⅡ建立vFBs转分化模型,并分别给予IVA低剂量和高剂量干预,应用qPCR、Western Blotting和CCK-8法测定TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达和细胞增值率。4、通过脂质体转染方法在vFBs中分别过表达和沉默miR-133a,运用qRT-PCR方法检测miR-133a的表达水平,运用qRT-PCR和Western blotting方法观察CTGF、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达,运用CCK-8方法检测vFBs增殖率。5、通过脂质体转染方法在vFBs中分别过表达和/或沉默miR-133a后,运用AngⅡ建立vFBs转分化模型,再分别给予IVA低剂量和高剂量干预,运用qRT-PCR和Western blotting方法观察CTGF、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达。结果:1、TAC组小鼠术后4周DBP、IVSTd、LVPWd、IVRT、EDT、LVEDP和Tau明显升高,LVIDs、E/A及-dp/dtmax显着降低（p<0.05）;8周HR、SBP明显升高（p<0.05）,LVIDs显着性差异消失（p>0.05）,LVEF、LVFS、+dp/dtmax无差异性改变（p>0.05）;9周LVIDs、LVIDd开始增大（p<0.05）,LVEF、LVFS、+dp/dtmax开始降低（p<0.05）,NT-proBNP显着升高（p<0.05）,与术后时间呈正相关。病理学结果显示TAC组小鼠CVF显着增加（p<0.05）,与术后时间呈正相关。随着TAC术后时间的推移,miR-133a表达显着下调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达上调（p<0.05）。2、给药8周后,与TAC-EFp组比较,IVA-L组和IVA-H组HR减慢（p<0.05）,BP无变化;IVA-H组IVSTd、LVPWd、IVRT、EDT、LVEDP显着降低（p<0.05）,EF、FS、-dp/dtmax和+dp/dtmax升高（p<0.05）,而IVA-L组差异不明显（p>0.05）IVA-H组和IVA-L组NT-pro BNP、CVF显着降低（p<0.05）,miR-133a表达上调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达下调（p<0.05）。IVA-H组与IVA-L组间差异不明显（p>0.05）。3、给药8周后,与TAC-EFr组比较,IVA-L组和IVA-H组HR减慢（p<0.05）,NT-pro BNP、CVF降低（p<0.05）,miR-133a表达上调,其靶基因CTGF及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达下调（p<0.05）,BP、IVSTd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、EF和FS无变化（p>0.05）,IVA-H组IVRT、EDT、E/A、LVEDP和Tau降低（p<0.05）,-dp/dtmax和+dp/dtmax加快（p<0.05）。IVA-H组较IVA-L组IVRT、EDT、CVF降低（p<0.05）。电生理结果显示,TAC-EFr组LV传导模式紊乱,传导异质性增加,VT诱发率增高（p<0.05）,IVA-H组LV传导模式趋向正常,传导异质性降低,VT诱发率降低（p<0.05）;RV传导方向组间差异不明显（p>0.05）。4、Ang Ⅱ组vFBs增殖率升高,miR-133a下调,TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达上调,IVA干预后增殖率下降,miR-133a上调,蛋白表达下调（p<0.05）。5、过表达miR-133a后,vFBs增殖率降低,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达下调（p<0.05）;过表达miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ较Ang Ⅱ组表达下调,较Ad-miR-133a组上调（p<0.05）;沉默miR-133a后,细胞增殖率升高,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达上调（p<0.05）;沉默miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激,CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达进一步上调（p<0.05）。6、沉默miR-133a并给予Ang Ⅱ刺激和IVA干预,Si-miR-133a+Ang Ⅱ+IVA组较Si-NC+Ang Ⅱ+IVA组CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达显着上调（p<0.05）,较Si-miR-133a+Ang Ⅱ组显着下调（p<0.05）,与Si-NC+Ang Ⅱ组比较差异不明显（p>0.05）。结论:TAC术后4周小鼠心脏表现为左室肥厚、左室舒张功能障碍以及心肌纤维化,可模拟HFp EF心肌纤维化的病理过程;TAC术后9周小鼠心脏表现为左室肥厚、左室扩大、左室舒张及收缩功能均减退以及心肌纤维化,可模拟HFr EF心肌纤维化的病理过程。If通道抑制剂可通过调控miR-133a和TGF-β/Smad通路发挥抑制心肌纤维化作用,从而改善心室重构,降低VT发生率。对于心功能的改善作用在TAC-EFp组中的治疗效果较TAC-EFr组显着,提示早期干预HF的重要性。
二、慢性压力超负荷对兔左心室结构及功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性压力超负荷对兔左心室结构及功能的影响（论文提纲范文）
（1）氧化应激介导心力衰竭时病理性心肌细胞自噬的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验器材 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.4.1 10×PBS缓冲液 |
| 1.4.2 内源性过氧化物酶封闭液 |
| 1.4.3 分离胶和浓缩胶 |
| 1.4.4 电泳液 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.5.1 大鼠腹主动脉缩窄模型的建立 |
| 1.5.2 超声心动图检测 |
| 1.5.3 组织留存 |
| 1.5.4 Masson三色染色 |
| 1.5.5 免疫组织化学染色 |
| 1.5.6 免疫蛋白印迹法--Western blot |
| 1.5.7 荧光定量检测--Real-time PCR |
| 1.5.8 病理染色结果分析 |
| 1.5.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NAC减轻慢性压力超负荷诱导的心肌肥厚和心功能不全 |
| 2.2 NAC减轻慢性压力超负荷诱导心衰时心肌氧化应激增加 |
| 2.3 NAC减轻慢性压力超负荷诱导心衰时病理性心肌细胞自噬 |
| 2.4 NAC减轻慢性压力超负荷诱导心衰时自噬基因表达 |
| 2.5 NAC减轻慢性压力超负荷诱导心衰时心肌细胞肥大和心肌纤维化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬、氧化应激与心力衰竭之间的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）不同程度的压力超负荷对新生小鼠心脏结构和功能的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 压力超负荷模型的构建及其对生长速度的影响 |
| 2.2 中度的压力超负荷明显损害心脏的结构和功能 |
| 2.3 轻度的压力超负荷刺激心肌细胞增殖和促进血管新生 |
| 2.4 中度的压力超负荷导致失代偿性心肌肥大 |
| 2.5 中度的压力超负荷导致心脏的亚细胞结构发生改变 |
| 2.6 中度的压力超负荷导致明显的心脏纤维化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 综述 心脏再生与压力超负荷的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间主要成绩 |
| 致谢 |
（3）靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 病毒信息 |
| 1.3 主要试剂和设备 |
| 1.4 重要试剂的配置 |
| 2 实验内容与方法 |
| 2.1 研究对象的分组 |
| 2.2 H9C2 心肌细胞的培养 |
| 2.3 MTT检测AngⅡ对H9C2 心肌细胞活力的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.5 动物模型的建立 |
| 2.6 动物的血流动力学检测 |
| 2.7 qRT-PCR检测 |
| 2.8 病理学检测 |
| 2.9 ELISA法检测动物血清TNF-α、IL-6 |
| 2.10 Western blot检测蛋白表达 |
| 3 质量控制 |
| 3.1 实验设计 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 动物模型的建立 |
| 3.4 Western blot |
| 4 统计分析 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Nf-κB 与心室重构 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（4）CYLD通过抑制心肌细胞自噬溶酶体外排加剧压力超负荷诱导的心肌病（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 局限性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着1 |
| 英文论着2 |
| Western blot原始图片 |
（5）碘化N-正丁基氟哌啶醇通过ROS/JNK/Brf1通路拮抗压力超负荷小鼠病理性心肌肥厚（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 第一部分:F_2对小鼠病理性心肌肥厚药理作用的确定 |
| 第二部分:F_2对ROS/JNK/BRF1 信号通路的作用 |
| 第三部分:F_2对心肌细胞线粒体的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 失代偿期病理性心肌肥厚模型的成功建立 |
| 4.2 ROS/JNK/BRF1 信号通路在整体模型中的验证 |
| 4.3 F_2新药理作用的发现 |
| 4.4 F_2的倒“U”型量效关系 |
| 4.5 F_2拮抗病理性心肌肥厚的分子机制 |
| 4.6 VER拮抗病理性心肌肥厚新机制的揭示 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 线粒体在心肌肥厚中的变化及以线粒体为靶点的药物治疗策略 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素II1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑及改善心脏功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响 |
| 2.2 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW比值的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭程度的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2表达的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1 表达的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白表达的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽对心脏功能具有保护作用 |
| 3.2 利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和 ACE2 的表达,进而减少自由基产生有关 |
| 3.3 利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关 |
| 4 小结 |
| 第二部分 胰高血糖素样肽1 通过抑制mTOR/ p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠基本状态的影响 |
| 2.2 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏形态和HW/BW比值的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠血浆GLP-1 水平,GLP-1 受体表达的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠肌成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠LC3,Beclin-1和p62 表达的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠胶原合成和组织纤维化的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏整体功能的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏收缩和舒张功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽通过增加GLP-1 水平和GLP-1R表达对长期压力超负荷大鼠的心脏具有保护作用 |
| 3.2 利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K信号通路,激活自噬,进而减少胶原沉积和纤维化起到心脏保护作用 |
| 4 小结 |
| 第三部分 胰高血糖素样肽1 对血管紧张素Ⅱ诱导的H9C2 心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 AngⅡ对H9C2 心肌细胞的增殖作用 |
| 2.2 不同浓度利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2 心肌细胞增殖的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞肥大的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞AT1R和 AT2R蛋白表达的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内ROS水平的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内TGF-β1 水平的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内α-SMA水平的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内Collagen I水平的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞面积的影响 |
| 2.10 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞mTOR和 p70S6K蛋白表达的影响 |
| 2.11 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞内Collagen I水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽通过降低AT1R,上调AT2R的表达,进而减少自由基,抑制心肌细胞肥大 |
| 3.2 利拉鲁肽通过抑制TGF-β1 的表达,减少成纤维细胞的表达,进而减少心肌细胞纤维化的形成 |
| 3.3 利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K通路降低心肌细胞肥大和纤维化的形成 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词汇表 |
| 引言 |
| 第一部分 基于生物信息学分析MFAP4在心肌重构中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分 MFAP4在异丙肾上腺素诱导心肌重构中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三部分 MFAP4在压力超负荷诱导心肌重构中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第四部分 MFAP4在心肌重构中的作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 胞外囊泡与心肌重构的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间科研成果目录 |
| 致谢 |
（8）KLF15抑制小鼠心室超负荷所致心功能衰竭的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 左室超负荷小鼠心功能代偿及失代偿模型构建 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 左室超负荷所致心功能代偿及失代偿期心肌重塑的研究 |
| 3.1 实验材料及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 KLF15 抑制左室超负荷所致心功能衰竭的作用及机制研究 |
| 4.1 实验材料及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 心肌纤维化分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 KLF15 调控心肌重塑的研究进展 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（9）去甲乌药碱抗心肌纤维化的作用及其机制探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略中文名对照表 |
| 引言 |
| 第一章 去甲乌药碱对慢性压力超负荷模型小鼠心功能和心肌重塑的改善作用 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 关键实验仪器及器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠一般情况 |
| 2.2 实验动物分组及给药方式 |
| 2.3 心脏慢性压力超负荷模型的建立 |
| 2.4 小鼠心脏超声检测 |
| 2.5 心脏取材及保存 |
| 2.6 WGA染色 |
| 2.7 Masson染色 |
| 2.8 心脏组织总RNA提取 |
| 2.9 q RT-PCR实验步骤 |
| 2.10 数据统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 去甲乌药碱改善TAC诱导的小鼠心脏功能障碍 |
| 3.2 去甲乌药碱抑制TAC诱导的小鼠心脏肥大及相关胚胎基因表达 |
| 3.3 去甲乌药碱抑制TAC诱导的心肌结构重塑 |
| 4 讨论 |
| 4.1 心力衰竭与心肌重塑 |
| 4.2 慢性压力超负荷与心肌重塑 |
| 4.3 TAC模型的选择 |
| 4.4 本次实验结果讨论 |
| 4.4.1 HG改善TAC诱导的小鼠心脏肥大和心功能障碍 |
| 4.4.2 HG抑制TAC诱导的小鼠心脏结构重塑 |
| 4.5 对本章实验的进一步思考 |
| 第二章 去甲乌药碱在体外对TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞激活的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 细胞分离及培养试剂 |
| 1.2.2 q RT-PCR试剂 |
| 1.2.3 引物设计与合成 |
| 1.2.4 蛋白提取及蛋白定量试剂 |
| 1.2.5 相关抗体 |
| 1.2.6 增殖试剂盒 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 1.4.1 SDS-PAGE12%分离胶配制 |
| 1.4.2 SDS-PAGE3.5%浓缩胶配制 |
| 1.4.3 10×转膜缓冲液的配制 |
| 1.4.4 10×电泳缓冲液的配制 |
| 1.4.5 PBST缓冲液配制 |
| 1.4.6 1×细胞裂解液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代新生大鼠心脏成纤维细胞的分离和培养 |
| 2.2 细胞处理及加药方式 |
| 2.2.1 细胞分组 |
| 2.2.2 细胞处理 |
| 2.3 心脏成纤维细胞总蛋白的提取 |
| 2.4 Bradford法测蛋白浓度和样本制备步骤 |
| 2.5 Western blotting操作步骤 |
| 2.6 心脏成纤维细胞总RNA的提取 |
| 2.7 qRT-PCR实验步骤 |
| 2.8 细胞免疫荧光实验步骤 |
| 2.9 体外诱导肌成纤维细胞增殖 |
| 2.10 体外诱导肌成纤维细胞迁移 |
| 2.11 数据统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 去甲乌药碱抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维激活 |
| 3.2 去甲乌药碱抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞激活不依赖其经典的β2-AR信号 |
| 3.3 去甲乌药碱经调控TGF-β/Smad信号通路抑制心脏成纤维细胞激活 |
| 3.4 去甲乌药碱不能抑制肌成纤维细胞的迁移和增殖 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CFs概述 |
| 4.3 CFs参与疾病的机制与通路 |
| 4.4 本次实验结果讨论 |
| 4.4.1 HG抑制CFs激活及激活后相关胶原基因的表达 |
| 4.4.2 HG抑制CFs激活的作用机制不依赖β2-AR信号 |
| 4.4.3 HG调节TGF-β/Smad信号通路抑制CFs激活 |
| 4.4.4 HG不能抑制肌成纤维细胞的迁移和增殖 |
| 4.5 对本章实验的进一步思考 |
| 第三章 去甲乌药碱在体外对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的作用 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 细胞分离及培养试剂 |
| 1.2.2 q RT-PCR试剂 |
| 1.2.3 引物设计与合成 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代新生大鼠心肌细胞的分离和培养 |
| 2.2 细胞处理及加药方式 |
| 2.2.1 细胞分组 |
| 2.2.2 细胞处理 |
| 2.3 心肌细胞总RNA的提取 |
| 2.4 q RT-PCR实验步骤 |
| 2.5 细胞免疫荧光实验步骤 |
| 2.6 数据统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 去甲乌药碱在体外可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大 |
| 3.2 去甲乌药碱在体外可以抑制AngⅡ诱导的胚胎基因表达增加 |
| 4 讨论 |
| 4.1 心肌肥大概述 |
| 4.2 病理性心肌细胞肥大的机制 |
| 4.3 本次体外实验体结果证实HG可直接作用于心肌细胞肥大 |
| 4.4 对本章实验的进一步思考 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录一 :文献综述 Research Progress of Traditional Chinese Medicine on Cardiac Remodeling |
| References |
| 附录二 :硕士期间已发表的论文全文 |
（10）If通道抑制剂对心力衰竭心肌纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、压力超负荷致心肌纤维化模型的建立与评价 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象及实验方法 |
| 1.1.2 实验试剂及实验仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 TAC模型小鼠各时间点心率(Heart rate,HR)的变化 |
| 1.2.2 TAC模型小鼠各时间点血压(Blood pressure,BP)的变化 |
| 1.2.3 TAC模型小鼠心脏结构及功能指标的改变 |
| 1.2.4 TAC模型小鼠血流动力学指标的变化 |
| 1.2.5 TAC模型小鼠血清中NT-proBNP水平变化 |
| 1.2.6 组织病理学检查 |
| 1.2.7 TAC模型小鼠心肌组织中miR-133a及其靶基因在mRNA水平变化 |
| 1.2.8 TAC模型小鼠心肌组织中心肌纤维化标志物在蛋白质水平变化 |
| 1.2.9 TAC模型小鼠心肌组织中TGF-β/Smad通路蛋白在蛋白质水平变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 心肌纤维化模型的建立与改良 |
| 1.3.2 联合利用超声心动图和血流动力学评价TAC模型 |
| 1.3.3 利用组织病理学及分子生物学评价TAC模型 |
| 1.4 小结 |
| 二、If通道抑制剂对TAC模型小鼠心肌纤维化的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象、实验分组及干预方式 |
| 2.1.2 实验试剂及实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 依伐布雷定对舒张功能下降心肌纤维化模型的影响 |
| 2.2.2 依伐布雷定对收缩功能下降心肌纤维化模型的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 依伐布雷定对压力超负荷致HF小鼠心脏收缩和舒张功能的影响 |
| 2.3.2 依伐布雷定对压力超负荷致HF小鼠心肌纤维化的影响 |
| 2.3.3 依伐布雷定对压力超负荷致HF小鼠电重构的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、If通道抑制剂干预由AngⅡ诱导的成纤维细胞转分化模型的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验材料及实验仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 AngⅡ诱导SD乳鼠vFBs转分化模型的建立 |
| 3.2.2 依伐布雷定对vFBs转分化和增殖的作用 |
| 3.2.3 依伐布雷定在vFBs转分化模型中对miR-133a的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 心肌纤维化的作用及机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、慢性压力超负荷对兔左心室结构及功能的影响（论文参考文献）
- [1]氧化应激介导心力衰竭时病理性心肌细胞自噬的机制研究[D]. 介希. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]不同程度的压力超负荷对新生小鼠心脏结构和功能的影响[D]. 陈栩科. 广州医科大学, 2021(02)
- [3]靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究[D]. 王栩越. 新疆医科大学, 2021(02)
- [4]CYLD通过抑制心肌细胞自噬溶酶体外排加剧压力超负荷诱导的心肌病[D]. 祁磊. 山东大学, 2020
- [5]碘化N-正丁基氟哌啶醇通过ROS/JNK/Brf1通路拮抗压力超负荷小鼠病理性心肌肥厚[D]. 曾庆炜. 汕头大学, 2020(02)
- [6]胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究[D]. 郑荣华. 山西医科大学, 2020
- [7]MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究[D]. 王辉波. 武汉大学, 2020(03)
- [8]KLF15抑制小鼠心室超负荷所致心功能衰竭的作用及机制研究[D]. 邹书帆. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]去甲乌药碱抗心肌纤维化的作用及其机制探索[D]. 朱锦星. 上海中医药大学, 2019(03)
- [10]If通道抑制剂对心力衰竭心肌纤维化的作用及机制研究[D]. 邵帅. 天津医科大学, 2019(02)