一、绿色荧光蛋白应用的研究进展（论文文献综述）
侯亚男[1]（2021）在《高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究》文中研究指明生物组织有一个光学“透明窗口”,这个区域的光谱范围在650-900 nm之间,由于血红蛋白、水、脂质和黑色素等细胞成分在这个区域吸收最小,导致光对组织的穿透力更强,同时该区域还具有较低的自发背景荧光和光散射率,所以发射光谱处于这个区域的荧光蛋白特别适合深层组织成像。目前胆素蛋白已经将荧光蛋白的光谱范围扩展到远红光（FR,650-700 nm）和近红外（NIR,700-770 nm）区域。远红光和近红外区域的荧光蛋白对于生物成像和多重标记非常重要。然而,随着荧光蛋白发射波长的增加,荧光量子产率和荧光强度也会相应的降低,所以在保持近红外区域发射光谱红移的基础上,同时保证荧光蛋白的高亮度和单体状态依旧是个挑战。在远红光光适应的蓝藻中,我们发现了两个藻胆体核心亚基ApcE2和ApcF2,其中ApcE2来自于Synechococcus sp.PCC7335,ApcF2来自于Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203。我们首先以ApcE2为模板,分子进化出一个可溶的藻胆蛋白,命名为北斗荧光蛋白BDFP3,它与植物光敏色素PФB非共价结合得到BDFP3.1,吸收峰在708 nm,荧光峰在720 nm。其中色素PФB是通过外部添加与BDFP3结合产生荧光的,游离色素PФB可通过先对BDFP3.3酸性尿素变性,再氯仿萃取的方式获得。随后我们将两个BDFP1.1与一个BDFP3进行融合,设计了一个三联嵌合体,命名为BDFP1.1:3.1:1.1,它的发射波长达722 nm,以单体形式存在,在哺乳动物细胞内的有效亮度是i RFP720的2.7倍。其中BDFP1.1是由ApcF2衍生而来,可以共价结合胆绿素BV,荧光峰在710 nm。本实验将BDFP1.1共价结合BV的荧光亮度和BDFP3非共价结合PФB的红移光谱有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP1.1-BV（作为供体）的能量传递给BDFP3.1（作为受体）,从而提高720 nm处的荧光亮度。同时将嵌合体BDFP1.1:3.1:1.1融合不同目的蛋白进行荧光标记,无论在原核细胞还是真核哺乳动物细胞中都能产生明亮的荧光。在BDFP1.1:3.1:1.1三联嵌合体的启发下,紧接着我们又设计了两个新的三联嵌合体,分别是BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6。它们的发射波长在670 nm,在哺乳动物细胞中表达时荧光亮度极高,而且以单体形式存在。BDFP3.3是由BDFP3非共价结合色素PEB得到的,它是一个明亮的红色荧光蛋白,吸收峰在608 nm,荧光峰在619 nm,且荧光量子产率可达到66%。因为哺乳动物细胞中只存在胆绿素BV,所以在动物细胞中表达时,色素PEB需要外部添加才能与BDFP3结合产生荧光。对于色素PEB的获取,可采用胰蛋白酶水解BDFP3.3的方式来替代色素PEB的萃取。BDFP1.2和BDFP1.6是由ApcF2衍生而来,可共价结合胆绿素BV。对于BDFP1.2:3.3:1.2来说,本实验将BDFP1.2共价结合BV的红移光谱和BDFP3非共价结合PEB的荧光亮度有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP3.3（作为供体）的能量传递给BDFP1.2-BV（作为受体）,从而提高670 nm处的荧光亮度。BDFP1.6:3.3:1.6的设计理念与之相同。BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6与目的蛋白融合进行荧光标记,可以进行很好的超分辨SIM成像。作为藻胆蛋白荧光探针,首次实现了红光与远红光的双色成像,同时利用嵌合方式增加细胞亮度的方法也为开发更多优良的荧光蛋白提供了新思路。BDFPs是由远红光诱导的蓝藻Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203的别藻蓝蛋白β亚基ApcF2进化而来的,它们可以共价结合胆绿素BV产生远红光和近红外两种类型的荧光。其中远红光BDFPs的最大发射波长在670 nm,近红外BDFPs的最大发射波长为710 nm。BDFPs具有分子量小、可溶性高且光谱红移等优点,是开发出优良近红外荧光探针的理想模板。以N端缺失20-31aa的BDFP1.2为分子进化模板,我们获得了一个远红光荧光蛋白突变体并得到了解析。它的晶体结构显示一个BV发色团与Cys72和Cys82双共价结合。基于晶体结构,我们进一步优化了一系列新的单体化远红光和近红外荧光蛋白BDFPs,这些新开发的单体化BDFPs比之前报道的远红光和近红外单体荧光蛋白要亮得多,更适合作为荧光探针用于生物标记。
常宇鑫[2]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中指出研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
刘云[3]（2021）在《hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析》文中进行了进一步梳理目的:1.用pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析慢病毒对三种不同来源人间充质干细胞的转导效率。2.将成功标记绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续传代培养,分析传代培养对绿色荧光蛋白基因阳性的细胞形态及荧光表达的影响。3.测定荧光蛋白标记前后的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖、分化及细胞表型,分析慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对人间充质干细胞增殖、分化及细胞表型的影响,为后续干细胞体内示踪奠定基础。方法:1.用相同MOI值pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测三种不同来源人间充质干细胞的慢病毒转导效率。2.将标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养传代,观察细胞形态的变化和绿色荧光蛋白基因的表达,流式细胞仪检测细胞增殖10代后绿色荧光蛋白阳性细胞的比例。3.对绿色荧光蛋白标记前后的细胞用CCK-8法测定细胞增殖情况,用定向诱导分化培养液进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色液分别对分化后的细胞染色,流式细胞仪测定标记前后细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR的表达。结果:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率存在明显差异,且差异具有显着统计学意义（P<0.01）。结果显示,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞慢病毒转导效率最高,其次是人脐带间充质干细胞,人脂肪间充质干细胞转导效率最低。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代,倒置荧光显微镜下仍然可见几乎所有细胞均带有绿色荧光。自然光线下可见细胞贴壁成梭形,胞质丰富,细胞整体成漩涡状生长,均保持了正常良好的细胞形态,与同代数未转导干细胞比较无明显差异。3.标记有绿色荧光蛋白的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖曲线和未标记细胞相近,在450nm波长下测得的OD值无统计学差异（P>0.05）,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞标记绿色荧光蛋白基因后依然能分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,流式细胞仪测定表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95%以上,CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达（<0.2%）。与同代数未转导干细胞表面抗原表达结果一致。结论:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率有显着差异（P<0.01）,分析可能与间充质干细胞来源的不同或细胞增殖力差异等有关。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代后细胞形态正常,且绿色荧光蛋白的表达未衰减,提示绿色荧光蛋白基因可在细胞内长期稳定表达,适用于干细胞的长期标记。3.慢病毒GFP基因转导对人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的生长增殖、分化及细胞表型无不良影响,表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对细胞无毒害,且可在细胞内稳定表达,是一种理想的干细胞标记方法。
常瑞[4]（2021）在《原核表达dsRNA提取方法效果评价及稳定性分析》文中研究表明原核诱导表达dsRNA在有害生物防治领域具有潜在应用价值。通过原核诱导发酵产生dsRNA成本低廉,但表达dsRNA浓度、产量无法衡量,使得该方法在鞘翅目昆虫基因功能研究中还存在不足;dsRNA易受核酸酶降解,使得其稳定性以及降解检测技术研究有待丰富。因此,本研究以720bp绿色荧光蛋白（GFP）为模板,构建不同长度、不同GC含量的p ET-2p-dsgfp、L4440-dsgfp表达载体;其次以体外合成dsgfp为对照,比较分析4种方法提取dsgfp纯度,运用内标混合纯dsgfp法计算提取方法损失率、分析p ET-2p-dsgfp以及L4440-dsgfp表达量以初步确定dsgfp的最佳提取方法和相对最优表达载体;最后对室温环境下EP管静置、马铃薯叶片涂抹dsgfp降解产物进行电泳灰度分析以及Chip-seq测序技术以获得相对稳定的dsgfp。主要研究内容与结果如下:1、人工合成了5组目的片段分别为:201bp长度的30%GC含量的GFP（简称201-30GC,下同）、201-50GC、423-30GC、423-50GC、423-70GC。将其分别克隆至p ET-2p、L4440载体,获得p ET-2p-dsgfp以及L4440-dsgfp表达载体,灰度分析发现p ET-2p-dsgfp表达量高于L4440-dsgfp。2、以体外合成dagfp为空白对照进行多重方差分析,其中提取纯度最高的是Trizol法和酚氯仿法,A260/A280、A260/A230均值分别可达1.83、1.79;1.78、2.1;运用内标混合纯dsRNA方法检测Trizol法、酚氯仿法、RNA-easy提取液和75%酒精沉淀法的损失率分别为23.88%、21.44%、32.3%和37.62%;用酚氯仿法分别提取1ml诱导菌液发现两种载体表达同一dsgfp浓度具有显着差异（P<0.05）,p ET-2p-dsgfp和L4440-dsgfp可分别诱导发酵产生8.7～24.39μg/ml、7.48～22.47μg/ml dsgfp。进一步说明p ET-2p-dsgfp表达能力高于L4440-dsgfp。3、室温环境下单因素方差统计得出423-70GC较稳定。运用Chip-seq技术测序发现423-70GC成功比对序列百分比为1794109（3.37%）、平均比对质量分数为40.23均优于其他dsgfp,进一步表明423-70GC稳定性最好。
刘爱学[5]（2021）在《帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探》文中提出帕金森病（PD）是以投射到纹状体的黑质多巴胺能神经元进行性死亡缺失,导致纹状体中多巴胺水平下降,从而引起以运动障碍为典型临床症状和以α-突触核蛋白发生病理性聚集为特征病变的神经退行性疾病,PD的特征性病变是细胞内路易小体（Lewybodies,LBs）和路易突起（Lewyneurites,LNs）的形成。然而,一直以来,这种特征性病变只能在PD患者或PD模型的死后尸检中,通过病理染色的方法得以确认。目前尚无能够在活细胞或活体状态下,报告路易病小体的分子工具,用于实时观测细胞由健康状态转变成病理状态的发生发展过程,以及在单细胞水平,研究α-突触核蛋白的病理性聚集和细胞状态之间的关系,因此,极大的限制了 PD的研究进程。为此,在该研究中,我们通过融合表达α-突触核蛋白和荧光蛋白（EGFP或tdTomato）,同时结合α-Syn PFFs,开发出在活细胞或活体状态下实时报告α-突触核蛋白病理性聚集的工具,并准备借助单细胞前沿技术,比如脑片电生理技术,单细胞测序技术和单细胞代谢组技术,可以深入比较分析形成α-突触核蛋白病理性聚集的细胞和未形成病理性聚集的细胞,在生理性质,基因表达和代谢小分子方面的差异。为深入探究路易小体的形成和细胞在基因分子水平的变化提供了强有力的工具,同时也为PD的研究工作开辟了新的路径。此外,α-突触核蛋白在散发性和家族性PD的病理进程中都扮演着重要作用。遗传学研究发现,编码α-突触核蛋白的基因拷贝数增加,引起的内源性α-突触核蛋白水平升高,是导致早发性家族性PD的直接原因。α-突触核蛋白基因突变也是导致家族性PD的另一直接原因。病理学研究发现,PD的特征性病理变化,即路易小体（Lewy bodies,LBs）和路易突起（Lewy neurites,LNs）,包含α-突触核蛋白的病理性聚集。因此,靶向α-突触核蛋白是一种潜在的PD治疗手段。在该研究中,我们借助一种强大的中枢神经系统基因投递工具,即跨血脑屏障AAV/PHP.eB病毒,同时结合RNAi和CRISPR/Cas9技术分别靶向α-突触核蛋白的转录和编码基因,成功实现全脑范围内α-突触核蛋白表达水平的下调,进而达到延缓和改善PD模型的运动症状和病理变化,为将来临床开展,以靶向α-突触核蛋白为靶标的基因疗法奠定重要基础。因此,在该研究中,通过聚焦α-突触核蛋白,我们不仅开发了 PD路易小体的可视化工具,同时开创了非侵入式基因治疗在PD小鼠模型中的应用,为PD的基础研究和临床治疗提供了新的视角。
周妮[6]（2021）在《家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化》文中进行了进一步梳理微孢子虫（microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞病原真菌。其宿主范围广泛,几乎能感染所有动物包括人类。第一种被报道的微孢子虫是家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）,距今已经150多年的历史。其感染家蚕后能够水平传播和经卵垂直传播,导致后代大面积死亡,严重影响了蚕业的发展。近年来,随着分子生物学的发展,微孢子虫的基因组研究发展迅速。目前已经完成了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）、蝗虫微孢子虫（Nosema locustae）、家蚕微粒子虫等多种微孢子虫的全基因组测序。微孢子虫的研究已经进入后基因组时代了,深入研究微孢子虫的基因功能尤为重要。目前,微孢子虫基因功能的研究只能通过同源性分析预测基因功能以及体外实验研究,缺乏体内研究证据。并且微粒子虫的大部分基因与其它生物几乎没有同源性,我们无法对其研究。正是因为缺乏有效的遗传操作体系,极大的限制了对家蚕微粒子虫的研究,导致了微粒子虫研究瓶颈。因此亟需建立有效的家蚕微粒子虫遗传操作体系。而此系统的瓶颈之一在于缺少可用的转化子筛选药物与特异的筛选标记,这极大的限制了其遗传操作系统的效率。因此,本研究在实验室前期工作的基础上,通过探索外源基因的转染方法、优化转基因载体元件和建立高效的药物筛选富集系统,从这三个方面进行探究对遗传操作体系进行优化,为建立高效的遗传操作体系奠定基础,提供新的方法。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子虫外源基因转染方法及时期的研究本研究首先选用家蚕肌动蛋白A3基因启动子,结合带有piggyBac转座子的载体,构建了pBac-[IE2-HK]-[A3-EGFP]载体。并制备了不同N/P值的HTCC/pDNA复合物,确定制备复合体的配方,并探索了季铵化壳聚糖（HTCC）介导转染家蚕微粒子虫的方法。随后利用脂质体法和HTCC法分别进行转染,将质粒导入家蚕微粒子虫成熟孢子中,添至宿主细胞中进行培养,在转染9天后两种方法都观察到了发出绿色荧光的孢子。分别采用脂质法和HTCC法,在不同的时期对感染家蚕微粒子虫的宿主细胞进行转染,发现脂质体转染组,在感染0 h和12 h观察到了绿色荧光孢子,HTCC转染组均未观察到绿色荧光孢子。以上研究结果表明,通过脂质体法转染家蚕微粒子虫成熟孢子,导入外源基因是可行的,转染最佳时期为微粒子虫侵染细胞后0 h-12 h内;HTCC法转染感染家蚕微粒子虫的宿主细胞的最佳时期仍不确定,且现阶段转染家蚕微粒子虫成熟孢子的效果不稳定。2.家蚕微粒子虫转化子药物筛选体系的建立为了便于从数量庞大的家蚕微粒子虫中快速筛选富集到转化子,本研究建立了药物筛选富集系统。实验室前期对巴龙霉素、多菌灵等药物进行了筛选,但没有获得能有效抑制家蚕微粒子虫增殖并能筛选出转化子的药物。在此基础上,本研究根据微孢子虫胞内寄生的特点,初步选择了红霉素（Erythromycin）、土霉素（Oxytetracycline）、壮观霉素（Spectinomycin）、G418（G418 sulfate）、硫链丝菌素（Thiostrepton）、潮霉素（Hygromycin B）、烟曲霉素（Fumagillin）等不同作用机制的药物,设计了不同浓度梯度进行了宿主细胞毒性评估,确定了最大安全浓度,并且评估了它们抑制微孢子虫增殖的能力。最终结果表明G418、壮观霉素和烟曲霉素在可用浓度范围内,能够有效抑制家蚕微粒子虫增殖。随后分别构建了含有对应抗性基因的三种转基因载体,对家蚕微粒子虫转染并在宿主细胞中进行药物筛选培养。通过qPCR检测抗性基因的表达量以及家蚕微粒子虫β-tubulin基因的表达量来评估突变体的筛选效果,发现烟曲霉素可用于筛选转化子。以上研究结果首次表明,来自酵母菌的甲硫氨酸氨肽酶I（MAPI）基因可以作为家蚕微粒子虫遗传操作体系的抗性基因,并可以利用烟曲霉素作为筛选药物来筛选转化子。3.家蚕微粒子虫转基因载体元件优化为了优化外源基因的表达水平,便于后续显微观察和药物筛选,对转基因载体元件进行优化。我们选择可以编码荧光强度更高的荧光蛋白基因（mNeonGreen）作为报告基因,以此来增强转化子的荧光强度。并结合实验室前期所得的家蚕微粒子虫侵染家蚕中肠早期的转录组数据,选定了10个家蚕微粒子虫中表达量较高的基因,通过qPCR确证出了其中4个表达量相对较高的基因。根据家蚕微粒子虫基因组数据库信息,对4个基因以及后期表达量极高的极管蛋白2,3的上游调控序列进行分析预测启动子序列,并分别克隆其启动子序列用于调控报告基因的表达。随后,构建了六个含有不同启动子的mNG荧光蛋白表达载体,通过脂质体转染将载体导入受体中。结果显示,目的基因有转录,但未能观察到绿色荧光的家蚕微粒子,后续研究将进一步筛选其他适用的强启动子。
高德煜[7]（2021）在《转基因CX3CR1-GFP小鼠活体成像评价生物材料的初步研究》文中认为生物材料应用于修复重建人体组织器官,可以恢复和增进人体生理功能。目前主要采用的体内植入实验,通过组织病理学实验结果进行生物材料的相容性评价,耗时长,实验繁琐并且存在评价者的主观因素。小动物活体成像技术具有操作简便,耗时短,试验结果客观等优点,可以在细胞、分子水平上对生物学行为进行长期的跟踪观察,已经广泛的应用在医学、生命科学等领域,但是未见在医疗器械生物材料生物相容性评价方面应用。研究目的:探究绿色荧光蛋白标记转基因小鼠的活体成像法评价生物材料的生物相容性的可行性。主要研究内容如下:1、研究方法:通过传统方法对脱细胞真皮和涤纶补片的生物相容性进行评价:选用c57小鼠为试验动物,按照国标GB16886.6将脱细胞真皮和涤纶补片分别进行皮下植入,并通过组织病理学HE染色和免疫组化对生物材料进行生物相容性评价。研究结果:显示脱细胞真皮材料炎症反应较轻并且持续时间较短,前两周存在较多巨噬细胞,涤纶补片炎症反应较重并且持续时间较长,巨噬细胞第一周至第四周均较多。研究方法:采用活体成像技术评价生物材料生物相容性方法的可行性:选用荧光标记CX3CR1-GFP转基因小鼠为试验动物,分别将脱细胞真皮和涤纶补片进行皮下植入,以小动物活体成像仪进行检测,同时进行组织病理实验冰冻切片进行验证,并将结果与HE染色和免疫组化结果进行对比。研究结果:活体成像结果与HE染色和免疫组化结果基本一致。2、研究结论:通过活体成像技术对生物材料进行生物相容性评价具有可行性。本文研究表明,利用荧光标记的转基因小鼠活体成像法可以作为评价生物材料的新方法,值得进一步研究和推广。
李志伟[8]（2020）在《茶树炭疽病原菌的绿色荧光蛋白基因标记及其侵染研究》文中进行了进一步梳理茶Camellia sinensis（L.）O.Ktze.,是常绿双子叶木本植物,茶起源于中国,传播至全世界,成为世界人们喜爱的健康饮品之一。其中茶炭疽病是茶树上的叶部病害之一,炭疽菌属（Colletotrichum Corda）是分生孢子盘具有刚毛的全球性分布的植物病原菌,在茶树上发生严重时则会导致茶叶品质和质量的下降,造成一定的经济损失,因此炭疽菌在植物病原菌中占有较重要的地位。真菌侵入寄主的机制主要分为直接侵入,自然孔口（气孔,排水孔,皮孔,柱头,蜜腺等）,伤口侵入,还有些病原菌先侵入坏死组织中,生活与繁殖一段时间再侵染健康叶片。Green fluorescent protein（GFP）标记茶树上的病原菌研究及其侵染茶叶的途径未见报道,本文主要通过对茶叶胶孢炭疽菌GFP标记,对其侵染茶叶展开一系列研究。主要研究如下:1.茶园采集茶树上的炭疽菌症状的叶部病害,经过组织分离,纯化培养,分离菌株致病性测定表明其具有致病性,形态鉴定结合分子构建多基因（ITS、ACT、CAL、CHS-1、TUB2、GAPDH）系统发育树鉴定GZCC20-0218为一株胶孢炭疽菌。2.供试菌胶孢炭疽菌经过潮霉素（HygB）的抗性测定后得出潮霉素浓度为450μg/ml可以作为GFP标记的转化子菌株的初筛选浓度。本研究在0.2 M乙酰丁香酮、农杆菌菌液OD600达到0.50.6范围、分生孢子悬浮液浓度为106spores/ml等条件下,根癌农杆菌与供试菌在乙酰丁香酮（AS）诱导培养下得到转化子,转化子在荧光显微镜检测荧光现象,PCR扩增潮霉素特异性的引物得到的产物进行电泳检测,荧光蛋白在供试菌株里成功的表达。转化子连续培养67代后对转化子的GFP遗传稳定性测定后,从而获得稳定遗传的GFP标记菌株。3.比较GFP标记菌株和GZCC20-0218供试菌的生物学特性,两者的菌株形态特征,并借助SAS分析软件,得出在P=0.05水平上表明两者平均生长速度无显着性差异。同时,GFP标记菌株仍具有致病性。4.获得稳定遗传的GFP标记菌株进行侵染活体茶苗的试验,7 d之后发病率达到100%。发病叶片进行组织切片观察,发现胶孢炭疽菌的分生孢子可以在叶片的气孔和叶片组织内定殖。
马雁[9]（2020）在《自诱导型启动子PsrfA在大肠杆菌及乳酸菌中表达适应性的研究》文中研究说明乳酸菌表达系统最突出的特点是宿主菌为公认的食品级微生物,有着长期用于食品的悠久历史,属于食品级表达系统;大肠杆菌具有遗传背景清楚、操作简单等优点,因此这两种原核微生物都是广泛用于基因工程的宿主菌。利用枯草芽孢杆菌来源的自诱导型启动子PsrfA构建枯草芽孢杆菌表达系统,可实现多种异源蛋白的高效表达。因此,为利用乳酸菌及大肠杆菌表达宿主的优势,开发基于启动子PsrfA的大肠杆菌及乳酸菌表达系统,本论文构建了含PsrfA的大肠-乳酸菌穿梭载体,转入大肠杆菌及乳酸菌,研究PsrfA对宿主及目的蛋白的表达适用性、不同因素对启动子表达活性的影响及表达系统的应用。主要研究内容如下:（1）构建大肠杆菌表达系统。以荧光蛋白GFP和β-半乳糖苷酶为报告基因,分别连入启动子PsrfA下游,构建表达载体后分别转入E.coli JM109和E.coli BL21后检测报告蛋白的表达。对含GFP为报告蛋白的重组菌,通过激光扫描共聚焦显微镜观察、荧光强度检测及SDS-PAGE分析,启动子PsrfA在重组E.coli JM109和E.coli BL21中均能表达荧光蛋白GFP;将启动子PsrfA的核心区-10区（TAAACT）突变为保守序列（TATAAT）后,GFP在重组E.coli JM109和E coli BL21中的表达量分别提高了 5.6倍和2.8倍。对重组菌发酵上清进行检测,四株重组菌发酵上清中均能检测到荧光强度和对应的蛋白条带,其中E.coli BL21-02的发酵上清中检测到的荧光蛋白GFP的表达量最高为24449.91。对含β-半乳糖苷酶为报告蛋白的重组菌,通过检测β-半乳糖苷酶酶活及SDS-PAGE分析;启动子PsrfA均能在E.coli JM1 09和E.coli BL21中表达β-半乳糖苷酶,将启动子PsrfA的核心区-10区突变为保守序列后,β-半乳糖苷酶酶活的表达量在E.coli JM109和E.coli BL21中分别提高了 1.2倍和1.3倍。（2）启动子PsrfA在乳酸菌中表达特性的研究。将含有PsrfA-gfp的表达载体分别转入 Lactobacillus casei 5257,L.plantarum 97,L.fermentum 087,和Weissella confuse 10中,并改变培养基的碳源和氮源、培养基的初始pH和发酵过程中发酵液的pH,结果显示,启动子 PsrfA在 L.casei 5257、L.plantarum 97、L.fermentum 087 和 W.confusa 10中均能表达荧光蛋白GFP;不同碳源和氮源不仅影响菌体生长而且还可影响启动子PsrfA的表达活性,启动子PsrfA在以L.plantarum97为宿主、麦芽糖为碳源的培养基中荧光蛋白GFP的表达量最高;调节培养基的初始pH对启动子PsrfA的表达影响较低;在发酵过程中维持培养基的pH在4.5以上,启动子PsrfA在L.pantarum 97和L.casei 5257中的表达活性增强。（3）乳酸菌表达系统的应用。（a）利用PsrfA在L.plantarum 97和L.casei 5257表达NADH氧化酶来提高乳酸菌发酵液的pH。重组菌中检测到的NADH氧化酶酶活和发酵液pH均高于野生菌。对启动子PsrfA的核心保守区-35区、-10区、核糖体结合位点、抑制因子CodY结合位点等进行突变,结果表明,通过这几种方式对启动子PsrfA进行突变后,都能够提高重组乳酸菌表达NADH氧化酶,从而提高发酵液的pH。对启动子PsrfA的核心区-35和-10区同时进行突变后,培养15h时,测定L.plantarum 97-09表达NADH氧化酶的活力为42.65 U/mg,发酵液pH相比于对照L.plantarum 97提高了 0.32;测定L.casei 5257-09表达NADH氧化酶的活力为18.73 U/mg,发酵液pH相比于对照 L.casei 5257 提高了 0.20。（b）利用 PsrfA在L.plantarum 97 和L.casei 5257 表达枯草芽孢杆菌来源的漆酶CotA。结果显示,含PsrfA-cotA的重组菌L.plantarum 97-06和L.casei 5257-06均能够表达漆酶CotA且L.plantarum 97-06表达漆酶CotA的活力高于L.casei 5257-06;培养过程中调节发酵液的pH,L.plantarum 97-06表达的漆酶活力提高了 2.8倍,L.casei 5257-06表达的漆酶活力提高了 1.6倍。
邓宏华[10]（2020）在《基于重组荧光蛋白的生物传感和自组装研究》文中提出蛋白质是生物体的重要组成成分,也是细胞生理活动、分子进化以及疾病致病机制的关键元件。荧光蛋白可以自主发出荧光,具有基因编码性等特点,在生物示踪、传感和生物材料等生命科学领域中发挥着重要的作用。依托基因工程、蛋白质工程技术的迅速发展,对荧光蛋白的结构进行合理的设计和改造,能够赋予其新的信号开关性质和功能,拓宽其在生物传感和蛋白组装等方面的应用范围。表面重构是一项重要的蛋白质工程技术,利用此技术可以获得丰富多样、具有不同性质和功能的蛋白。通过表面重构获得的带有不同净电荷的超电荷绿色荧光蛋白（ScGFP）,不仅可以与核酸、多肽、聚合物和纳米材料等通过静电相互作用构建生物传感器,还可以触发不同生物分子之间的识别、组装,实现生物分子的传感分析以及结构组装。近红外荧光蛋白的背景荧光低、光散射弱、组织穿透能力强、光毒性小,能够有效避免复杂样品中生物分子的干扰,在生物传感和生物成像中具有巨大的优势,已经成为目前荧光分子成像的研究热点和发展趋势。但是到目前为止,近红外荧光蛋白的应用主要集中于生化过程、蛋白-蛋白相互作用和活体成像的研究,其在生物传感方面的研究尚待开发。本论文中,我们基于ScGFP和近红外荧光蛋白分别开展了如下生物传感和结构组装的研究:（1）基于ScGFP与功能多肽构建简单、通用的传感方法,用于caspase-3酶活性的检测分析。细胞凋亡关键酶caspase-3的活性测定可作为相关疾病研究和药物干预效果评价的重要指标。ScGFP作为信号报告分子,利用其和负电荷型功能多肽间的静电相互作用,发展了一种简单的“switch on”模式实现caspase-3酶活性检测的新方法。功能多肽D2包含N端连续的七个天冬氨酸D,中间caspase-3的底物识别位点DEVD,和C端带有Dabcyl淬灭基团的序列。在p H 7.4的条件下,多肽D2带有10个净负电荷。当将多肽和ScGFP在缓冲液中进行混合时,由于静电相互作用形成ScGFP/多肽复合物,进而拉近Dabcyl和ScGFP之间的距离。通过荧光共振能量转移,Dabcyl能够有效地淬灭ScGFP的荧光。当溶液中存在caspase-3时,caspase-3在DEVD位点处对该多肽进行识别并切割,从而释放带有淬灭基团Dabcyl的短肽GGK-Dabcyl。该短肽不带负电荷,不会与ScGFP相互靠近,其荧光信号得以恢复。这种方法具有较高的灵敏度、选择性,可以作为一个通用型的传感方法实现蛋白水解酶和疾病的检测分析。（2）新型ScGFP的设计、构建、表达及自组装研究。通过对表面氨基酸残基进行设计,开发了一个在GFP桶状结构的上端带有净正电荷（+15）和下端带有净负电荷（-10）的新型重组荧光蛋白pGFP。该蛋白保留GFP原有的折叠和光谱性质,具有很好的稳定性。通过对pGFP的自组装行为进行探究,发现通过盐离子浓度的改变可以可逆性地调节pGFP自组装。在低于500 m M Na Cl的溶液中,邻近的pGFP分子之间因静电相互作用会形成组装体。随着盐离子浓度的降低,pGFP会形成单分散的直径在数微米的组装体。形成组装体后,pGFP的吸光度增强,荧光强度增强～26%,荧光发射峰红移4 nm,这可能是因为pGFP分子的周围微环境发生了变化。因组装体内紧邻的pGFP分子间发生homo-FRET,其荧光各向异性值随着盐离子浓度的降低不断变小。这种蛋白设计的策略为蛋白表面重新改造设计提供了一种新思路。同时该蛋白质模块可控自组装成有序的微米结构,不仅提供了一种新型生物材料,还为研究自组装过程的动力学/热力学机制铺平了道路。（3）近红外荧光蛋白的克隆、表达、纯化及性质研究。利用全基因合成的方式分别获得携带m IFP和iRFP基因序列的质粒p UCK-mifp和p UCK-irfp,进一步构建用于原核表达的质粒p ET28-mifp和p ET28-irfp。在大肠杆菌中诱导表达目的基因,经亲和纯化获得高纯度的m IFP和iRFP。分别对m IFP和iRFP的吸收光谱和荧光发射光谱、p H稳定性等基本性质进行考察,发现这2个蛋白都能有效结合胆绿素,并出现m IFP和iRFP的特征吸收峰。其中Exm IFP为683 nm、Emm IFP为704 nm;ExiRFP为692 nm、EmiRFP为712 nm。此外,测定了它们的量子产率,Qym IFP为0.93,QyiRFP为0.68。而且m IFP在p H 6.5-9的范围内,iRFP在p H 6-9的范围内,它们的荧光都能保持80%以上。Cu2+、Zn2+、Hg2+、Ag+金属离子对m IFP和iRFP都具有很好的荧光淬灭响应。另外,我们也构建了用于真核表达的质粒pc DNA3.1-mifp和pc DNA 3.1-irfp,并实现了这2个蛋白在Hela细胞中的表达。在真核细胞中,m IFP、iRFP可以直接利用细胞内源性胆绿素,表明其在细胞成像等领域有较好的应用前景。（4）基于近红外荧光蛋白的生物矿化合成纳米颗粒及H2O2检测。以蛋白质为模板合成的纳米材料,因其反应条件温和、尺寸可控、功能多样等优点,在生物医药、生物传感等领域受到广泛关注。其中以蛋白为模板矿化合成的二氧化锰（Mn O2）纳米材料能够有效地避免水热法合成中强氧化剂和表面活性剂的使用,具有很好的生物相容性。我们选取近红外荧光蛋白iRFP为代表,将其作为蛋白模板成功矿化生成纳米颗粒（iRFP-Mn O2,iRMs）,并通过多种表征方法（TEM、DLS、XPS等）系统地研究了iRMs的物理化学性质。iRMs的尺寸约为36.0±15.8 nm,颗粒中具有相应的C 1s,N 1s,O 1s和Mn 2p所对应的特定能谱峰以及Mn（IV）2p3/2和Mn（IV）2p1/2相应的特征元素价态峰,表明锰元素在纳米颗粒中的化学价态为+4价。此外iRMs在300-800 nm处具有很强的光谱吸收,我们发现它可以能量转移的方式有效淬灭iRFP的近红外荧光。过氧化氢（H2O2）是广泛应用于临床和制药领域的重要的化学物质之一,同时其作为一种重要的活性氧,是多种生理过程的中间产物,浓度过高会引起细胞损伤,与阿尔茨海默病、心肌梗死以及癌症等多种疾病密切相关,因此开发新的方法策略用于H2O2的检测分析十分必要。在弱酸性条件下,H2O2将Mn O2还原生成锰离子(Mn2+),iRMs被分解并释放近红外荧光蛋白iRFP,恢复近红外荧光。基于此,iRMs可以实现H2O2的荧光“turn on”检测,检测限约为0.06 m M。同时iRMs展现出较好的H2O2选择性和优越的稳定性。（5）生物矿化合成的近红外荧光纳米探针实现全血中葡萄糖的直接检测。我们构建以近红外荧光蛋白iRFP和葡萄糖氧化酶（GOx）作为蛋白模板矿化生成葡萄糖响应型的近红外荧光探针iRFP-GOx-Mn O2（iRGMs）。同样地,iRGMs中iRFP的荧光以能量转移的方式被Mn O2有效淬灭。当iRGMs加入全血样品中,血糖可以被GOx催化转化为葡萄糖酸,同时原位生成H2O2。H2O2将Mn O2还原生成Mn2+,引起iRGMs的分解并释放iRFP,恢复近红外荧光。该近红外纳米颗粒展现出级联反应的高效率和近红外荧光信号的低背景干扰的优势,检测限为0.03m M、而且选择性十分优异,实现了全血样品中葡萄糖水平的快速准确分析。此外,我们还成功设计了基于iRGMs的纸基装置,只需5μL全血样品、无需任何预处理,就可以实现全血中葡萄糖的直接检测,为血糖水平的快速、准确检测提供了新策略。
二、绿色荧光蛋白应用的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绿色荧光蛋白应用的研究进展（论文提纲范文）
（1）高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 序言 |
| 1.1 蓝细菌的光合作用 |
| 1.1.1 藻胆体及其能量传递机制 |
| 1.1.2 藻胆蛋白 |
| 1.1.3 胆色素及其生物合成 |
| 1.1.4 藻胆蛋白的生物合成 |
| 1.1.5 连接蛋白 |
| 1.2 光敏色素 |
| 1.3 荧光蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 绿色荧光蛋白家族 |
| 1.3.2 橙红色荧光蛋白家族 |
| 1.3.3 结合胆绿素的近红外荧光蛋白 |
| 1.4 超分辨显微技术 |
| 1.5 本课题研究目的与意义 |
| 2 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的近红外荧光探针研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 培养基与试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 定点诱变和缺失诱变 |
| 2.3.2 制备感受态细胞 |
| 2.3.3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 吸收和荧光光谱的测定 |
| 2.3.5 摩尔消光系数、荧光量子产率及分子亮度的测定 |
| 2.3.6 序列比对 |
| 2.3.7 三维结构的模拟 |
| 2.3.8 色素的萃取 |
| 2.3.9 荧光寿命的测定 |
| 2.3.10 融合基因表达质粒的构建 |
| 2.3.11 融合基因标记质粒的构建 |
| 2.3.12 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 2.3.13 荧光蛋白在动物细胞内亮度的测定 |
| 2.3.14 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 2.3.15 蛋白pH稳定性的测定 |
| 2.3.16 蛋白热稳定性的测定 |
| 2.3.17 蛋白聚集态的体外分析 |
| 2.3.18 蛋白聚集态的体内分析 |
| 2.3.19 正置荧光显微镜对色素蛋白的成像 |
| 2.3.20 蛋白标记细胞的SIM成像 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 由ApcE2进化的可溶性藻胆蛋白BDFP3的获得 |
| 2.4.2 色素PФB制备产量的提高 |
| 2.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 2.4.4 BDFP1.1/1.2: BDFP3.1: BDFP1.1/1.2的荧光寿命的研究 |
| 2.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 2.4.6 融合蛋白聚集态的分析 |
| 2.4.7 融合蛋白稳定性的分析 |
| 2.4.8 融合蛋白在哺乳动物细胞中超分辨成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的远红光荧光探针研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 培养基与试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 吸收和荧光光谱的测定 |
| 3.3.3 蛋白光谱参数的计算 |
| 3.3.4 圆二色光谱的测定 |
| 3.3.5 荧光寿命的测定 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和染色 |
| 3.3.7 融合基因表达质粒的构建 |
| 3.3.8 融合基因标记质粒的构建 |
| 3.3.9 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 3.3.10 细胞内亮度的测定 |
| 3.3.11 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 3.3.12 色素蛋白的酶解 |
| 3.3.13 蛋白pH和热稳定性的测定 |
| 3.3.14 蛋白聚集态的体外分析 |
| 3.3.15 蛋白聚集态的体内分析 |
| 3.3.16 融合蛋白的SIM超分辨成像 |
| 3.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 可溶性BDFP3非共价结合PEB的研究 |
| 3.4.2 极亮的红色荧光蛋白BDFP3.3的获得 |
| 3.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 3.4.4 BDFP1.2/1.6: BDFP3.3: BDFP1.2/1.6的荧光寿命的研究 |
| 3.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 3.4.6 用BDFP3.3的酶解液代替游离的色素PEB |
| 3.4.7 BDFP3.3及其融合蛋白的聚集态分析 |
| 3.4.8 BDFP3.3及其融合蛋白的稳定性分析 |
| 3.4.9 BDFP3.3及其融合蛋白在哺乳动物细胞中标记成像 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 4 基于ApcF2的远红光单体高亮度荧光蛋白的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 培养基与试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 诱变体库的构建方法 |
| 4.3.2 诱变体的蛋白表达与纯化 |
| 4.3.3 诱变体的序列鉴定 |
| 4.3.4 蛋白的聚集态分析 |
| 4.3.5 蛋白的序列比对 |
| 4.3.6 三维结构的模拟 |
| 4.3.7 诱变体的结晶 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 远红光单体BDFPs的随机诱变筛选结果 |
| 4.4.2 诱变体的亮度分析 |
| 4.4.3 诱变体v9的晶体筛选 |
| 4.4.4 诱变体v9的晶体结构的分析 |
| 4.4.5 smURFP晶体结构的分析 |
| 4.4.6 基于诱变体v9晶体结构的BDFPs的优化 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 5 论文总结 |
| 5.1 本文小结 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建及转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒的包装 |
| 2.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建 |
| 3.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的转导效率 |
| 4 结论 |
| 第二部分 GFP+MSCs细胞系的建立及培养与传代 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GFP+MSCs的形态观察和GFP表达情况 |
| 2.2 GFP+MSCs的培养和传代 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GFP+MSCs细胞系的建立 |
| 3.2 GFP+MSCs的传代和培养 |
| 4 结论 |
| 第三部分 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记GFP基因前后特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 2.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化情况 |
| 2.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 3.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化能力评估 |
| 3.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型的表达情况 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 荧光蛋白法标记在间充质干细胞中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）原核表达dsRNA提取方法效果评价及稳定性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 绿色荧光蛋白 |
| 1.1.1 绿色荧光蛋白的发现 |
| 1.1.2 绿色荧光蛋白的结构与性质 |
| 1.1.3 绿色荧光蛋白的改进 |
| 1.1.4 绿色荧光蛋白的应用 |
| 1.2 双链RNA(dsRNA) |
| 1.2.1 dsRNA的开发 |
| 1.2.2 dsRNA的生产 |
| 1.2.3 dsRNA的稳定性 |
| 1.3 RNA干扰 |
| 1.3.1 RNAi原理 |
| 1.3.2 dsRNA的递送方式 |
| 1.3.3 基于dsRNA的 RNAi技术的应用 |
| 1.3.4 dsRNA病毒的检测方法 |
| 1.4 原核表达RNA提取方法概述 |
| 1.5 测序技术的发展 |
| 1.6 研究内容、目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究目的及意义 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 构建双链RNAdsRNA原核表达载体及其诱导表达 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 dsgfp基因设计合成 |
| 2.2.2 HT115(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 目的片段PCR扩增及回收 |
| 2.2.4 L4440载体与pET-2p载体线性化 |
| 2.2.5 L4440-gfp与 pET-2p-gfp重组载体的构建与转化 |
| 2.2.6 L4440-gfp与 pET-2p-gfp重组载体鉴定 |
| 2.2.7 L4440-dsgfp与 pET-2p-dsgfp表达载体的构建、转化 |
| 2.2.8 L4440-dsgfp与 pET-2p-dsgfp诱导表达 |
| 2.2.9 Image J灰度分析 |
| 2.2.10 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 目的片段PCR扩增 |
| 2.3.2 L4440载体与pET-2p载体线性化 |
| 2.3.3 L4440-gfp与 pET-2p重组质粒鉴定 |
| 2.3.4 L4440-dsgfp与 pET-2p-dsgfp表达载体转化 |
| 2.3.5 L4440-dsgfp与 pET-2p-dsgfp诱导表达 |
| 2.3.6 Image J灰度分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 4 种原核表达双链RNA的 dsRNA提取方法质量和效率比较 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 dsgfp的体外合成 |
| 3.2.2 Trizol法提取原核诱导表达dsgfp |
| 3.2.3 酚氯仿法提取原核诱导表达dsgfp |
| 3.2.4 RNA-easy提取液原核诱导表达dsgfp |
| 3.2.5 75%酒精沉淀法提取原核诱导表达dsgfp |
| 3.2.6 内标混合法检测提取方法损失率 |
| 3.2.7 检测pET-2p-dsgfp和 L4440-dsgfp产量 |
| 3.2.8 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 提取pET-2p-dsgfp质粒浓度检测 |
| 3.3.2 目的片段扩增及回收浓度检测 |
| 3.3.3 体外合成dsgfp |
| 3.3.4 体外合成dsgfp浓度、纯度检测 |
| 3.3.5 四种提取方法纯度统计分析 |
| 3.3.6 四种提取方法电泳检测 |
| 3.3.7 内标混合纯dsgfp检测损失率 |
| 3.3.8 基于pET-2p、L4440 表达dsgfp产量分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 dsgfp在室温下的降解程度研究及Chip-seq分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 dsgfp室温放置 |
| 4.2.2 电泳检测 |
| 4.2.3 Image灰度分析 |
| 4.2.4 室温放置dsgfp的 Chip-seq分析 |
| 4.2.5 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 dsgfp放置电泳 |
| 4.3.2 Image J灰度分析 |
| 4.3.3 室温放置dsgfp的 Chip-seq分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 构建原核表达dsgfp载体 |
| 5.2 不同方法提取原核诱导表达dsRNA |
| 5.3 dsgfp室温放置 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（5）帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 PD的历史简介 |
| 1.2 PD患者的临床症状 |
| 1.3 PD的特征性病理变化 |
| 1.4 散发性PD患者的病理分期 |
| 1.5 α-突触核蛋白 |
| 1.5.1 α-突触核蛋白的发现 |
| 1.5.2 α-突触核蛋白的结构 |
| 1.5.3 α-突触核蛋白的功能 |
| 1.6 α-突触核蛋白和神经退行性疾病 |
| 1.7 α-突触核蛋白的传播 |
| 1.8 PD实验动物模型简介 |
| 1.8.1 6-OHDA诱导的PD模型 |
| 1.8.2 MPTP诱导的PD模型 |
| 1.8.3 Rotenone诱导的PD模型 |
| 1.8.4 α-突触核蛋白过表达转基因动物PD模型 |
| 1.8.5 AAV过表达α-突触核蛋白诱导的PD模型 |
| 1.8.6 α-Syn PFFs诱导的PD模型及相关研究进展 |
| 1.9 PD的临床诊断 |
| 1.10 PD的临床治疗 |
| 1.10.1 药物疗法 |
| 1.10.2 手术疗法 |
| 1.11 PD治疗的研究进展 |
| 1.11.1 靶向α-突触核蛋白的表达水平 |
| 1.11.2 调控底丘脑核的神经活动 |
| 1.12 单细胞技术在神经科学研究中的应用 |
| 1.12.1 单细胞转录组学研究技术 |
| 1.12.2 单细胞代谢组学研究技术 |
| 1.13 RNAi干扰技术 |
| 1.14 腺相关病毒基因投递技术 |
| 1.15 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.16 本论文主要关注的科学问题 |
| 1.16.1 路易小体可视化工具的开发 |
| 1.16.2 靶向α-突触核蛋白的基因治疗探索 |
| 第2章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器和耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.4.2 α-Syn PFFs的制备 |
| 2.4.3 原代神经元培养 |
| 2.4.4 慢病毒包装和感染 |
| 2.4.5 免疫印迹实验 |
| 2.4.6 细胞免疫化学 |
| 2.4.7 小鼠脑立体定位注射 |
| 2.4.8 小鼠尾静脉注射 |
| 2.4.9 小鼠心脏灌流 |
| 2.4.10 冰冻切片 |
| 2.4.11 免疫组织化学 |
| 2.4.12 脑片电生理 |
| 2.4.13 行为学测试 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 路易小体可视化工具的开发 |
| 3.1.1 α-Syn PFFs的制备和效率验证 |
| 3.1.2 α-Syn-EGFP载体构建和表达验证 |
| 3.1.3 α-Syn PFFs在in vitro条件下诱导融合蛋白中α-突触核蛋白聚集并伴随绿色荧光蛋白荧光增强 |
| 3.1.4 α-Syn PFFs在in vivo条件下诱导融合蛋白中α-突触核蛋白聚集并伴随绿色荧光蛋白荧光增强 |
| 3.1.5 LSL-α-Syn-6H-EGFP转基因小鼠的构建及验证 |
| 3.1.6 LSL-α-Syn-6H-tdT转基因小鼠的构建及验证 |
| 3.2 靶向α-突触核蛋白的基因疗法 |
| 3.2.1 α-突触核蛋白是路易小体和路易突起形成的必要条件 |
| 3.2.2 病理性PD小鼠模型 |
| 3.2.3 设计特异性靶向α-突触核蛋白的shRNA及效率验证 |
| 3.2.4 全脑范围内敲低α-Syn水平显着改善PD模型的运动障碍和病理变化 |
| 3.2.5 设计特异性靶向α-突触核蛋白基因的gRNA及效率验证 |
| 3.2.6 全脑范围内编辑α-Syn基因显着改善PD模型的运动障碍和病理变化 |
| 第4章 讨论和展望 |
| 4.1 利用膜片钳技术分析路易小体阳性细胞和路易小体阴性细胞的电生理性质差异 |
| 4.2 利用单细胞测序技术分析路易小体阳性细胞和路易小体阴性细胞的转录组差异 |
| 4.3 利用单细胞代谢组技术分析路易小体阳性细胞和阴性细胞的代谢小分子差异 |
| 4.4 利用双光子成像技术分析路易小体阳性细胞和阴性细胞的生理活动 |
| 第5章 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微孢子虫概述 |
| 1.1.1 微孢子虫的结构 |
| 1.1.2 微孢子虫的生活史 |
| 1.2 外源DNA导入方法的研究现状 |
| 1.2.1 外源DNA导入方法的类型 |
| 1.2.2 外源DNA导入方法在胞内寄生物中的应用 |
| 1.3 筛选标记 |
| 1.3.1 荧光基因类筛选标记 |
| 1.3.2 抗药基因类筛选标记 |
| 1.3.3 营养缺陷型与功能附加型类筛选标记 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 家蚕微粒子虫外源基因导入方法及时期的研究 |
| 2.2.2 家蚕微粒子虫转化子筛选体系的建立 |
| 2.2.3 家蚕微粒子虫转基因载体元件的优化 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕微粒子虫外源基因导入方法及时期的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕微粒子虫转基因载体的构建 |
| 3.2.2 HTCC介导转染体系的研究 |
| 3.2.3 外源基因的导入及荧光观察 |
| 3.2.4 转染感染家蚕微粒子虫的细胞及荧光观察 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 家蚕微粒子虫转化子药物筛选体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 抗性筛选药物的选择 |
| 4.2.2 细胞毒性评估 |
| 4.2.3 药物抑制家蚕微粒子虫增殖能力评估 |
| 4.2.4 抗性基因载体构建 |
| 4.2.5 药物筛选及抗性基因的可行性评估 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 家蚕微粒子虫转基因载体元件的优化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 工具软件 |
| 5.1.3 主要仪器及试剂 |
| 5.1.4 主要方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荧光报告基因选择与克隆 |
| 5.2.2 家蚕微粒子虫高表达启动子的筛选 |
| 5.2.3 高表达启动子分析及克隆 |
| 5.2.4 启动子调控报告基因的表达载体构建 |
| 5.2.5 外源基因的导入及荧光观察 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语表（Abbreviation） |
| 致谢 |
（7）转基因CX3CR1-GFP小鼠活体成像评价生物材料的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 生物材料及其研究概况 |
| 1.1.1 生物材料简介 |
| 1.1.2 生物材料基本属性 |
| 1.1.3 生物相容性 |
| 1.1.4 生物相容性评价实验 |
| 1.1.5 生物相容性评价标准 |
| 1.1.6 生物材料应用前景 |
| 1.2 生物相容性与炎症反应 |
| 1.2.1 创伤愈合修复过程 |
| 1.2.2 炎症反应过程 |
| 1.2.3 异物反应 |
| 1.2.4 单核细胞简介 |
| 1.2.5 巨噬细胞简介 |
| 1.3 生物标记研究 |
| 1.3.1 免疫检测分析技术 |
| 1.3.2 放射物标记免疫分析 |
| 1.3.3 发光免疫分析 |
| 1.3.4 有色标记免疫分析 |
| 1.3.5 免疫酶标记技术 |
| 1.3.6 免疫荧光标记技术 |
| 1.3.7 荧光标记物 |
| 1.4 小动物活体成像技术概述 |
| 1.4.1 小动物活体成像简介 |
| 1.4.2 小动物活体荧光成像技术 |
| 1.4.3 荧光成像的优缺点 |
| 1.4.4 国内外小动物活体成像技术研究现状 |
| 1.4.5 小动物活体成像发展趋势 |
| 1.5 绿色荧光蛋白GFP研究概述 |
| 1.5.1 绿色荧光蛋白GFP简介 |
| 1.5.2 绿色荧光蛋白GFP的应用 |
| 1.5.3 GFP荧光成像背景噪音 |
| 1.6 趋化因子及CX3CR1-GFP小鼠研究概况 |
| 1.6.1 趋化因子及其研究 |
| 1.6.2 CX3CR1-GFP小鼠简介 |
| 1.6.3 国内外CX3CR1-GFP小鼠研究现状 |
| 1.7 本文的研究背景、研究意义及研究内容 |
| 1.7.1 本文的研究背景及意义 |
| 1.7.2 本文的研究内容 |
| 2 生物材料生物相容性评价试验 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 生物材料试验样品 |
| 2.1.2 动物选择 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 材料皮下植入 |
| 2.2.2 组织学HE染色观察 |
| 2.2.3 免疫组织化学检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 生物材料吸收状态观察结果 |
| 2.3.2 HE染色组织病理结果 |
| 2.3.3 F4/80 免疫组化病理结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 活体成像评价生物相容性方法探究 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 生物材料试验样品 |
| 3.1.2 动物选择 |
| 3.1.3 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 材料皮下植入 |
| 3.2.2 活体成像观察 |
| 3.2.3 冰冻切片 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 活体成像结果 |
| 3.3.2 冰冻切片结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 1、生物材料的生物相容性评价 |
| 2、活体成像评价方法的探究 |
| 4.2 前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）茶树炭疽病原菌的绿色荧光蛋白基因标记及其侵染研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词列表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 茶树的起源与分布 |
| 2 茶的化学成分 |
| 3 茶叶的应用 |
| 3.1 茶在医药上的应用 |
| 3.2 茶叶在食品行业的应用 |
| 3.3 茶在观光旅游农业中的应用 |
| 4 茶炭疽病 |
| 4.1 茶炭疽病病原菌概述 |
| 4.2 胶孢炭疽菌的概述 |
| 4.3 茶树炭疽病的危害 |
| 4.4 茶树炭疽病危害症状 |
| 4.5 病害发生条件 |
| 4.6 病原菌与植物的相互作用 |
| 5 防治病害的方法 |
| 5.1 农业防治 |
| 5.2 物理防治 |
| 5.3 化学防治 |
| 5.4 生物防治 |
| 5.5 免疫诱抗法 |
| 6 绿色荧光蛋白的应用 |
| 6.1 ATMT介导的真菌转化的特点 |
| 6.2 根癌农杆菌介导的原理 |
| 7 研究目的及意义 |
| 8 技术路线 |
| 第二章 茶炭疽病的分离及鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验器材 |
| 1.3 试验所用培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样本采集 |
| 2.2 分离与纯化 |
| 2.3 形态观察 |
| 2.4 致病性测定 |
| 2.5 分子鉴定 |
| 2.5.1 提取GZCC20-0218的DNA |
| 2.5.2 基因选择和目的片段扩增 |
| 2.5.3 选择的目标基因及相应的引物 |
| 2.5.4 PCR扩增目的片段扩增 |
| 2.5.5 电泳检测 |
| 2.5.6 多基因系统发育树的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 形态分析 |
| 3.2 多基因系统学分析 |
| 3.3 GZCC20-0218致病分析 |
| 4 GZCC20-0218对Hyg B的敏感度 |
| 第三章 茶炭疽病的GFP转化及侵染观察 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验器材 |
| 1.3 试验所用培养基 |
| 1.4 试验所用试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 野生型茶炭疽菌孢子悬液制备 |
| 2.2 提取质粒DNA |
| 2.3 检测质粒中荧光蛋白 |
| 2.3.1 扩增潮霉素磷酸转移酶基因片段 |
| 2.3.2 凝胶电泳检测扩增的HygB产物 |
| 2.4 根癌农杆菌菌株psk2251的活化和诱导培养 |
| 2.5 根癌农杆菌psk2251与真菌共培养及遗传转化 |
| 2.6 荧光显微镜检测转化子 |
| 2.7 转化子荧光稳定遗传测定 |
| 2.8 转化子验证 |
| 2.8.1 扩增潮霉素磷酸转移酶基因验证转化子的绿色荧光蛋白 |
| 2.9 GZCC20-0218与转化子生物学特性对比 |
| 2.9.1 转化子致病性测定 |
| 3 GFP标记菌侵染与定殖 |
| 3.1 茶籽育苗 |
| 3.2 栽培一年生茶苗 |
| 3.3 接种试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 检测质粒中荧光蛋白分析 |
| 4.2 荧光显微镜检测转化子分析 |
| 4.3 转化子荧光稳定遗传测定分析 |
| 4.4 转化子验证分析 |
| 4.5 GZCC20-0218与转化子对比分析 |
| 4.5.1 GZCC20-0218和转化子的菌落及孢子形态特征 |
| 4.5.2 GZCC20-0218和转化子生长速度对比 |
| 4.5.3 转化子致病测试分析 |
| 5 GFP标记菌侵染与定殖分析 |
| 5.1 离体接种分析 |
| 6 活体茶苗接种试验结果与分析 |
| 7 组织切片观察结果与分析 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 3 创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 硕士期间发表论文 |
（9）自诱导型启动子PsrfA在大肠杆菌及乳酸菌中表达适应性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微生物表达系统 |
| 1.1.1 原核微生物表达系统 |
| 1.1.2 真核微生物表达系统 |
| 1.2 乳酸菌表达系统及其应用 |
| 1.2.1 乳酸菌表达系统概述 |
| 1.2.2 乳酸菌表达系统的调控元件 |
| 1.3 研究的意义及内容 |
| 第2章 大肠杆菌表达系统的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和主要仪器 |
| 2.1.3 培养基和缓冲液 |
| 2.2 重组蛋白的克隆和表达 |
| 2.2.1 细菌质粒及基因的提取 |
| 2.2.2 目的片段及载体的纯化 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.2.4 基因扩增 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.2.7 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 表达载体的构建 |
| 2.3.2 启动子P_(srfA)调控报告蛋白绿色荧光蛋白GFP在E.coli的表达 |
| 2.3.3 启动子P_(srfA)调控报告蛋白β-半乳糖苷酶在E.coli的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 乳酸菌表达系统的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 培养基和缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乳酸杆菌感受态的制备及转化 |
| 3.2.2 菌体培养 |
| 3.2.3 碳源和氮源对启动子活性的研究 |
| 3.2.4 不同pH对启动子活性的研究 |
| 3.2.5 荧光蛋白GFP的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组菌的构建 |
| 3.3.2 启动子P_(srfA)的表达宿主适应性 |
| 3.3.3 培养基成分对启动子P_(srfA)活性的影响 |
| 3.3.4 pH对启动子P_(srfA)活性的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于P_(srfA)乳酸菌表达系统的应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 培养基和缓冲液 |
| 4.2 重组蛋白的克隆和表达 |
| 4.2.1 细菌质粒及基因组的提取 |
| 4.2.2 目的基因及载体的纯化 |
| 4.2.3 大肠感受态的制备及转化 |
| 4.2.4 基因扩增 |
| 4.2.5 重组载体的构建 |
| 4.2.6 启动子序列改造 |
| 4.2.7 乳酸菌感受态的制备及转化 |
| 4.2.8 重组蛋白的表达 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 表达载体的构建 |
| 4.3.2 启动子P_(srfA)调控NADH氧化酶的表达控制发酵液pH |
| 4.3.3 P_(srfA)调控异源蛋白漆酶CotA在乳酸菌中的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）基于重组荧光蛋白的生物传感和自组装研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 荧光蛋白 |
| 1.1.1 荧光蛋白发展概述 |
| 1.1.2 荧光蛋白在生物传感器中的应用 |
| 1.2 近红外荧光蛋白 |
| 1.2.1 近红外荧光蛋白的概述 |
| 1.2.2 近红外荧光蛋白在生物传感器方面的应用 |
| 1.3 本文构思 |
| 第2章 基于超电荷荧光蛋白/多肽体系实现caspase-3 活性的检测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 培养基、溶液和缓冲液的配制 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.3.3 ScGFP的诱导表达和纯化 |
| 2.3.4 基于ScGFP/多肽平台检测caspase-3 的活性 |
| 2.3.5 细胞裂解液的准备 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 ScGFP用于检测caspase-3 活性的原理 |
| 2.4.2 ScGFP对 caspase-3 活性的荧光检测 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 基于静电相互作用的荧光蛋白自组装 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 溶液的配制 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 重组质粒PET28-pgfp的构建 |
| 3.2.5 pGFP的表达和纯化 |
| 3.2.6 pGFP的自组装 |
| 3.2.7 pGFP自组装体的表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 两端带有相反电荷的pGFP的设计 |
| 3.3.2 pGFP的基因克隆、原核表达和基本性质研究 |
| 3.3.3 pGFP自组装体的形成和表征 |
| 3.3.4 pGFP组装后的光谱性质变化 |
| 3.3.5 盐离子浓度调节pGFP的自组装 |
| 3.3.6 pGFP自组装后孵育时间的影响 |
| 3.3.7 pGFP组装前后进入细胞的情况 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 近红外荧光蛋白的表达及相关性质研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 溶液的配制 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组质粒pUCK-mifp和 pUCK-irfp的获得 |
| 4.3.2 重组质粒pET28-mifp和 pET28-irfp的构建 |
| 4.3.3 重组质粒pcDNA-3.1-mifp和 pcDNA-3.1-irfp的构建 |
| 4.3.4 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE |
| 4.3.5 mIFP 和 iRFP 的原核诱导表达和纯化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 构建重组质粒pET 28-mifp和 pET 28-irfp |
| 4.4.2 mIFP和 iRFP的原核表达纯化及其基本性质 |
| 4.4.3 构建重组质粒pcDNA-3.1-mifp和 pcDNA-3.1-irfp |
| 4.4.4 mIFP和 iRFP在真核细胞中的表达 |
| 4.4.5 mIFP和 iRFP对 BV的荧光响应 |
| 4.4.6 金属离子对mIFP和 iRFP荧光的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 基于近红外荧光蛋白的生物矿化合成纳米颗粒的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和仪器 |
| 5.2.2 iRFP的表达和纯化 |
| 5.2.3 iRMs纳米材料的合成 |
| 5.2.4 过氧化氢的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 iRMs纳米颗粒的生物矿化合成和表征 |
| 5.3.2 iRMs纳米颗粒的淬灭性质 |
| 5.3.3 H_2O_2诱导的iRMs纳米颗粒的荧光恢复 |
| 5.3.4 iRMs纳米颗粒检测H_2O_2 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 生物矿化合成的近红外荧光纳米探针实现全血中葡萄糖的直接检测 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂和仪器 |
| 6.2.2 iRGMs纳米材料的合成 |
| 6.2.3 葡萄糖的检测 |
| 6.2.4 实际样品中葡萄糖的检测和成像 |
| 6.2.5 葡萄糖纸基的制备和检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 iRGMs纳米颗粒的生物矿化合成和表征 |
| 6.3.2 iRGMs对葡萄糖的近红外荧光响应 |
| 6.3.3 iRGMs用于直接检测全血样品中的葡萄糖 |
| 6.3.4 iRGMs纸基装置用于检测全血样品中的葡萄糖 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、绿色荧光蛋白应用的研究进展（论文参考文献）
- [1]高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究[D]. 侯亚男. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [3]hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析[D]. 刘云. 山西医科大学, 2021(01)
- [4]原核表达dsRNA提取方法效果评价及稳定性分析[D]. 常瑞. 喀什大学, 2021
- [5]帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探[D]. 刘爱学. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化[D]. 周妮. 西南大学, 2021(01)
- [7]转基因CX3CR1-GFP小鼠活体成像评价生物材料的初步研究[D]. 高德煜. 烟台大学, 2021(11)
- [8]茶树炭疽病原菌的绿色荧光蛋白基因标记及其侵染研究[D]. 李志伟. 贵州大学, 2020(01)
- [9]自诱导型启动子PsrfA在大肠杆菌及乳酸菌中表达适应性的研究[D]. 马雁. 扬州大学, 2020(04)
- [10]基于重组荧光蛋白的生物传感和自组装研究[D]. 邓宏华. 湖南大学, 2020(08)
标签：荧光蛋白论文; 荧光共振能量转移论文; 基因合成论文; 荧光强度论文; 荧光淬灭论文;