一、奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建（论文文献综述）
华荣茂[1]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中研究指明促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
任艳萍,雷小灿,谢亮亮,罗婵,刘晓华,石德顺,李湘萍[2]（2016）在《乳腺特异性表达催乳素基因载体的构建与检测》文中进行了进一步梳理催乳素（prolactin,PRL）可通过PRL-PRLR-JAK/STAT信号通路促进乳腺发育,启动并维持泌乳。为了探讨调控PRL基因表达对奶水牛产奶量的影响,该研究构建了乳腺特异性表达PRL基因的核移植载体并检测了其有效性。首先,利用RT-PCR方法克隆得到804 bp的水牛PRL基因编码区;而后逐步采用酶切加连接方法,依次将PRL基因、β-酪蛋白（β-casein,BCN）启动子和标记基因插入p IFN-BCNpoly A质粒中,构建得到14.2 Kb的转PRL基因载体。将表达载体瞬时转染人Bcap-37细胞系,经RT-PCR检测发现,目的基因PRL可在该细胞系中表达。将该载体转入水牛胎儿成纤维细胞中,通过核移植法获得了转PRL基因水牛克隆胚胎。该文结果表明,所构建的PRL核移植载体可表达PRL基因,并可用于生产转PRL基因克隆水牛胚胎。
李婥,杨春艳,尚江华,郑海英,黄芬香[3]（2015）在《我国水牛繁殖生物技术研究进展》文中认为水牛适应和抗病力性强、耐高温高湿、耐粗饲、易饲养、使用年限长,非常适合我国南方的饲料资源和气候条件,而且水牛奶营养丰富,现今我国正致力于发展水牛奶业。引入的河流型水牛,体格大,生长快速,产奶量高,与本地水牛杂交后代的奶水牛产奶量达到12002000kg,可显着提高本地水牛的产奶性能。但由于水牛的繁殖性能低下,我国水牛杂交改良面临着良种种源匮乏的问题,要突破这个瓶颈,必须集成现代动物繁殖技术（如人工授精、超数排卵、体外胚胎生产、核移植、转基因和胚胎移植等技术）,
王锦[4]（2013）在《水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究》文中进行了进一步梳理水牛是中国南方极具开发潜力的主要家畜,具有耐粗饲、乳品品质好等优点。但由于我国本地水牛产奶性能低下,致使奶水牛产业的发展缓慢。因此,如何应用现代生物技术培育出高产奶量的水牛新品种是目前要解决的主要问题。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,寻找差异表达基因,研究水牛的泌乳机制,并为培育高产奶量的转基因水牛提供丰富的候选基因素材；然后,探索转座子系统在水牛转基因中的应用,以期提高水牛转基因的效率；构建了乳腺特异性生长激素基因（GH）转基因表达载体,在乳腺细胞和乳腺组织中进行检测,分析外源GH基因的表达对乳蛋白等基因表达的影响；最后,采用随机整合、转座子主动整合等转基因技术将重组GH基因导入水牛基因组,生产GH转基因的水牛胚胎,以期培育出高产奶量转基因水牛新品种。本研究取得的主要结果总结如下：1.水牛泌乳期与非泌乳期基因表达谱及差异表达分析。构建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,分析差异表达和泌乳期高丰度表达的基因,探讨水牛泌乳的分子机制,也为转基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特异性表达启动子。基因表达谱序列拼接后获得114,014个单一的Unigenes,与牛的基因组信息比对注释了30290个基因,可以定位到270条相应的通路上（pathway）,其中与乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代谢通路相关基因表达丰度较高。在泌乳期乳腺组织中特异性表达的基因有3053个,占到所有基因序列的2.68%。比较水牛乳腺两个时期基因表达量,泌乳期表达量上调的基因有1390个,下调的基因有5851个。在270条KEGG通路中有228个通路涉及到差异表达基因,如介导生长激素作用的JAK-STAT和MAPK信号通路。实时定量PCR （QRT-PCR）检测到水牛的非泌乳期乳腺组织中有少量的乳蛋白基因表达。K酪蛋白（CN3）基因表达量在非泌乳期与泌乳期乳腺中都是显着高于其它基因。与非泌乳期相比,泌乳期乳腺CN1S1基因表达量增加了6958倍,CN1S2增加了4800倍,kCN和αLA增加了1000倍左右,而β酪蛋白增加了244倍,与测序结果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺组织中检测至（?）GHR, PRLR（?）（?）GF1R的表达,说明GH、PRL（?）（?）IGF1可能参与了泌乳的分子调控过程。2.水牛乳腺上皮细胞（BME）基因表达分析。通过PB转座子携带的LT抗原永生化诱导水牛乳腺上皮细胞（BME）,建立检测乳腺转基因表达载体的细胞模型。PB转座子为骨架的永生化载体pXL-BACII-bCN2/LT转染后的BME细胞的腺泡消失速度和成纤维样转变降低。在添加催乳素诱导培养后,第30代的永生化处理的BME细胞能检测到乳蛋白基因的表达。其中CN1S1基因表达量为非泌乳期乳腺的88.32倍,CN3为32.09倍,CN1S2和αLA基因表达量分别为2.8倍和3.3倍。结果表明,初步建立了细胞水平检测乳腺特异性表达载体的体外模型。3.水牛转座子转基因技术方法的建立。本研究通过构建piggyBac （PB）, passport （PP）和sleeping beauty （SB）转座子转基因载体,转染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,同时对转座子转基因系统进行优化,以期建立水牛转座子转基因技术体系。转座子转基因载体转染水牛的胎儿成纤维细胞（BFF）后,均能观察到标记基因EGFP的表达。应用p18T载体、PB、PP和SB转座子表达NEO基因,转染细胞后筛选获得的G418抗性细胞克隆形成数（CFN）差异不显着。与随机整合相比,加入相应的转座酶后,PB转座子系统抗性细胞克隆数量提高了22倍,PP转座子系统提高了8倍,SB转座子提高了14倍,PB转座子系统获得了最高的转基因效率。PB转座子在转座子和转座酶比例（Tn:Ts）为1：l的时候转基因效率最高,而PP和SB转座子为1：0.5。当添加的转座酶质粒过量时,PB转座子的转基因效率下降幅度没有PP和SB转座子大。通过QRT-PCR检测了不同转座子外源基因的整合拷贝数,结果显示：随机整合组每个单倍体基因组整合拷贝数从5个拷贝至51.9个拷贝不等。PB转座子为16.62拷贝,PP转座子为2.5拷贝。SB转座子整合到基因组中的转基因拷贝数最多,单倍体基因组中为98个拷贝。以上结果显示：三种转座子均能应用于水牛的转基因研究,转基因效率优于随机整合转基因。4.生长激素转基因载体构建与细胞水平检测。克隆分析了人、奶牛和水牛的生长激素基因（GH）,PB转座子携带的GH转基因载体转染乳腺细胞和乳腺组织块,研究GH转基因的表达对其乳蛋白等基因表达的影响。结果显示牛、水牛和牦牛之间GH基因的同源性最高,与其它偶蹄目也有较高的同源性,生长激素氨基酸序列也较为保守。将分别携带有人和奶牛GH的piggyBac转座子转基因载体（pXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.1-EGFP-Neo, PXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.2-EGFP-Neo）转染人的乳腺癌细胞系（Bcap37）,能观察至（?）EGFP的表达,RT-PCR和western blot均能检测到人和奶牛GH基因的特异性表达。分别用P18T-bGH和PB-bGH转基因载体转染永生化BME细胞后,检测到bGH转基因的表达。p酪蛋白、CN1S1酪蛋白和α乳清白蛋白基因表达量均有显着提高,GHR和IGF1R基因的表达量也有上调。pB-bGH载体转染的水牛乳腺组织块,CN1S1, CN1S2,p酪蛋白和K酪蛋白基因的表达量提高了50倍以上,初步证明GH转基因载体的转染可以显着提高乳蛋白基因的表达水平。5.转GH基因水牛克隆胚胎的生产与早产转基因克隆水牛的检测。使用受精卵胞质注射、卵胞质内单精子注射（ICSI）和转基因体细胞核移植的方法生产转GH基因的水牛胚胎,并对经胚胎移植后的获得的早产转基因克隆水牛进行了鉴定。水牛受精卵胞质注射和水牛卵母细胞内单精子注射（ICSI） PB转座子GH转基因载体和转座酶载体后,均获得EGFP表达的转基因阳性胚胎。以转GH基因BFF为核供体,制备了EGFP表达的转基因克隆水牛囊胚。经胚胎移植后获得了转GH基因克隆水牛的妊娠,于9月龄早产。特定蓝光照射下在早产水牛头侧部能观察到绿色荧光表达,解剖结果显示心、肺、肝、胃和脾发育正常,但大肠,肾脏,生殖系统等发育不良,而且有严重的组织粘连。激光共聚焦显微镜下观察到心、肝、脾、肺、膈肌和肌肉等组织冰冻切片均有较强的EGFP表达。通过PCR检测和染色体步移法检测到早产克隆水牛的各组织中均有外源基因的整合。这些工作为获得乳腺特异性表达GH基因转基因水牛奠定了较好的工作基础。
李辉[5]（2012）在《乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建》文中提出干扰素是人体在遭受病毒或其他病原体侵入时产生的一类细胞因子,除了能抵御病毒感染等功能外,还具有抑制细胞分裂、免疫调控和控制细胞凋亡等重要功能,是治疗病毒性疾病和癌症的最佳药物之一。根据干扰素不同的生物学特性、氨基酸组成和受体类型可分为多种亚型,其中IFNa-2b是目前临床上应用最为广泛的一个,常用于病毒性肝炎和一些癌症的治疗。IFNa-2b基因位于人类第9号染色体的9p21区,编码165个氨基酸。成熟的IFNa-2b蛋白是一种含有5个α[螺旋和2个二硫键的糖蛋白,分子量约为19.6kD。乙型病毒性肝炎是全球高发性传染病,据统计全球慢性乙肝患者约为3.5亿人,约占总人口的6%,而我国乙肝患者约为1.3亿,占全国总人口的10%。作为抗病毒的有效药物,IFNa-2b的需求量非常大。但目前所有临床应用的重组IFNa-2b均为细菌生产,因缺乏一些必要正确的翻译后修饰和空间折叠,造成了它生物学活性低下,血液中半衰期短,甚至在病人体内产生抗体等缺点。所以利用哺乳动物乳腺生物反应器来大量制备具有完全修饰的高活性的重组人IFNa-2b是最佳选择。本研究拟通过制备重组人IFNa-2b转基因小鼠模型,为利用转基因水牛乳腺生物反应器生产重组人IFNa-2b奠定技术和理论基础。分别克隆了娟珊牛p-酪蛋白基因的有信号肽（5244bp,3912bp）启动子和无信号肽（5165bp,3855bp）启动子,1166bp,ployA序列,荷斯坦奶牛β-酪蛋白基因有信号肽（5219bp,3887bp）启动子和无信号肽（5160bp,3830bp）启动子,1166bp ployA序列。将克隆得到的8个启动子序列构建成8个启动子检测载体（pEGFP-JS5.2BCNpsig, pEGFP-JS5.2BCNpnosig, pEGFP-JS3.8BCNpsig, pEGFP-JS3.8BCNpnosig, pEGFP-HST5.2BCNpsig, pEGFP-HST5.2BCNpnosig, pEGFP-HST3.8BCNpsig和pEGFP-HST3.8BCN pnosig）,转染人乳腺癌细胞系Bcap-37细胞后,在激素的诱导下,可见EGFP基因的表达,表明所克隆的启动子是具有启动活性的。而后,与带6×His标签的IFNa-2b基因和筛选基因Neo相连,构建得到8个乳腺特异性表达载体（pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS5.2BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST3.8BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo和pHST3.8BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo）。然后,分别转染人乳腺癌上皮细胞系Bcap-37,筛选得到9个阳性细胞克隆。经荧光定量PCR、Western blot和ELISA等检测发现,转染pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo载体的转基因细胞表达量最高,并且所表达的重组IFNa-2b具有生物学活性。因此,此载体可用于制备转基因动物。将筛选得到的转基因载体pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo改造去掉Neo基因后,经原核注射法获得转基因小鼠。通过PCR和Southern blot对转基因小鼠进行检测。并对整合拷贝数,整合位点以及转基因载体在不同小鼠代数体内的甲基化状态进行了检测。发现所获得的3只转基因Founder小鼠中分别约整合了3-6个拷贝,并在小鼠基因组的4个染色体上的共检测到7个整合位点,分别为5号染色体一个,位于：长臂上NT166301.1位置处；6号染色体上两个,分别为：短臂上的NW001030811.1和NT039353.7位置处；9号染色体上两个,分别为：短臂上NW001030922.1和NT039482.7位置处；17号染色体上两个分别为：短臂上的NT039649.7和NT166301.1位置处。从各整合位点的碱基组成看,断裂结合处均为富含AT区。随着小鼠的传代,转基因载体中CMV启动子的甲基化程度逐渐升高分别从Founder小鼠的79.3%,F1代83%,F2代85.7%,升高至F3代的93%,到F4代高达95.7%。利用RT-PCR, Western blot, ELISA和免疫组化等技术对转基因小鼠乳腺组织检测发现,在泌乳期转基因小鼠的乳腺组织中有IFNa-2b mRNA的转录,但是在乳腺组织外检测不到表达,说明所构建的载体是具有乳腺组织特异性的；对转基因小鼠的乳汁检测发现,乳汁中含有重组的人IFNa-2b,并且融合表达了His标签。利用ELISA法对乳汁中重组人IFNa-2b的含量检测发现,转基因小鼠乳汁中最高表达量约为30μg/L。小鼠乳腺组织的免疫组化检测结果进一步证明了重组IFNa-2b的表达。为建立一套重组IFNa-2b生物活性的测定方法,克隆了人MxA基因含有3个ISRE元件的启动子,经过活性测定后,构建了pGL3-Mxp3表达载体,与pRL-TK按1：1比例混合后转染WISH细胞,用标准品IFNa-2b处理细胞后,制备了RLU与IFNa-2b活性单位的标准曲线和回归方程。根据在WISH细胞中添加转基因小鼠乳汁获得的RLU的值,计算出活性单位,约为255.85IU,相对比活度约为2.8×107IU/mg。同时利用荧光定量PCR技术对转基因小鼠乳汁中重组人IFNa-2b诱导下游基因的表达量变化进行了测定。共检测了8个候选基因,分别为MxA、OAS、PKR、 Caspasel、p21、MAPK、MHCI和PD-1。检测结果发现,转基因小鼠乳汁能显着提高MxA, OAS, PKR和Caspasel的表达,表达量相分别为非转基因小鼠乳汁的150倍、10.72倍、6.4倍和3.5倍。而p21、MAPK、 MHC I的表达量无明显变化,证明转基因小鼠乳腺表达的重组人IFNa-2b具有生物活性。
张杨[6]（2012）在《PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究》文中研究表明水牛是南方的重要品种资源,具有较强抗病抗逆耐粗的能力,而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征,将是南方鲜奶和高端奶的重要来源。我国政府大力支持在南方养殖奶水牛,然而水牛的繁殖性能较低,是水牛业发展的瓶颈问题。抑制素（Inhibin, INH）、卵泡抑素（Follistatin, FST）对促卵泡素（Follicle-stimulating hormone, FSH）具有反馈调控作用,从而在一定程度上影响卵巢功能及卵泡发育。目前已开展了许多有关INH或FST单个基因免疫和提高动物繁殖力的研究,并取得了较好的效果；利用转基因和RNAi技术同时抑制INH和FST表达是否可以调控水牛卵巢功能和卵泡发育及提高繁殖性能,以及提高FSHβ表达水平对生殖生理和繁殖性能的影响,这方面报道还不多。PiggyBac转座子（PB）是一种DNA转座子,已作为基因转移和插入诱变等基因研究的有效工具,广泛应用于哺乳动物基因功能和转基因的研究。本研究利用PB转座系统,构建了同时干扰INHA和FST的双干扰载体,在细胞水平分析表达和干扰效率、筛选稳定整合的阳性细胞；构建含有水牛卵巢特异性启动子的FSHβ表达载体,分析其特异表达特性和表达效率。为水牛基因功能、卵巢功能和卵泡发育调控机理及转基因技术打下基础。本研究的主要结果如下：（1）针对INHA和FST基因序列设计RNAi干扰片段,构建了含有两个转录元件的双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。（2）比较分析了双干扰载体的瞬时转染和与PB转座酶共转染的转染效率。分别利用瞬时转染和共转染方法转染水牛卵巢颗粒细胞（Buffalo fetal fibroblast cells, BuGCs）和水牛胎儿成纤维细胞（Buffalo fetal fibroblast cells, BuFFs）,分别统计转染第24h、48h和72h时载体中绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中绿色荧光表达量。在转染24h时瞬时转染的细胞转染率高于共转染,而在其它时间共转染的转染效率均高于瞬时转染。（3）证明了双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2对INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通过Q-PCR检测,细胞内INHA和FST的mRNA的表达均因RNAi而有所减少,其中INHA在共转染BuGCs时被干扰程度最大（37.37%）,其表达量显着地低于空白对照组；在瞬时转染黄牛卵巢颗粒细胞（Bovine granulosa cells, BGCs）中FST干扰率为3.55%。（4）筛选出了INHA和FST基因RNAi片段稳定整合到基因组的阳性细胞。经G418筛选转染细胞,观察荧光表达情况,转染第7天后BuGCs和BuFFs荧光表达基本稳定,并且通过PCR鉴定转染后细胞基因组含有PB转座子的序列。（5）构建了分别含卵巢特异性启动子CYP19、OSP-1（广西大学惠赠）的pB-CYP19和pB-OSP1表达载体；（6）构建了水牛FSHβ全长cDNA的卵巢特异表达的pB-CYP19-FSHβ和pB-OSP1-FSHβ载体；（7）证明了两个表达载体具有卵巢特异表达的特性,pB-OSP1-FSHβ载体超表达效率较高。将两个载体分别转染BuGCs和BuFFs,利用RT-PCR技术检测出了BuGCs的FSHβ表达,而在BuFFs中却没有表达,证明了这两个载体具有水牛卵巢特异表达特性：而且pB-OSP1-FSHβ载体的FSHβ表达效率（13.04%）高于PB-CYP19-FSHβ载体（1.2%）,故pB-OSP1-FSHβ载体可用于水牛卵泡发育等繁殖调控的研究；同时也证明OSP-1是水牛卵巢特异表达的有效启动子。
刘庆友,刘晟,王丹,李辉,李湘萍,罗婵,陆凤花,石德顺[7]（2011）在《奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达》文中研究表明为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶（human lysozyme,hLZ）基因序列（NM000239.2）设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo（13.6kb）和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo（12.2kb）。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。
宋利军[8]（2011）在《介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定》文中研究表明水牛耐高温、抗病力较强,适宜在高温地区饲养,且水牛奶中乳蛋白和乳脂含量较高。但水牛繁殖力低、产奶量少的缺点,直接限制了奶水牛业的发展。抑制素（Inhibin, INH）抑制垂体合成和分泌FSH,从而影响卵泡发育、精子发生及生殖活动。RNA干扰（RNA interference, RNAi）在生物体内调节基因表达,可用于干扰INHA的表达。PB （piggyBac transposon）转座子遵循“剪切-粘贴”机制,具有特异性识别位点TTAA、剪切和插入不留下痕迹、稳定整合和传代、负载容量大和转座效率高等特点,且PB转座子具有能删除特定基因（如标记基因GFP）的Cre/LoxP系统,将其与转基因技术相结合可以获得安全的转基因动物。因此,本研究利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体,构建干扰INHA基因表达的转基因载体,经G418筛选获得转基因阳性细胞,为显微注谢或核移植技术获得转基因水牛提供素材,以期为提高水牛繁殖力和对INH基因功能深入研究奠定基础。本研究主要内容如下：（1）构建了5个干扰载体（其中1个瞬时表达载体和4个转基因载体）和3个阴性对照载体。利用瞬时表达载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen构建2个干扰载体psiRNA-1和psiRNA-2;利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体pHi5和pHl,分别构建pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3、pHi5siRNA-4和pH1siRNA-1、PH1siRNA-3、pH1siRNA-4转基因载体；其中psiRNA-1、pHi5siRNA-1和pH1siRNA-1为阴性载体。（2）转基因载体pHi5、pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3和pHi5siRNA-4与转座酶载体混合后分别转染水牛颗粒细胞,通过检测INHA的表达量和孕酮的分泌量,筛选出具有较好干扰效果的片段siRNA-3和siRNA-4, siRNA-3干扰效果更好。（3）初步筛选鉴定出4个转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞。两组转基因载体与转座酶载体混合后分别转染水牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选,观察GFP的表达情况。当筛选到第6d后,有4种细胞系能基本稳定表达GFP,初步表明成功获得转基因阳性细胞,分别为pHi5siRN A-3阳性水牛胎儿成纤维细胞、pHi5siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞、pH1siRNA-3阳性水牛胎儿成纤维细胞和pH1siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞。（4）建立了构建RNAi转基因载体技术,并建立了筛选转基因阳性细胞技术。
董克家,钱建新[9]（2003）在《奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建》文中研究表明目的:构建奶水牛乳腺表达人FSHβ基因载体。方法:利用限制性内切酶和T4DNA连接酶方法将转基因构件（水牛β酪蛋白启动子、hFSHβ、SV40PolyA）插入pLXIN载体中,通过转化大肠杆菌,筛选阳性克隆。结果:通过酶切鉴定及测序分析表明pLXIN插入转基因构件。结论:奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体为:pLXIN-hFSHβ。
二、奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建（论文提纲范文）
（1）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）乳腺特异性表达催乳素基因载体的构建与检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 PRL基因的克隆 |
| 1.3 乳腺特异表达载体的构建 |
| 1.4 Bcap-37细胞转染与检测 |
| 1.5 核移植胚胎的生产 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRL基因的克隆 |
| 2.2 乳腺特异表达PRL基因载体的构建 |
| 2.3 转PRL基因载体转染Bcap-37细胞与检测 |
| 2.4 转PRL基因水牛克隆胚胎的生产 |
| 3 讨论 |
（3）我国水牛繁殖生物技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 超数排卵和同期发情 |
| 2 水牛胚胎体外生产 |
| 3 水牛胚胎移植 |
| 4 水牛胚胎冷冻 |
| 5 水牛性别控制 |
| 6 水牛体细胞核移植及转基因研究 |
| 7 存在问题 |
| 8 结语 |
（4）水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 乳腺发育与生长激素转基因动物 |
| 1 乳腺发育机理 |
| 2 血液中的乳蛋白成份 |
| 3 生长激素 |
| 3.1 概况 |
| 3.2 牛生长激素 |
| 4 外源注射BST促进产奶量 |
| 4.1 BST处理安全性 |
| 4.2 BST处理效果 |
| 4.3 BST注射促进泌乳的机制 |
| 5 生长激素转基因动物研究进展 |
| 6 乳腺特异性表达生长激素 |
| 7 生长激素转基因的影响 |
| 7.1 对内源性生长激素的影响 |
| 7.2 对生长性状的影响 |
| 8 生长激素转基因动物存在的问题与展望 |
| 第二章 转座子转基因动物研究进展 |
| 1 转座子概述 |
| 2 主动整合与转座子转基因 |
| 3 PB转座子(PIGGYBAC TRANSPOSON) |
| 4 SB转座子(SLEEPING BEAUTYTRANSPOSON) |
| 5 PP转座子(PASSPORT TRANSPOSON) |
| 研究的目的与意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第三章 水牛乳腺基因表达谱分析与乳腺细胞永生化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水牛乳腺组织基因表达谱构建 |
| 2.2 基因表达谱中差异表达基因 |
| 2.3 水牛泌乳期与非泌乳期期基因表达 |
| 2.4 水牛乳腺上皮细胞(BME)及永生化 |
| 2.5 永生化BME细胞,泌乳期与非泌乳期乳腺组织基因表达对比 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺基因表达谱分析 |
| 3.2 乳蛋白基因表达 |
| 3.3 泌乳相关基因表达 |
| 3.4 水牛乳腺上皮细胞的永生化 |
| 4 小结 |
| 第四章 水牛转座子转基因的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 转基因载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因BFF细胞荧光观察与neo整合检测 |
| 2.2 外源基因整合位点检测 |
| 2.3 随机整合与转座子转基因效率比较 |
| 2.4 转座子转基因系统的优化 |
| 2.5 转座子转基因拷贝数检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 随机整合与主动整合转基因效率 |
| 3.2 转座子转基因体系优化 |
| 3.3 转基因整合拷贝数 |
| 4 小结 |
| 第五章 生长激素转基因水牛的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 人、奶牛、水牛GH基因 |
| 2.2 GH转基因在Bcap37乳腺细胞中的表达 |
| 2.3 GH转基因对BME乳腺细胞基因表达的影响 |
| 2.4 转GH基因水牛胚胎发育观察及早产转基因克隆水牛的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 生长激素基因及转基因表达 |
| 3.2 生长激素转基因对乳腺细胞和乳腺组织的影响 |
| 3.3 GH转基因牛 |
| 4 小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (APPENDIX) |
| 附录1：水牛生长激素基因编码区序列GENBANK提交(JF894306) |
| 附表1：水牛乳腺泌乳期与非泌乳期乳腺差异表达基因-KEGG归类 |
| 附表2：泌乳期表达量上调的基因列表(部分) |
| 附表3：泌乳期表达量下调的基因列表(部分) |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（5）乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因动物 |
| 1.1.1 转基因动物的发展史 |
| 1.1.2 转基因动物的制备方法 |
| 1.1.3 转基因动物的鉴定手段 |
| 1.1.4 转基因对转基因动物的影响 |
| 1.1.5 转基因动物的生物安全性 |
| 1.2 转基因动物乳腺生物反应器 |
| 1.2.1 转基因动物乳腺生物反应器的优势及研究进展 |
| 1.2.2 乳腺生物反应器高效表达的决定因素 |
| 1.3 干扰素 |
| 1.3.1 干扰素的发现及分类 |
| 1.3.2 干扰素诱生过程的信号路径 |
| 1.3.3 干扰素活性的作用机制 |
| 1.3.4 干扰素的应答基因生物活性 |
| 1.3.5 IFNα--2b简介 |
| 1.3.6 干扰素的生产状况 |
| 1.3.7 干扰素活性测定方法 |
| 1.4 转干扰素基因水牛制备的目的和意义 |
| 第二章 乳腺特异表达调控元件的克隆、活性验证及表达载体的构建 |
| 摘要 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 液基因组DNA的提取,各个片段的PCR扩增及测序 |
| 2.2.3 启动子活性分析 |
| 2.2.4 人IFNα-2b基因原核表达验证 |
| 2.2.5 乳腺特异表达载体的构建及测序分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR扩增结果及测序结果 |
| 2.3.2 启动子活性分析结果 |
| 2.3.3 人IFNα-2b基因的原核表达分析 |
| 2.3.4 乳腺特异表达载体的构建及测序检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 IFNα-2b乳腺特异表达载体表达效率的检测 |
| 摘要 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 G418对Bcap-37细胞的毒性试验 |
| 3.2.2 Bcap-37细胞的转染及筛选 |
| 3.2.3 阳性细胞克隆的PCR检测 |
| 3.2.4 EGFP阳性细胞株IFNα-2b表达的检测 |
| 3.2.5 细胞培养液中重组人IFNα-2b的活性测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 G418毒性试验结果 |
| 3.3.2 Bcap-37细胞的转染筛选 |
| 3.3.3 阳性细胞克隆的PCR检测 |
| 3.3.4 EGFP阳性细胞株表达IFNα-2b的检测 |
| 3.3.5 阳性细胞系表达的IFNα-2b的活性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 转基因小鼠模型的制备与检测 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转基因载体改造 |
| 4.2.2 转基因小鼠的制备 |
| 4.2.3 转基因小鼠的PCR鉴定 |
| 4.2.4 转基因小鼠的Southern blot鉴定 |
| 4.2.5 转基因小鼠的扩大繁育 |
| 4.2.6 转基因小鼠整合拷贝数的检测 |
| 4.2.7 转基因整合位点的检测 |
| 4.2.8 转基因载体中启动子的甲基化状态检测 |
| 4.2.9 转基因小鼠乳腺及其它组织表达IFNα-2b的检测 |
| 4.2.10 转基因小鼠乳汁中IFNα-2b表达的Western blot检测 |
| 4.2.11 转基因泌乳期母鼠乳腺的免疫组化分析 |
| 4.2.12 转基因小鼠乳汁中表达IFNα-2b的ELISA定量 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转基因小鼠制备用载体的改造与纯化 |
| 4.3.2 转基因小鼠的PCR检测 |
| 4.3.3 转基因小鼠的Southern blot检测 |
| 4.3.4 转基因整合拷贝数的测定 |
| 4.3.5 转基因整合位点的检测 |
| 4.3.6 转基因甲基化状态的检测 |
| 4.3.7 转基因小鼠乳腺及其它组织中IFNα-2b表达的RT-PCR检测 |
| 4.3.8 转基因小鼠乳汁Western blot检测 |
| 4.3.9 转基因小鼠乳腺石蜡切片及免疫组化检测 |
| 4.3.10 转基因小鼠乳汁中IFNα-2b的ELISA定量检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 转基因小鼠表达重组人IFNα-2b的生物学活性检测 |
| 摘要 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 MxA基因启动子的克隆及活性检测 |
| 5.2.2 MxA基因启动子中ISRE元件对IFNa-2b的应答活性检测 |
| 5.2.3 转基因小鼠乳汁的重组IFNα-2b活性定量 |
| 5.2.4 转基因小鼠乳汁中重组IFNα-2b诱导下游基因的表达检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 MxA基因启动子的活性检测 |
| 5.3.2 MxA基因启动子中ISRE元件应答IFNα-2b的检测 |
| 5.3.3 转基因小鼠乳汁的重组IFNα-2b活性的测量 |
| 5.3.4 转基因小鼠乳汁中重组IFNα-2b诱导其下游基因表达的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表的文章及专利 |
（6）PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 抑制素及其功能研究 |
| 1.1.1 抑制素结构 |
| 1.1.2 抑制素功能 |
| 1.2 卵泡抑素及其功能 |
| 1.2.1 卵泡抑素的结构 |
| 1.2.2 卵泡抑素的功能 |
| 1.3 促卵泡素及其应用 |
| 1.3.1 促卵泡素的结构 |
| 1.3.2 促卵泡素的功能及其应用 |
| 1.4 转座子的研究进展 |
| 1.4.1 LINE-1(L1元件) |
| 1.4.2 Tol2转座子 |
| 1.4.3 SB转座子 |
| 1.4.4 PB转座子 |
| 1.5 RNA干扰及其应用 |
| 1.5.1 RNAi的分子机理 |
| 1.5.2 RNAi的特征 |
| 1.5.3 RNAi技术的应用 |
| 1.6 原核生物及真核生物启动子 |
| 1.6.1 真核生物启动子分类 |
| 1.6.2 哺乳动物组织特异性启动子 |
| 1.6.3 卵巢组织特异性表达启动子 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞与样品 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 分子生物学分析工具 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 双干扰载体的构建 |
| 3.2.2 FSHβ表达载体的构建 |
| 3.2.3 黄牛和水牛卵巢颗粒细胞的制备与培养 |
| 3.2.4 水牛胎儿成纤维细胞的培养 |
| 3.2.5 G418对颗粒细胞最低致死浓度的筛选 |
| 3.2.6 脂质体法优化PB载体瞬时转染颗粒细胞的条件 |
| 3.2.7 优化PB载体与转座酶共转染颗粒细胞的条件 |
| 3.2.8 以最优条件对颗粒细胞进行转染 |
| 3.2.9 转染后颗粒细胞总RNA提取及检测 |
| 3.2.10 RT-PCR合成第一链cDNA |
| 3.2.11 INHA、FST和FSHβ基因相对表达量分析 |
| 3.2.12 转座子插入基因组的检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 双干扰载体的构建及鉴定 |
| 4.1.1 克隆载体pEASY-U6的构建及鉴定 |
| 4.1.2 中间载体pB-H1-U6的构建及鉴定 |
| 4.1.3 干扰载体pB-H1-RNAil-U6-RNAi2的构建及鉴定 |
| 4.2 FSHp卵巢特异表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.1 中间载体pBCYP19/pBOSP1的构建及鉴定 |
| 4.2.2 pBCYPl9-FSHβ/pBOSP1-FSHβ载体的构建及鉴定 |
| 4.3 G418对BuGC最低致死浓度的筛选 |
| 4.4 干扰载体转染技术的优化及其表达效果的分析 |
| 4.4.1 瞬时转染BuGCs和BGCs的条件优化 |
| 4.4.2 与PB酶共转染BuGCs的条件优化 |
| 4.4.3 双干扰载体瞬时转染BuGCs和BGCs |
| 4.4.4 双干扰载体与PB转座酶共转染BuGCs、BGCs和BuFFs |
| 4.4.5 双干扰载体在BuGCs共转染中高效表达 |
| 4.5 水牛FSHβ表达载体转染技术优化及其表达效果的分析 |
| 4.5.1 表达载体瞬时转染BuGCs的条件优化 |
| 4.5.2 表达载体瞬时转染BuGCs和BuFFs |
| 4.6 双干扰载体的干扰效果、特异表达载体的表达特征的分析 |
| 4.6.1 RNA提取的鉴定 |
| 4.6.2 定量引物PCR检测 |
| 4.6.3 BuGCs和BGCs中INHA相对表达量 |
| 4.6.4 BuGCs和BGCs中FST相对表达量 |
| 4.6.5 BuGCs中FSHβ相对表达量 |
| 4.7 利用双干扰载体整合到基因组的阳性细胞的筛选和鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 细胞中RNAi干扰的探讨 |
| 5.2 卵巢特异性启动子的探讨 |
| 5.3 PB转座子在细胞中转染效果的探讨 |
| 5.4 脂质体介导转染细胞的探讨 |
| 6 总结 |
| 6.1 小结 |
| 6.2 特色创新 |
| 6.3 进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的文章或申请专利 |
| 致谢 |
（8）介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 转座子的研究进展 |
| 1.1 SB转座子 |
| 1.1.1 SB转座子重建 |
| 1.1.2 SB转座子的结构及转座机制 |
| 1.1.3 SB转座子在哺乳动物中的研究 |
| 1.2 Tol2转座子 |
| 1.3 P因子 |
| 1.4 Mos1转座子 |
| 1.5 PB转座子 |
| 1.5.1 PB转座子的结构 |
| 1.5.2 PB转座子的转座特点 |
| 1.5.3 PB转座子的转座机制 |
| 1.5.4 报告基因在PB转座子系统中的应用 |
| 1.5.5 PB转座子在哺乳动物中的研究 |
| 2 RNA干扰 |
| 2.1 RNAi的作用机制 |
| 2.2 RNAi的应用 |
| 2.3 Ago蛋白质 |
| 3 Cre/LoxP系统 |
| 4 水牛的研究进展 |
| 5 抑制素的功能及研究进展 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和感受态细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液及相关缓冲液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 片段设计 |
| 2.2.2 沉默INHA的载体构建 |
| 2.2.3 转化到DH5α感受态细胞 |
| 2.2.4 水牛颗粒细胞的分离与培养 |
| 2.2.5 水牛胎儿成纤维细胞的培养 |
| 2.2.6 脂质体转染 |
| 2.2.7 GFP的检测 |
| 2.2.8 INHA的mRNA水平检测 |
| 2.2.9 水牛颗粒细胞内INHA相对表达量分析 |
| 2.2.10 水牛颗粒细胞中孕酮分泌量放免测定 |
| 2.2.11 转基因阳性细胞的筛选鉴定 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 沉默INHA的瞬时表达载体的构建 |
| 3.2 沉默INHA的转基因载体的构建 |
| 3.3 载体转染效率分析 |
| 3.3.1 沉默INHA的瞬时载体转染颗粒细胞 |
| 3.3.2 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞 |
| 3.4 siRNA片段的生物学效应的分析 |
| 3.4.1 沉默INHA的瞬时载体转染颗粒细胞后INHA表达量的检测 |
| 3.4.2 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞后1NHA表达量的探讨 |
| 3.4.3 沉默1NHA的瞬时载体转染颗粒细胞后孕酮分泌量的分析 |
| 3.4.4 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞后孕酮分泌量的探讨 |
| 3.5 转基因阳性细胞的筛选与初步鉴定 |
| 3.5.1 利用pHi5构建的转基因载体的阳性水牛颗粒细胞的筛选 |
| 3.5.2 利用pHi5构建的转基因载体的转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的筛选 |
| 3.5.3 利用pH1构建的转基因载体的转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的筛选 |
| 3.5.4 转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的初步鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PB转座子应用于水牛转基因研究的优势 |
| 4.2 转基因阳性细胞的筛选与鉴定 |
| 4.3 siRNA片段干扰效果的讨论 |
| 5 进一步研究的内容 |
| 6. 小论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的文章或申请专利 |
| 致谢 |
四、奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建（论文参考文献）
- [1]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]乳腺特异性表达催乳素基因载体的构建与检测[J]. 任艳萍,雷小灿,谢亮亮,罗婵,刘晓华,石德顺,李湘萍. 中国细胞生物学学报, 2016(05)
- [3]我国水牛繁殖生物技术研究进展[J]. 李婥,杨春艳,尚江华,郑海英,黄芬香. 中国畜禽种业, 2015(06)
- [4]水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究[D]. 王锦. 广西大学, 2013(02)
- [5]乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建[D]. 李辉. 广西大学, 2012(01)
- [6]PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究[D]. 张杨. 华中农业大学, 2012(02)
- [7]奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达[J]. 刘庆友,刘晟,王丹,李辉,李湘萍,罗婵,陆凤花,石德顺. 中国兽医科学, 2011(08)
- [8]介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定[D]. 宋利军. 华中农业大学, 2011(08)
- [9]奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建[J]. 董克家,钱建新. 海南医学院学报, 2003(06)