一、Failure to disengage PI-3K pathway signaling confers Anti-IgM resistance to growth arrest and apoptosis in the CH12 B-cell lymphoma（论文文献综述）
周敏佳[1]（2020）在《B细胞受体复合物的表达纯化》文中指出体液免疫是人类适应性免疫最关键的部分之一,而B细胞在其中发挥着不可替代的作用。B细胞的细胞膜表面表达着B细胞受体（B cell receptor,BCR）,是一种能够特异性地识别并结合抗原的免疫膜蛋白受体。BCR的本质是膜免疫球蛋白（membrane immunoglobulin,m Ig）,它通常与一种参与信号传递的异二聚体分子CD79A/B复合物共表达,二者共表达的产物称之为B细胞受体复合物（即BCR复合物）。BCR的类型多种多样,其中在未激活的初始B细胞中表达的类型是Ig M型和Ig D型,但是在复合物中,CD79A/B总是相同的。随着膜蛋白纯化技术、膜蛋白结晶技术和冷冻电镜技术的发展,人们解析了多种常见的膜蛋白受体。而截至目前,关于BCR复合物结构方面的研究少之又少,如何通过体外表达纯化获得BCR复合物、其结构是不是正如前人研究的那样以及m Ig和CD79A/B之间的信号转导到底如何进行等问题仍未得到解决。本课题通过哺乳动物细胞表达系统——HEK293F细胞系表达纯化了λIg M型BCR复合物和κIg D型BCR复合物。采用膜蛋白常用的纯化方法,并利用快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography,FPLC）结合分子筛进行层析以获取质量更高的蛋白。由于起初的表达纯化实验所获取的蛋白含量及质量不高,接下来展开了去垢剂的筛选实验,同时进行了针对载体的改造,以探索BCR复合物合适的表达和纯化方法。通过对21种去垢剂的筛选,最终针对λIg M型BCR复合物筛选出了一种较为合适的去垢剂——L360S。同时,通过对载体的改造,提升了CD79A/B的表达量。最后,我们尝试了一些新的方法对κIg D型BCR复合物进行表达纯化,取得了良好的效果。综上所述,去垢剂的筛选和对载体的改造一定程度上改善了BCR复合物表达和纯化的效果,为将来解析其结构打下了良好的基础。
张亦婷[2]（2019）在《EGFRvⅢ靶向单克隆抗体CH12致食蟹猴特异性血小板减少的分子机制研究》文中认为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）对于细胞的增殖、存活和分化过程的调节起关键作用,其过度表达与突变能够导致细胞增殖、血管生成、局部组织侵袭增加、以及抗细胞凋亡,因此也被认为是原癌基因并促进肿瘤细胞的增殖和发展。表皮生长因子3型突变体（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ）是最常见的一种EGFR突变体,目前已经在多种恶性肿瘤中检测到EGFRvⅢ的表达。此外,由于EGFRvⅢ在正常组织中不表达,能够避免多种毒副作用的产生,因此也成为癌症治疗的理想靶点。CH12是我国自主研发的抗EGFRvⅢ人源化单克隆抗体,前期药效学研究显示其能够抑制EGFRvⅢ阳性肿瘤细胞的增殖,并抑制EGFRvⅢ阳性移植瘤在裸鼠体内的生长,且疗效优于上市药物EGFR靶向西妥昔单抗。然而,在CH12的临床前安全性评价中发现,单次（≥ 25mg/kg）及重复（≥ 5mg/kg）静脉输注CH12可致食蟹猴血小板数量显着减少,并伴随皮肤瘀斑瘀点等紫癜症表现,即出现非预期的血小板减少症,而对大鼠无影响（最高剂量400 mg/kg）。此外,以外周血为模型的体外实验证实,CH12能够与食蟹猴来源血小板结合并诱导其活化,而与人外周血来源血小板无相互作用。结合动物实验结果,表明CH12诱导的血小板减少症具有种属差异。单抗诱导的该类食蟹猴血小板减少症已被多次报道,但机制不明,例如奥马珠单抗、AMGX、MAbY.1,但机制不明。深入研究该毒性机制也能为其它单抗诱发的该类毒性提供参考,阐明种属差异也能够为评估和预测临床不良反应提供科学依据。本课题首先证明CH12通过脱靶效应与食蟹猴血小板结合并使其活化,造成外周血循环中血小板破坏增多,从而诱导产生血小板减少症。随后通过定量蛋白组学及受体阻断技术证实,CH12通过与食蟹猴血小板膜蛋白αⅡbβ3发生相互作用而造成了该毒性的发生。进一步通过计算机同源建模技术,以已知的人αⅡbβ3三维构象为模板,搭建食蟹猴及大鼠的三维构象,发现三种种属间唯一存在的结构差异,即食蟹猴的αⅡb亚基的配体结合口袋中存在一个额外的环状结构,可能是该环的存在造成了 CH12种属特异性的与食蟹猴血小板发生结合。多重氨基酸序列对比结果显示,这种构象上的差异可能是由于两个氨基酸的缺失而造成,且该差异具有食蟹猴种属特异性,在人、大鼠及其它四种常见非人灵长类中也并未存在。此外,本课题也证实即使食蟹猴是毒理学研究使用最为广泛的非人灵长类,其与人之间的微小种属差异仍然会混淆人类风险评估结果,故阐明种属差异有助于预测人类风险并避免药物开发中的损失。
崔倩[3]（2019）在《苯并芘暴露诱导海水青鳉免疫应答的信号通路及其免疫调控机制研究》文中研究指明苯并[a]芘（BaP）是一种在海洋环境中广泛存在、具有免疫毒性和致癌性的多环芳烃代表性污染物。实验室前期研究发现,BaP暴露与免疫因子LPS刺激同样会引起真鲷和黑鲷抗菌肽hepcidin的表达,已知LPS通过免疫信号通路诱导的hepcidin表达与免疫应答相关,而BaP暴露引起的hepcidin表达是否也是通过相似的免疫信号通路及具有相似的免疫作用,鲜有报道。本研究选用海洋模式生物——海水青鳉为研究对象,利用转录组学比较分析了环境浓度的污染物BaP和免疫因子LPS暴露后的免疫相关差异基因及其免疫相关差异信号通路的异同,揭示了 BaP暴露与LPS刺激诱导表达hepcidin的信号通路。在转录组学发现BaP暴露大量与活性氧（ROS）相关的差异基因基础上,深入探讨了 BaP暴露后产生ROS的免疫毒性效应机制。本研究对深入理解鱼类在复杂环境中如何生存以及污染物对鱼类的免疫毒性效应机制具有重要的科学意义。主要研究结果如下:1)本论文以鱼类重要的先天性免疫因子抗菌肽hepcidin为参照基因,对BaP暴露和LPS刺激引起hepcidin显着表达的时间点样本进行转录组学分析。转录组数据分析结果表明,LPS刺激下456个基因被显着调控（276个基因显着上调,180个基因显着下调）,BaP暴露2d后816个基因被显着调控（228个基因显着上调,588个基因显着下调）,BaP暴露3d后347个基因被显着调控（175个基因显着上调,172个基因显着下调）。2)对免疫相关差异基因分析发现,LPS刺激引起32个免疫相关基因差异表达,BaP暴露2d引起29个免疫相关基因差异表达,而BaP暴露3d则引起25个免疫基因差异表达。进一步比较分析发现,BaP暴露与LPS刺激引起的免疫相关差异基因有显着不同（70%以上,仅有hepcidin与SELE基因在三个处理组均被显着调控）,表明BaP暴露与LPS刺激引起的免疫基因表达的信号通路不同。通过转录组学分析,也发现BaP暴露与LPS刺激引起的免疫信号通路有显着差异,即LPS刺激激活了包括NF-κB通路在内的11条免疫相关通路,而BaP暴露2 d后仅显着抑制了一条免疫相关通路——JAK/STAT通路。3)对转录组学分析发现的BaP暴露引起的免疫相关信号通路JAK/STAT进行了体外验证试验。通过在鲤鱼上皮细胞系（EPC）中转染构建了 hepcidin1启动子的pGL3质粒,并通过BaP暴露检测了 BaP对hepcidin1基因的调控通路。结果表明,BaP暴露能够有效诱导野生型hepcidin1启动子的表达,但对STAT结合元件删除的hepcidin1启动子无诱导能力。该研究表明,与炎性因子LPS不同,环境污染物BaP暴露后对hepcidin的调控主要同JAK/STAT通路相关,与其它通路如c/EBP,BMP和NF-κB等通路无关。4)研究还发现LPS刺激与BaP暴露后,青鳉的肝脏中多个免疫基因呈现交互作用。在此基础上,利用转录组测序技术研究了 LPS与BaP共处理下海水青鳉的基因表达变化。测序结果表明,在共处理12 h后,海水青鳉中多条免疫通路显着富集,免疫相关基因MHC和补体被显着性调控。随着处理时间的延长,LPS与BaP共同作用下显着调控的免疫基因与代谢相关通路增加。青鳉肝脏中核糖体功能以及物质代谢与能量转化在LPS与BaP共处理2 d后被显着抑制。单一物质处理下及12 h处理组对核糖体与线粒体的调控不显着。5)基于青鳉肝脏DIT-29细胞系高血清含量培养基,成功改良构建了瞬时检测H2O2的luminol系统,该系统检测限可达10-9mol/L,检测时间仅需2s。同时利用葡萄糖氧化酶GOX和过氧化氢酶CAT,成功在DIT-29细胞系中构建了 H2O2持续表达系统（H2O2ss）。该系统可以稳定、持续表达生理学浓度H2O2达24h以上,为后续实验提供了技术支持。6)基于转录组学发现的大量与ROS相关的基因显着表达,利用海水青鳉体内和青鳉肝细胞,深入探讨了 BaP暴露后产生的ROS的免疫毒性机制。青鳉体内试验表明BaP暴露导致NF-κB下调表达,ROS水平升高;利用ROS体外试验常用的H2O2方法,在青鳉肝细胞DIT-29中进行体外试验,结果却发现NF-κB上调表达,而ROS抑制剂可以有效抑制BaP暴露引起的NF-κB下调表达,从而证明ROS参与了 NF-κB的调节。采用luminol系统检测发现,BaP暴露可持续产生生理学浓度的ROS,并维持24 h,而H2O2刺激产生的高浓度ROS持续时间不足30 min。利用H2O2sS系统在青鳉肝细胞上进行进一步的试验发现,H2O2ss处理和BaP暴露结果一致,都能抑制NF-κB通路。由此证明,BaP暴露通过产生持续性、生理学浓度ROS,抑制了青鳉NF-κB通路的激活。本研究进一步通过westem-blot和EMSA检测证实了该试验结果。
陈同庆[4]（2018）在《胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响》文中提出人神经胶质瘤是目前已知的恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤,也是发病率较高的颅内恶性肿瘤。然而,由于神经胶质瘤恶性程度高,胶质瘤细胞有很强的增殖能力、迁移和侵袭能力、抗凋亡能力,且胶质瘤组织与周围组织分界不清,呈浸润性生长,手术治疗很难完整切除。尽管现在医疗技术非常发达,但神经胶质瘤的治疗效果仍没有显着提升,即使采用手术、化疗、放射疗法结合,其死亡率仍居高不下。因此,发现神经胶质瘤患者具有预防、诊断和治疗意义的分子靶点,对于监测和改善其恶性生物学行为具有重要的科学和临床意义。近年来,越来越多的研究显示,神经胶质瘤患者中存在人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染,及其病毒DNA和蛋白的表达,提示HCMV可能与神经胶质瘤的发生和发展存在某种联系。此外,HCMV基因产物激活多种细胞因子,可促进肿瘤的演进和血管生成,如感染早期病毒IE1基因过表达能促进肿瘤的侵袭和转移,促进胶质瘤的发展。还有研究结果显示,由于HCMV能刺激细胞生长因子的过度表达、激活原癌基因、抑制抑癌基因产物、感染细胞调控机制、增加细胞恶性特征的表达,因而在胶质瘤的发生和发展中起重要作用。基于此,本研究检测HCMV DNA、抗体,分析HCMV立刻早期基因1-72（IE1-72）蛋白和磷酸化糖蛋白65（pp65）在胶质瘤组织中表达水平,探讨IE1-72和pp65蛋白表达水平和神经胶质瘤临床病理学特征的关系,并进一步采用体外实验技术,构建IE1表达载体,成功转染入神经胶质瘤U251细胞株,观察细胞内IE1 mRNA的表达;再分别检测IE1过表达后,U251细胞的增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力的变化。目的分析神经胶质瘤患者、外伤颅脑出血患者脑组织中HCMV抗原和核酸及外周血标本HCMV IgG和IgM抗体阳性率,观察HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响,探讨HCMV与神经胶质瘤的相关性。方法随机收集39例脑胶质瘤患者瘤组织标本及血液标本为实验组（按照WTO病理学分级标准对瘤组织分类:I级星形细胞瘤3例,II级6例,III级16例,IV级14例）,收集9例外伤颅脑出血外伤颅脑出血患者的脑组织标本及血液标本为对照组。（1）取患者血液标本,密度梯度离心分离外周血淋巴细胞,检测淋巴细胞HCMV pp65抗原,ELISA方法检测血清中HCMV IgG和IgM抗体,分别计算实验组及对照组的抗原、抗体阳性率。（2）巢式PCR检测技术检测两组组织标本和外周血中HCMV DNA中HCMV UL55基因,荧光定量PCR检测其中HCMV DNA的拷贝数。（3）采用免疫组织化学实验方法分析HCMV IE1-72和pp65抗原在神经胶质瘤组织中的表达水平。（4）构建携带HCMV IE1基因的质粒pCDNA3.0-IE1,转染神经胶质瘤细胞株U125,筛选出成功转染细胞株,设为设HCMV IE1（U251-IE1）组,与细胞对照组和空质粒对照组作比较,观察转染HCMV IE1基因后神经胶质瘤U251-IE1生物学特性的变化;包括细胞增殖检测（CCK-8试剂盒法）实验,观察转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞增殖能力的影响,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析转染HCMV IE1基因后,是否影响神经胶质瘤细胞抗凋亡作用,细胞划痕实验和Transwell实验分析转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。结果（1）外周血HCMV-IgG、IgM抗体检测结果:39例神经胶质瘤患者外周血抗原血症检测结果均为阴性;36例患者（36/39,92.3%）HCMV IgG抗体阳性,显着高于对照组（χ2=33.2,P<0.01）;7例（7/39,17.9%）HCMV IgM抗体阳性,与对照组无显着差异（χ2=1.89,P>0.05）;对照组9例IgG抗体及IgM抗体均阴性。胶质瘤组织和外周血中抗人巨细胞病毒IgM阳性率与病毒DNA拷贝数呈显着正相关（r=0.76,P<0.01）。HCMV IgM阳性患者的神经胶质瘤组织HCMV IE1-72和pp65抗原蛋白均阳性;3例HCMV IgG阴性患者的血液及瘤组织HCMV DNA结果阴性。（2）实验组胶质瘤组织标本及外周血HCMV DNA实验结果:实验组25例（25/39,64.1%）患者瘤组织细胞检出HCMV UL55基因,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、50%（3/6）、68.8%（11/16）、64.3%（9/14）;25例基因阳性患者中23例神经胶质瘤组织的IE1-72和pp65蛋白抗原均为阳性,另2例HCMV DNA检测阳性的神经胶质瘤组织IE1-72和pp65阴性。同时,有5例IE1-72阳性的标本未检出HCMV DNA。对照组9例外伤颅脑出血患者的脑组织中均未检出HCMV DNA。巢式PCR技术检测胶质瘤20例（20/39,51.3%）患者外周血HCMV DNA阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、33.3%（2/6）、50%（8/16）57.1%（8/14）。外周血HCMV DNA阳性率与脑胶质瘤组织中HCMV的检出无显着相关性;5例患者外周血HCMV DNA检测阴性,而神经胶质瘤组织HCMV DNA均检出为阳性。DNA测序证实所有PCR扩增产物的序列与HCMV UL55完全一致。在神经胶质瘤每500ng组织中及外周血液中平均log10 HCMV DNA拷贝数分别为（3.75±1.60）、（2.88±1.20）,对照组分别为（1.66±0.19）、（1.54±0.12）;实验组胶质瘤组织标本及血液标本HCMV DNA阳性率均显着高于对照组（P<0.01）,在神经胶质瘤组织和外周血中HCMV DNA拷贝数均低于典型的活动性感染时HCMV DNA拷贝数（平均log10 HCMV DNA拷贝数为9.507）。（3）组织标本免疫组化检测结果:实验组共有30例（30/39,76.9%）神经胶质瘤患者瘤组织HCMV IE1-72为阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、83.3%（5/6）、75.0%（12/16）、78.6%（11/14）;26例（26/39,66.7%）神经胶质瘤患者瘤组织HCMV pp65阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、66.7%（4/6）、56.3%（9/16）、78.6%（11/14）。其中26例pp65阳性标本其IE1-72均为阳性,30例IE1-72阳性的标本中4例为pp65阴性;而对照组9例外伤颅脑出血患者脑组织HCMV IE72和pp65抗原均阴性;实验组HCMV IE1-72及PP65阳性率均显着高于对照组（P<0.01）。（4）HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响:向U251细胞内转染HCMV IE基因后筛选成功转染细胞株,CCk-8法实验结果显示转染HCMV IE1基因后U251细胞的增殖能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强（P<0.05）,而空质粒对照组和细胞对照组细胞的增殖能力无显着性差异,表明HCMV IE1基因具有促进神经胶质瘤细胞增殖的能力;流式细胞术分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的凋亡水平发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的抗凋亡能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强,而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显着性差异,表明HCMV IE1基因能显着抑制神经胶质瘤细胞凋亡;Transwell实验分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的迁移和侵袭能力发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的迁移和侵袭能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强（P<0.01）,而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显着性差异;划痕实验结果显示转染HCMV-IE1后U251细胞株迁移能力显着增强（P<0.01）。结论HCMV感染与神经胶质瘤存在相关性,HCMV可能通过IE1等多种分子信号途径参与神经胶质瘤的发生和发展。
汪丽萍[5]（2017）在《Rictor/mTORC2通路在卵子发生与早发性卵巢功能不全中的作用及其机制研究》文中认为一、研究背景与目的早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency,POI）是指女性40岁之前,原发性或继发性闭经至少4月（排除妊娠后）,血清性激素水平低下（主要是E2）、抗苗勒氏管激素降低,和促性腺激素水平升高（主要是FSH）,伴随生育力的丧失。随着社会经济的快速发展,职场女性精神压力剧增,加至基因、环境因素的综合影响,POI的发病率呈上升趋势。POI患者由于功能性卵泡的丧失,面临不育、更年期综合征等一系列健康问题,也提高了心血管疾病,骨质疏松骨折、老年痴呆等老年退行性疾病的易感性,严重影响女性的生存质量。POI的发病机制非常广泛,包括染色体基因异常、自身免疫病多器官受累、代谢因素、感染和医源性因素等。不同于自然状态的更年期,约500%的POI患者卵巢功能不可预知,约5%10%的患者,在诊断POI后,仍然可以妊娠、分娩。大约650%的POI患者属于特发性,无病因可循,而且在出现临床症状之前,卵泡耗竭已经发生。故探索卵泡衰竭的分子机制,了解卵子发生、凋亡闭锁的机理,可为临床pOI的治疗策略提供新思路。哺乳动物的卵子发生是一个循序渐进的过程,经历复杂的形态变化和细胞分化。由初级卵母细胞经过-一系列减数分裂和形态变化,形成成熟卵子的过程称为卵子发生。卵泡生长指静止休眠状态的始基卵泡,被募集选择,发生一系列生化和形态变化,直至卵泡成熟,周期性排卵或卵泡凋亡闭锁。当获能的精子穿透次级卵母细胞透明带,产生顶体反应,卵母细胞迅速完成第二次成熟分裂,卵原核和精原核的染色体融合,形成二倍体的受精卵。GCs及卵泡膜细胞对正常卵子发生至关重要,卵泡数量不足或卵泡凋亡闭锁加速,将导致POI。然而,参与卵子发生过程中的一些信号通路,尤其是一些新的信号转导通路及其调节机制仍不明确,探索这些信号通路在卵子发生,以及POI中的分子机制仍将是今后研究的热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin,mTOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可接受并整合细胞内和细胞外的各种信号通路的刺激,如激素、生长因子、营养、能量代谢等,进而调节蛋白质的翻译、细胞的生长、存活、自噬与代谢等生理过程。在细胞内,mTOR以mTORC 1/2两种复合物的形式存在,其形态结构和功能的改变,与复合物存在的形式有关。而且二者在功能上截然不同,分别接受各自的上游蛋白信号,调节各自下游蛋白的生理功能。其中,mTORC1的活性能特异性地被雷帕霉素所抑制,mTORC2中含有雷帕霉素不敏感的组分Rictor,故其活性不受雷帕霉素的影响。关于Rictor蛋白的结构及各结构域的作用与上、下游的调节机制了解较少,目前认为Rictor/mTORC2可磷酸化Akt（Ser473）,促进细胞存活与调节细胞骨架重组。mTORC2在卵泡发育与POI中的作用及调节机制亦不清楚,最近有研究发现去氧乙烯基环己烯（4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD）在诱导卵泡大量凋亡的同时,能抑制卵泡中PI3K信号通路的活性。VCD是生产杀虫剂、灭火剂、塑料和橡胶等的中间产物,由于其具有严重的卵巢毒性,会导致女性POI而丧失生育能力。我们在前期的工作中发现4-VCD在导致POI的同时,抑制了 Rictor/mTORC2信号通路的活性,但Rictor/mTORC2在卵泡发育与POI发生中的作用及调节机制尚不清楚。本课题通过Cre-loxP重组酶系统,构建卵泡特异敲除Rictor的小鼠为模型,结合4-VCD导致POI动物模型,应用组织学,胚胎学及细胞分子生物学方法,从分子、细胞与整体水平阐明mTORC2在卵子发育和成熟、卵泡凋亡闭锁、卵巢功能及早期胚胎发育中的作用,并探讨其可能的调控机制,为卵子发生的调节机制和POI的发病机制提供新内容,为女性POI相关疾病的防治提供实验依据和潜在的治疗靶点。二、研究方法1、应用Cre-IoxP系统（Rictor-loxp、ZP3-cre）构建卵泡细胞特异性Rictor基因敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot和免疫组织化学确定基因敲除效果。2、通过HE染色、免疫组织化学以及免疫荧光技术分析Rictor/mTORC2对小鼠子宫大小,卵巢组织形态和各级卵泡和黄体数量的影响。3、通过TUNEL检测Rictor/mTORC2对小鼠卵泡发育凋亡闭锁的影响。4、通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对敲除小鼠血液进行生化分析,检测Rictor/mTORC2对小鼠血清性激素变化的影响。5、通过流式细胞技术检测Rictor/mTORC2对小鼠卵母细胞细胞周期的影响。6、通过免疫荧光技术、western blot技术、Pulldown以及免疫共沉淀技术分析Rictor/mTORC2对卵泡凋亡和卵巢内分泌、胚胎发育的影响及相关的分子机制。7、通过给予正常小鼠4-VCD处理,建立POI动物模型,探讨Rictor基因在此模型中的作用。三、研究结果1 4-VCD破坏早期卵泡发育,并且抑制卵泡Rictor/mTORC2信号通路的活性为了探讨mTORC2在POI中的作用,首先在4-VCD处理后的卵巢种对mTORC2信号通路的中心成分Rictor的活性进行检测。与对照鼠相比,VCD处理的小鼠中始基卵泡的数量减少了45%,初级卵泡减少了55%,但VCD对更高级的卵泡作用很微弱,对照组与处理组之间基本相近。有趣的是,在VCD处理过的卵巢中,Rictor的一种活性抑制状态——磷酸化Rictor（p-Rictor,Thr-1135）的表达水平明显上升。众所周知,Rictor作为mTORC2的核心组分通过在各种环境下磷酸化并活化Akt,并通过Akt磷酸化并抑制作为细胞凋亡转录因子Foxo3a的活性来促进细胞的存活。与预期的相一致,VCD处理后,卵巢中p-Akt（Ser-473）和p-Foxo3a（Ser-253）的表达量减少了。与此同时,三种经典的促凋亡蛋白Bad,Bax和cleaved-PARP的表达量明显上升。作为SGK1的活性指标,NDGR1在Thr-346位点的磷酸化在对照组和VCD处理组小鼠的结果很接近,这说明mTORC2的另一种下游底物血清-糖皮质激素诱导型蛋白激酶1（SGK1）并没有改变。另外,我们发现S6K1的活性（p-S6K1,Thr-389）表达量反而上升。这些结果与前人报道的体内结果一致,S6K1介导Rictor Thr-1335位点的直接磷酸化,进而抑制S6K1的活性,形成了一个依赖于mTORC1并针对mTORC2的抑制反馈回路。Rictor的磷酸化与失活在VCD介导的卵泡凋亡中可能发挥重要作用。2卵母细胞中Rictor基因的缺失模拟POI的表型为了进一步阐明Rictor/mTORC2对卵泡存活的作用,应用Cre-loxp系统成功构建了卵母细胞特异性敲除Rictor的小鼠。与所预期的一样,在同窝的对照组小鼠的卵泡中检测到了 Rictor的表达,而在敲除小鼠内并没有发现,这说明Cre酶成功实现了对Rictor基因的重组,卵泡细胞特异性敲除Rictor的小鼠构建成功。同时,Rictor基因的缺失也引起了 p-Akt（Ser-473）表达量的降低。有趣的是,mTORC1的下游靶蛋白p-S6（S235/S236）的表达明显减少,这个现象在黄体中尤为明显。以往的研究表明,mTORC2通过激活Akt进而抑制mTORC1的负调控因子（TSC1/2）来活化mTORC1,由此可见,我们的研究结果与以往报道的结果高度一致。我们进一步检测了 Rictor/mTORC2信号通路下游蛋白的表达。Rictor的缺失引起了 p-Foxo3a的表达减少,同时,Bad,Bax和cleaved PARP表达增多。免疫组化的结果也通过Western Blot分析得到了证实。由此可见,卵母细胞中特异性敲除Rictor所引起的控制卵泡生存的潜在信号通路的变化与VCD基本一致。这些结果一致表明Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡过程中的起着核心作用。3卵巢中Rictor缺失引起卵泡细胞凋亡和卵泡丢失随后,我们检测了敲除小鼠中卵泡的数量。敲除小鼠的外形和体格生长发育正常,但子宫则较对照鼠小,在8月龄时,子宫重量只有对照鼠的45%（p<0.05）。随后对敲除小鼠的卵巢进行形态学观察,发现健康卵泡和黄体的数量均明显减少,同时闭锁卵泡明显增多,这一结果与促凋亡蛋白的过度表达是相吻合的。需要引起注意的是,在8月龄的敲除小鼠中,卵泡数量很少,几乎很难观察到。为了更精确地判断Rictor基因敲除对卵泡减少的影响,我们对每个卵巢选取了 5张切片,对不同发育阶段的卵泡进行了分类和计数。与对照鼠相比,6月龄时,条件敲除小鼠的健康卵泡减少了 40%,黄体减少了 50%。至8月龄时,敲除小鼠的健康卵泡减少了 67%,黄体减少了 71%（p<0.001）,这表明卵泡细胞缺失Rictor基因,导致卵巢出现卵泡渐进性丢失。众所周知,排卵后残留的卵泡壁塌陷,卵泡膜的结缔组织、毛细血管等伸入到颗粒细胞（GCs）层,在LH作用下演变成体积较大,富含毛细血管并具有内分泌功能的黄体。黄体中GCs占大多数,黄体数量的减少意味着排卵的减少,或者提示可供发育成熟并排卵的卵泡储备不足。造成这种现象的原因可能是由于卵泡的过度耗竭,使得窦前卵泡到窦状卵泡、成熟卵泡的发育过程受阻所致。结合实验结果来看,过度的卵泡凋亡可能是更主要的因素,我们发现在敲除小鼠的卵巢中检测到了更多的闭锁卵泡（p<0.01）。为了进一步确定卵泡耗损具体发生在卵泡发育的哪个阶段,我们进一步分析了各个发育阶段卵泡的数量。尽管相对于对照鼠,敲除小鼠小卵泡（包括始基卵泡和初级卵泡）的数量降低,但是差异并不明显。前人的研究已经证实Zp3-Cre介导的基因敲除发生在初级卵泡以及其之后的发育卵泡的卵母细胞上,从常理上讲,卵泡中Rictor基因的缺失应该不会引起始基卵泡的大量损失,这与实际上观察到的结果是相吻合的（p<0.01）。此外,在8月龄的条件敲除小鼠的卵巢中观察到了窦卵泡和成熟卵泡的大量凋亡,这一结果与条件敲除小鼠卵巢中促凋亡蛋白表达水平显着上调的结果是一致的。以上结果表明,卵巢中Rictor基因的缺失促进了卵母细胞的凋亡,从而引起卵泡的大量耗损,由此导致卵巢储备功能降低。4卵母细胞内Rictor敲除导致小鼠生育能力下降通常情况下,卵泡储备的下降会导致雌鼠生育能力的下降。为了进一步检测条件敲除小鼠的生育能力,我们分别将4、6、8月龄的对照小鼠和敲除小鼠与已被证实有生育能力的野生型C57雄鼠进行交配。正如所预期的一样,敲除小鼠随着年龄的增大,生育能力下降。所有对照小鼠均成功妊娠,并正常分娩幼崽,然而在敲除小鼠组,4月龄和6月龄组内各有1只（11%）在为期两个月的观察期内未能成功受孕。更严重的是,所有8月龄的条件敲除小鼠都出现不育。值得注意的是,来自4月龄组的1只小鼠（11%）和来自6月龄组的4只小鼠产褥期死亡,同时伴发稽留流产和死胎。并且,在敲除小鼠组,成活的幼崽数明显比对照组的少,成功分娩率较对照小鼠降低。因此,敲除小鼠的生殖能力随着年龄的增长而下降,而且自8月龄开始出现不育。5卵母细胞内Rictor敲除小鼠的激素分泌异常作为生殖腺,卵巢在很大程度上受促性腺激素（如FSH和LH）的调节,同时分泌性激素（如E2、P4）。因此,我们检测了敲除小鼠的性激素水平。敲除小鼠FSH和LH的水平都比对照鼠相应的激素水平高,但差异并没有统计学意义（p>0.01）。考虑到敲除小鼠出现卵泡发育的阻滞和不排卵的表型,并且因为FSH促进卵泡发育,LH调节排卵,所以这些变化可能预示着存在某种正反馈效应。与此相反,敲除小鼠的雌二醇和孕酮的分泌都明显下降（p<0.01）,尤其是孕酮,与对照鼠的孕酮水平相比几乎减少了一半（p<0.05）。黄体是雌性体内雌二醇的重要分泌源和孕酮的唯一来源,敲除小鼠卵母细胞凋亡,成熟卵泡减少,排卵减少,功能性黄体减少,自然引起性激素分泌的不足,间接导致了生育能力的下降。6来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的因为Zp3-Cre介导的基因重组特异的发生在卵母细胞中,所以,它不仅是一个非常好用的工具,用于研究目的基因在卵子生成过程中的生理功能,还被广泛的用于探索胚胎发育期间母系遗传的影响。最近一项研究利用破坏多等位基因的方法使Rictor基因失活,发现mTORC2对胚胎生长和发育发挥重要的作用。为了进一步明确来自母本的Rictor基因对胚胎发育是否必需,我们将性成熟的雌性敲除小鼠（Zp3-Cre+,Rictorloxp/loxp 排卵后的卵母细胞细胞缺失Rictor基因）和对照小鼠（Zp3-Cre-,Rictorloxp/loxp正常的卵母细胞）与具有生育能力的野生型C57雄鼠交配。在这个交配组合中,来自于条件敲除小鼠卵泡细胞的胚胎缺少母系遗传的Rictor基因,产生具有-/Rictor基因型的胚胎。但是我们并没有观察到对照小鼠和敲除小鼠胚胎之间有任何明显的解剖或组织学上的差异。虽然在每个特定观察时间点（E5,E10,E15）条件敲除小鼠的胚胎数目较对照组少,但是在整个观察期中（E5到E10）,对照组和条件敲除组小鼠胚胎的总数分别保持相对稳定,在E5时,对照组是57个胚胎,敲除组是45个,比对照少。同样,其它两个时间点也是如此。但对于敲除组来说,从45到41,再到42,从时间点的变化上看数量相对稳定,也就是在胚胎发育过程中胚胎并没有明显减少,不会在发育过程中因为胚胎异常而死亡。而每个时间点胚胎数量减少是因为卵泡过度凋亡,卵巢排卵少导致的。这证明母系遗传的Rictor基因缺陷对正常胚胎发育没有影响。此外,对照鼠和敲除小鼠的胚胎在每个时间点的平均数量很接近。除此之外,组织形态学分析显示条件敲除小鼠E16的胎盘并无没有明显的形态学和组织学异常,而且滋养层细胞的标志蛋白-胎盘催乳素（PL-1）,与对照小鼠的表达和分布基本一致。尽管条件敲除小鼠死胎发生率增加,但是幼崽外观并没有任何明显的发育缺陷。但是对照鼠和条件敲除小鼠的子宫组织学差异显着,条件敲除小鼠子宫腔的体积更小,而且分泌腺也明显减少,这些子宫组织形态学的异常很容易导致胚胎丢失。这些结果表明,仅仅具有父系遗传的Rictor基因对于整个胚胎发育过程已经足够了。综上所述,4-VCD破坏早期卵泡的发育,并且抑制Rictor/mTORC2信号通路的活性,小鼠卵泡中Rictor基因缺失,导致PO1,主要表现为过度的卵泡凋亡和闭锁,进而导致小鼠生育力的下降,敲除小鼠的FSH和LH水平比正常对照鼠的高。来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。四、结论1、在VCD诱导的小鼠POI模型中,Rictor/mTORC2信号通路的活性下降;2、成功构建了卵泡特异性敲除Rrictor的条件基因敲除小鼠模型;3、卵泡中Rictor基因缺失引起引起小鼠卵泡过度凋亡和闭锁,出现POI的表型;4、Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡的过程中起核心作用;5、卵泡Rictor基因敲除的小鼠生育力下降;6、来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。综合上述,本研究发现Rictor/mTORC2在卵子发生、卵泡细胞存活与维持雌性生殖能力中起重要作用,卵泡特异性敲除Rictor的小鼠是研究POI的理想模型。
郁川[6]（2013）在《鸡β2-微球蛋白在马立克氏病毒感染与致肿瘤中的作用研究》文中研究表明β2-微球蛋白（β2-microglobulin, β2m）由Berggard于1968年首次从肾小管病变患者的蛋白尿中分离出来,是一种非糖基化小分子蛋白,所有有核细胞均可合成。研究证实,β2m作为主要相容性复合体I（major histocompatibility complex, MHC）类分子的恒定链（轻链）,对MHC-I类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。β2m的功能研究发现,在人类一些肿瘤中,β2m与肿瘤的生存、侵袭、凋亡,甚至转移有关。虽然β2m为肿瘤治疗靶位以及致肿瘤机制的深入研究提供了新的途径,但p2m在肿瘤中的生物学功能目前仍不十分清楚。马立克氏病（Marek’s Disease, MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s Disease virus,MDV）引起的一种鸡的高度接触、传染性的恶性淋巴肿瘤性疾病。MDV是世界上第1个能用疫苗免疫预防的肿瘤疾病。正常细胞和癌细胞表达的β2m蛋白以及在临床上的应用已成为近年来人们研究的热点。本实验室在前期蛋白质组学研究中发现,在MDV感染鸡皮肤和法氏囊中鸡p2-微球蛋白（chicken β2-microglobulin, chβ2m）异常表达的现象。然而chβ2m研究相对较少,并且对chβ2m在肿瘤与致病中的作用目前没有报道,因此,对chβ2m在MDV感染过程中作用研究,不仅可为全面了解MDV的致病机制,有效控制MD发挥重要作用,重要的是可为人类癌症新的治疗靶位发现提供借鉴,有十分重要的理论意义。1.鸡β2-微球蛋白的克隆与原核表达本研究通过RT-PCR从正常免疫鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360bp,编码120个氨基酸,与已登录的chβ2m序列（GenBank:M84767.1, AY989898, Z48921）相一致,同源性为100%；然后将其克隆入pET-32a（+）,经0.8mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清；利用His标签纯化该蛋白,SDS-PAGE分析仅见约34kDa大小的chp2m融合蛋白条带；western blot分析表明,纯化后的chp2m融合蛋白可与抗His单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）发生反应。以上结果证实,本研究成功克隆chp2m基因并获得原核表达载体pET-32a-chβ2m,利用该表达系统能够纯化得到大量可溶性chβ2m融合蛋白,可为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。2.鸡β2-微球蛋白优势多肽序列的选择与单克隆抗体的制备本研究对chβ2m与人、小鼠等其他种类β2m序列比较及抗原性分析后,选取chβ2m羧基端29个氨基酸序列合成多肽（NH2-TPSSGSTYACKVEHETLKE PQVYKWDPEF-COOH）免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选抗chp2m mAb并对其特性进行鉴定。结果筛选出五株抗chp2m mAb, IgG亚类鉴定1E2,2E9,7D5为IgM型,3D1与6E7属于IgG1/κ型；Western blot和间接免疫荧光分析发现,抗体6E7与3D1同人和小鼠β2m无交叉反应性,仅能识别转染pcDNA3.1-chβ2m的293T细胞和HD11细胞中的chp2m抗原；血清Western blot显示,抗体3D1可识别鸡血清和血浆中的chp2m,而与牛和鸭血清无任何反应；流式细胞术表明3D1可以与MSB1细胞中天然的chp2m反应；另外,通过免疫组化分析发现,在胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官均能表达chp2m,但不同区域细胞的表达水平具有差异性。以上结果均证实,本研究成功筛选出抗chp2m单克隆抗体,其具有良好的特异性,适用于多种免疫化学技术,可为进一步探索β2m在免疫学与致病过程中的功能研究提供有力的工具。3.稳定表达鸡p2-微球蛋白293T细胞的筛选与鉴定本研究将重组真核表达质粒pcDNA3.1-chβ2m通过脂质体转染人胚肾上皮细胞系293T后,利用zeocin筛选能稳定表达chp2m的细胞系293T-chβ2m,并对其表达情况进行鉴定。结果显示,质粒转染72h后,加入药物zeocin （500μg/ml）筛选4周后获得药物抗性细胞；Western-blot鉴定发现chβ2m不仅可在抗性细胞中高效表达,其上清中也可检测到分泌的chβ2m;间接免疫荧光表明,抗chβ2m抗体能够检测到抗性细胞内chβ2m呈强荧光反应；应用免疫共沉淀方法筛选能够与chβ2m在293T细胞中结合的免疫相关蛋白,未发现chβ2m与人MHC-Ⅰ结合的现象。以上结果证实,本研究成功筛选出能稳定表达chβ2m的细胞系293T-chβ2m,不仅可为获取真核表达的chβ2m提供材料,也可为β2m可能的相互作用蛋白研究提供借鉴。4.鸡β2-微球蛋白及其MHC-Ⅰ在马立克氏病毒感染不同细胞中的基因表达本研究以MDV meq作为MDV感染标示分子,应用荧光定量PCR技术对chβ2m、MHC-I和Meq在MDV感染不同细胞中基因表达水平进行检测。结果显示,在BUdR刺激下,MDV淋巴癌细胞系MSB1中Meq基因表达水平随着培养时间不断上调（48h, P<0.01）,chp2m基因表达水平于培养后24h上调显着（P<0.01）,48h虽然上调,但上调不显着（P>0.05）,而MHC-Ⅰ随着培养时间显着下调,特别是48h后MHC-Ⅰ下调显着（P<0.01）；通过GA株感染CEF后发现,Meq基因表达水平在MDV感染的CEF细胞中逐渐上调,于感染后120h （hours post-infection）达到最高峰,MHC-Ⅰ在MDV感染CEF前期24hpi较对照组明显升高（P<0.05）,在120hpi显着低于对照组（P<0.05）,而chβ2m在前期显着上调,于24hpi和120hpi（P<0.01）上调显着;另外,我们调查了MDV RB1B株感染鸡外周血淋巴细胞内表达情况,发现Meq基因表达水平于感染后第7天（dpi）开始表达,28dpi达到高峰,chp2m与MHC-I在感染前期显着上调（4dpi, P<0.01）,只有在MDV感染潜伏期（14dpi,28dpi）, MHC-I与chp2m同对照组相比明显下调（P<0.01）,感兴趣的是于35dpi后chp2m与MHC-I又恢复上调趋势。研究结果表明,chβ2m与IHC-I在MDV感染不同细胞中呈波动式变化,与MHC-I相比,chβ2m在感染前期出现异常表达上调,这提示chp2m在MDV感染过程中具有潜在的功能。另外,我们发现chβ2m与MHC-I表达不一致的现象,其机理有待于进一步研究。5.抗鸡β2-微球蛋白单克隆抗体对MSB1细胞的作用及机制本研究在正常培养的MSB1细胞中加入不同浓度chp2m抗体后利用CCK-8法检测细胞生长活力,然后通过Annexin V/PI流式细胞术、DNA ladder和DAPI核染色观察chp2m抗体对MSB1细胞的凋亡情况,并利用Real-time PCR检测凋亡相关信号分子caspase-3.8.9的表达。结果显示,加入20.40.60.80μg/mL chβ2m抗体后,60μg/mL （P<0.05）和80μg/mL （P<0.01） chβ2m抗体共培养的MSB1细胞生长活力显着低于同浓度IgG对照组和正常培养细胞空白组,且随着培养时间的增加chp2m抗体（80μg/mL）对MSB1细胞生长抑制活力显着增加；流式细胞术分析发现,于48h后chβ2m抗体（80μg/mL）可明显引起MSB1细胞的凋亡,AnnexinV+阳性细胞可达51.7%; DNA ladder和DAPI核染色观察发现,chβ2m抗体（80μg/mL）与MSB1细胞作用48h后,可见典型的凋亡中后期细胞基因组断裂形成的梯带和DAPI核染出现的核浓缩、不规则等明显的凋亡特征；Real-time PCR检测caspase-3.8.9等信号分子表达显示,在加入chβ2m抗体后caspase-9和caspase-3较IgG对照组表达明显上调（P<0.01）,而caspase-8在基因水平上无明显的差异。以上结果表明,利用抗体阻断chp2m后可通过caspase-9和caspase-3的高表达引起MDV肿瘤细胞MSB1的凋亡。6.鸡胚成纤维细胞过表达鸡β2-微球蛋白对MDV感染复制的影响在前期研究中发现,chβ2m在MDV感染不同体内外细胞中异常表达的现象。为初步探索鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts, CEF）过表达chp2m对MDV感染复制的影响。本研究通过MDV感染CEF细胞后利用脂质体转染的方法将不同浓度pcDNA3.1-chp2m（4μg,0.4μg）与pcDNA3.1对照质粒（4μg）分别转染CEF细胞,于转染后不同时间点应用Real-time PCR检测不同转染组细胞内gB、meq以及chβ2m的基因表达水平。结果显示,在转染4μgpcDNA3.1-chβ2m的CEF感染组中,chp2m随着培养时间的延长表达水平不断升高,于培养后72h较pcDNA3.1-chβ2m0.4μg转染组和pcDNA3.1空载体转染组上调极显着（P<0.01）；随着chβ2m在细胞内表达的提高,MDV gB与meq基因表达水平较低浓度转染组（0.4μg）和空质粒转染对照组都明显提高（72h, gB P<0.01; Meq, P<0.05）,而chβ2m、gB与meq mRNA水平在低浓度转染组与转染对照组之间无显着差异。以上结果表明,MDV在体外过表达chβ2m CEF细胞中其感染复制能力相应上调,可为chβ2m在MDV-宿主相互作用关系中的作用研究提供理论价值。
朱然[7]（2011）在《BTG1基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究》文中研究表明目的:研究BTG1基因高表达对乳腺癌细胞的生长增殖、凋亡和浸润、转移、和放射敏感性影响及其相关作用机制,为BTG1作为新的预测乳腺癌发生和转移的新分子标志物、基因治疗的新靶点和在放射治疗调节中的作用提供临床前的理论基础和实验依据。方法:1、参照GeneBank中BTG1的基因序列,通过自行设计并扩增得到BTG1基因cDNA的引物一对,并构建携带人类全长BTG1 cDNA的pcDNA-BTG1真核表达载体;2、应用阳离子脂质体Lipofactamin2000介导将pcDNA-BTG1质粒转染到乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中,通过在含G418的培养基中培养筛选获得耐G418的克隆,最后采用RT-PCR和Western Blot法检测细胞克隆中BTG1的mRNA和蛋白表达水平,并对细胞的遗传稳定性进行鉴定。3、MTT法检测细胞的增殖活性;流式细胞仪法检测细胞周期分布和磷脂酰丝氨酸外翻法检测凋亡; Western blot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白表达变化。4、细胞划痕法观察细胞体外迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力;Western blot检测细胞浸润转移相关蛋白的表达变化。5、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察BTG1对体内肿瘤组织细胞生长增殖的影响;用免疫组化法分析Bcl-2表达情况和TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况。6、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察BTG1在体内对肿瘤组织血管密度和血管数目,免疫组化法分析肿瘤微血管生成和VEGF表达情况。7、克隆形成法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞存活分数,分析BTG1基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。8、流式细胞仪法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞周期分布和凋亡;Western blot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白、DNA损伤修复、参与DSB的非同源末端连接修复途径的相关蛋白的表达变化。9、荧光定量PCR检测接受X射线照射后乳腺癌细胞BTG1和DNA损伤修复相关基因mRNA水平变化;彗星实验检测DNA损伤和修复情况;免疫荧光原位杂交法检测γH2AX的foci过程;荧光探针法检测γH2AX和ROS变化。10、染色体畸变分析检测接受X射线照射对乳腺癌细胞基因组稳定性的影响。11、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察接受X射线照射后荷瘤裸鼠的体重、生存期和肿瘤生长的影响;免疫组化分析肿瘤血管分布、微血管生成和VEGF表达情况,检测肿瘤浸润转移的情况;免疫组化分析Bcl-2的表达和TUNLE末端染色法检测肿瘤坏死和凋亡的情况。结果:1、构建携带有全长BTG1 cDNA的pcDNA3真核表达载体,经过基因测序,证实pcDNA3-BTG1质粒构建成功。2、建立BTG1高表达的稳定转染乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株,经检测BTG1基因的mRNA水平和蛋白水平显现高表达,且遗传性状稳定。3、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长速度减慢,细胞增殖能力降低;高BTG1表达的乳腺癌细胞中Cyclin D1、Cyclin B1和CyclinE1蛋白表达水平下降,细胞周期的G0/G1期细胞比例升高。4、与对照组细胞相比,BTG1高表达的乳腺癌细胞出现凋亡,Sub G1峰明显升高,磷脂酰丝氨酸外翻增多,细胞晚期凋亡明显;而且细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达水平升高。5、BTG1高表达对乳腺癌荷瘤裸鼠模型体重无明显影响,但与对照组荷瘤裸鼠相比,接种BTG1高表达的MDA-MB-231/BTG1裸鼠模型的肿瘤生长率明显降低,平均瘤重和平均瘤体积均低,且肿瘤组织内瘤细胞密度减少。BTG1高表达的肿瘤组织内BTG1蛋白显高表达,但Bcl-2表达水平降低,并有的细胞出现核固缩、呈碎片状,不规则,大小不一致,即凋亡细胞出现。其它对照组裸鼠的肿瘤组织内未见凋亡细胞。6、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞划痕实验所产生的间隙较宽,Transwell侵袭实验穿过基质胶膜到达下层的细胞明显减少。转基因组细胞核转录因NF-κB、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均低于对照组细胞,而E黏附蛋白表达水平则明显高于对照组细胞。7、荷MDA-MB-231/BTG1乳腺癌裸鼠模型,BTG1可抑制乳腺癌肝转移,肿瘤组织内血管密度明显降低,血管数目显着下降,VEGF呈现低水平表达。8、与各对照组细胞相比,BTG1高表达使乳腺癌细胞辐射照射后的存活分数显着下降,剂量-效应曲线左移,表现为细胞放射敏感性提高。9、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞受照后均出现G2/M期阻滞,S期细胞明显减少。BTG1基因高表达,使乳腺癌细胞受照后的细胞凋亡率增高,且随辐射剂量的增加而增加。10、与各对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞受到X-射线照射后, Cyclin D1、Cyclin B1、Cyclin E1、Bcl-2、磷酸化Akt蛋白表达水平降低,Bax、caspase-3和Bad表达水平上调,而NF-κB水平则未发生明显变化。另外,BTG1高表达细胞受照后,引起DNA损伤修复相关蛋白水平的变化,包括磷酸化P53水平上调,磷酸化ATM和磷酸化CHK2表达水平下调,但BRCA1、RAD51和MRE11表达未见明显改变。DSB的非同源末端连接修复途径的Ku-70、Ku-80、DNA-PKcs、XRCC4的表达水平下调,DNA-PKcs水平未见任何改变。11、与各对照组细胞相比, MCF-7/BTG1细胞受照射后BTG1 mRNA水平小幅升高,照射后1小时达到最高,随后在2-24小时内逐渐降低。与各对照组细胞相比, MCF-7/BTG1细胞中DNA连接酶ligaseⅣ的mRNA水平在照射后1小时达到最高,随后降低。12、与各对照组细胞相比, MDA-MB-231/BTG1和MCF-7/BTG1细胞受照后彗星尾长和尾距加大、尾部DNA含量增大,且显现照射剂量-效应关系;照后0h～24h DSB损伤及修复过程中,MDA-MB-231/BTG1和MCF-7/BTG1细胞的拖尾长度明显长,拖尾率以及DNA迁移到尾部的比例也明显高,且具有统计学意义。13、MCF-7/ BTG1细胞照射后γ-H2AX位点数明显高于对照组细胞,且具有统计学意义;而且γ-H2AX荧光强度也明显高于对照组细胞,具有显着差异。14、照射后MDA-MB-231/BTG1细胞内其ROS荧光强度明显高于对照组细胞,且具有统计学意义。15、与各对照组细胞相比,受照后BTG1高表达的乳腺癌细胞染色体畸变率增加。16、与各对照组动物相比,荷MDA-MB-231/ BTG1细胞荷瘤裸鼠受辐射治疗照射后体重最重,肿瘤生长率明显降低,平均瘤重和平均瘤体积均最低,生存期延长;荷MDA-MB-231/BTG1细胞荷瘤裸鼠受照后肿瘤细胞密度和血管密度最低,未见VEGF表达,Bcl-2显弱表达,并可见大量凋亡细胞。结论:1、提高转染pcDNA3-BTG1质粒可以提高乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中BTG1表达水平,而且BTG1外源基因可以在细胞中稳定、持续、高效地表达。2、BTG1高表达能明显抑制乳腺癌生长增殖、促进凋亡,其可能的机制与BTG1参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡相关。3、BTG1高表达可抑制乳腺癌侵袭转移,其可能的机制与下调NF-κB、MMP-2、MMP-9的表达有关,还与抑制肿瘤血管生成、抑制VEGF生成相关。4、提高BTG1表达能提高乳腺肿瘤的放射敏感性,其机制可能与BTG1参与细胞周期调控、G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡相关;与BTG1影响凋亡通路相关蛋白表达水平有关;与BTG1参与调控ATM通路、DNA损伤修复通路、DSB修复阻滞相关;与BTG1促进ROS生成,清除自由基相关。
李文海[8]（2008）在《抗肺癌中药单体的筛选及水飞蓟素抑癌机制研究》文中进行了进一步梳理肺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈上升趋势。在我国数个大中城市中,肺癌的发病率、死亡率均已占男性恶性肿瘤的首位,女性恶性肿瘤的第二位。尽管手术、联合化疗及放疗在肺癌的治疗中起到了积极的作用,但因缺乏有效的早期诊断方法,70-80%的患者在确诊时已失去早期根治性切除的时机。手术及放化疗复发率高、易出现耐药,故患者的5年生存率长期停留在20-30%左右。中国传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论。中医药治疗肺癌的有关资料表明:中医药不仅可以延长肺癌患者的生存期,而且能提高他们的生存质量。中药配合放疗、化疗比单纯使用放疗、化疗的疗效更好。中药既可增加化疗药及放射线的敏感性、又有放射防护作用,可减轻化疗放疗的副作用,起到抑瘤增效作用或放射增敏作用。天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低,受到国内外广泛的关注。本课题我们取多种中药提取物或单体,通过体外实验,筛选出能够以较低浓度（微克/毫升水平）抑制肺癌生长或增殖的药物。根据上述实验结果,选择作用效果最明显的中药提取物或单体,研究其抑制肺癌细胞生长或增殖与相关信号转导通路的关系,以及对肺癌细胞化疗敏感性的影响。这些研究将为治疗肺癌新型药物的研制开发提供新思路,为我国传统中医药进一步用于肿瘤的治疗提供实验依据。基于此,本课题从以下四个方面进行了研究。1、抗肺癌中药单体的筛选:我们通过光学显微镜初步筛选了25种中药单体或粗提产物中能有效抑制肺癌细胞增殖的药物,发现可能有抑制肿瘤作用的（镜下观察有明显细胞形态改变的,如细胞皱缩,破碎,漂浮等）有12种,姜黄素、水飞蓟素、大黄素、茶多酚、松多酚、大豆异黄酮、葛根异黄酮、染料木素、生姜提取物、鬼臼素、贯叶连翘提取物、桫椤子提取物等。在此基础上,针对其中4种纯度较高（>80%）且抑制肿瘤细胞增殖明显的药物,姜黄素、大黄素、水飞蓟素、大豆异黄酮,进一步采用MTT试验验证其对肺癌细胞系的抑制效果,结果显示:SM对几种细胞均有较强的抑制作用;大黄素对Anip973和A549细胞有作用,但对NCI-H292和PLA-801细胞作用较弱;姜黄素对A549和NCI-H292细胞有作用,但对Anip973和PLA-801细胞作用较弱;大豆异黄酮对Anip973和PLA-801细胞有作用,但对A549和NCI-H292细胞作用较弱。这些结果表明药物对于不同的细胞作用并不完全一样,造成这一现象的机理有待于更深入的研究。2、水飞蓟素诱导高转移表型肺癌细胞系（Anip973）细胞凋亡的分子机制研究:本实验以肺癌细胞系Anip973细胞为研究对象,探讨分别给予不同剂量和不同时间点的水飞蓟素处理后的肺癌细胞的凋亡情况,通过形态学及流式细胞仪我们观察到水飞蓟素可诱导肺癌细胞系Anip973细胞产生凋亡,且具有时间和浓度依赖性。在凋亡发生过程中,半胱天冬酶（ caspase）家族和Bcl-2家族发挥重要作用。进而通过免疫印记法检测发现SM作用于人高转移肺癌细胞系Anip973细胞后,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低,而凋亡蛋白Bax的表达明显增加,说明水飞蓟素的促凋亡机制与降低Bcl-2/Bax的比例有关。3、水飞蓟素通过MAPK信号转导通路逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性:我们通过MTT法检测到水飞蓟素可以逆转肺癌A549/DDP细胞的耐药性,并呈时间依赖性;流式细胞仪分析结果提示水飞蓟素和顺铂联用可以引起A549/DDP细胞凋亡或死亡,并呈时间依赖性。为了进一步探讨水飞蓟素诱导A549/DDP细胞凋亡的机制,我们采用Western blot方法,应用针对MAPK家族成员JNK、ERK、p38磷酸化形式及非磷酸化形式的特异性抗体,检测了SM作用后以上激酶的表达水平及活化程度的改变。在不同浓度药物作用24hr后,这几种激酶的表达水平都没有明显的改变,而它们磷酸化的程度与加入DMSO的阴性对照组相比则有显着的改变。其中ERK的磷酸化受到明显的抑制,而JNK、p38MAPK的磷酸化水平有一定的增加。4、水飞蓟素对肺癌细胞Anip973裸鼠体内成瘤、增殖、凋亡以及血管形成的影响:本研究将Anip973细胞接种于裸鼠背部皮下,建立人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。建立模型后,给其腹腔注射SM结果显示,与未处理组的裸鼠相比,注射水飞蓟素的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小。各组肿瘤标本HE染色结果显示,肿瘤细胞异形性明显,细胞大小不一,形状各异,瘤细胞生长致密。未处理组肿瘤标本凋亡细胞少见,而水飞蓟素组肿瘤标本提示凋亡细胞增多,凋亡细胞表现为细胞变圆、固缩、胞膜出泡、染色质浓集、核深染。综上所述,我们认为水飞蓟素具有通过调节半胱天冬酶（ Caspase）家族和Bcl-2家族发挥其抑制肺癌细胞增殖及促凋亡的作用;另外水飞蓟素可以通过调节MAPK信号转导通路逆转肺癌A549/DDP细胞的耐药性,并能增加顺铂化疗的敏感性。以上研究将为治疗肺癌新型药物的研制开发提供新思路,为我国传统中医药进一步用于肿瘤的治疗提供实验依据。
邓柏林[9]（2007）在《旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究》文中进行了进一步梳理为探索旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化,本研究首先以2×106个/小鼠皮下接种SP2/0细胞,再以450条/小鼠口腔感染旋毛虫的Balb/c实验鼠,检测了小鼠的抑瘤指标,建立了适用于旋毛虫感染诱导抗SP2/0骨髓瘤细胞实体瘤动物模型,然后以该模型实验组和对照组瘤体为研究对象,分别提取瘤组织mRNA,采用SSH技术构建旋毛虫感染诱导的差异基因文库。反向Northern Blot技术进行筛选鉴定。阳性差异表达基因测序,结果提交GeneBank同源性对比分析。最后对所获得的部分已知功能基因和未知功能基因进行实时荧光定量RT-PCR和RT-PCR验证。结果该模型旋毛虫感染组能够显着提高机体对肿瘤的免疫力,肿瘤组间大小差异极显着（P<0.01）,完全符合SSH技术对实验材料的要求。成功构建了旋毛虫感染后诱导SP2/0骨髓瘤细胞上调基因表达消减文库,克隆的目的基因片段大小分布在180-850bp之间,Differential Screening确认的20个阳性差异基因经测序BLAST比对,获得差异表达的已知功能基因15个和未知功能基因12个。其中以MRPL41、NKTR、RbAp48、QRS、ANXA2等基因为可能与骨髓瘤细胞的生长抑制有密切得关系。荧光定量RCR验证结果表明MRPL41基因mRNA表达水平在旋毛虫感染组上调,提示在旋毛虫感染诱导的MRPL41基因表达发生变化与肿瘤的抑制作用相关。RT-PCR所验证的未知功能基因的表达趋势与差减文库表达谱趋势一致。本研究为深入探讨旋毛虫感染诱导SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化与旋毛虫抗肿瘤机理的研究奠定了基础。
陈伟业[10]（2007）在《重组牛、猪和鸡β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究》文中指出Ⅰ型干扰素对人类和动物病毒感染的免疫防治、肿瘤疾病治疗等相关基础研究具重要意义，并有着广阔的应用前景。基因工程重组干扰素技术具有巨大的优越性，但目前广泛采用的人类和动物Ⅰ型干扰素重组表达生产系统不仅纯化、复性工艺复杂，而且其表达产物在结构、生物学活性与真正天然干扰素相比存在明显差距。同时，现有Ⅰ型干扰素的生物学活性鉴定与定量分析方法也存在费时、繁琐、不够精确、特异性差等一系列缺陷，亟待改进创新。针对目前畜禽Ⅰ型干扰素基础研究和生产应用中存在的问题，本研究建立了便捷、敏感、准确、特异的干扰素生物学活性定量分析方法，并构建了一系列基因工程哺乳动物细胞系，实现了具有天然活性的牛、猪和鸡β干扰素在CHO细胞中的高效、稳定表达，并对它们的生物学活性进行了研究，为畜、禽Ⅰ型干扰素的基础研究和生产应用奠定了基础。试验Ⅰ基于重组VSV*GFP病毒的干扰素抗病毒活性定量分析方法的建立使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水疱性口炎病毒（VSV*GFP）于MDBK细胞上进行干扰素抗病毒活性滴定（AVA）。此方法在96孔细胞培养板上进行操作，通过GFP检测定量半数病毒复制抑制来替代通过细胞染色定量半数CPE抑制。检测GFP时，直接加50μL裂解液至VSV*GFP感染的MDBK细胞上清（100μL）裂解细胞释放GFP，同时病毒被灭活，然后使用仪器检测GFP的相对荧光值（RFU）来定量GFP蛋白的相对含量。这与细胞染色方法定量半数CPE相比，步骤得到极大简化。酚红对GFP的检测有影响，于无酚红培养液中的检测结果更敏感、更准确，但GFP无论在含酚红还是无酚红培养液中，其浓度和检测的RFU值都呈良好的线性相关。使用干扰素标准品，病毒复制时间对最终抗病毒活性计算值几乎没有影响。此方法具有良好的重复性（使用标准品，批次内和批次间检测的变异系数分别为12.1％和13.8％），且检测结果和基于细胞染色方法的检测结果基本吻合。此外，细胞形成汇合单层有利于提高最终GFP表达量，从而提高检测的敏感性和准确性；GFP于湿盒中4℃保存可稳定保存至少1周而不影响检测结果。试验Ⅱ基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测鸡Ⅰ型干扰素生物学活性的研究克隆了鸡Mx启动子（Mxp），并在其下游连接萤光素酶（luciferase，luc）报告基因，构建成鸡Ⅰ型干扰素活性检测质粒pMxp-luc。以pMxp-luc瞬时转染DF-1鸡胚成纤维细胞系，24小时后用鸡IFN-α／β处理细胞，结果萤光素酶基因在Mx启动子作用下获得转录表达；萤光素酶的表达量与干扰素的抗病毒活性有着良好的线性相关性，并在干扰素处理细胞6个小时后就可以检测；对鸡IFN-α和IFN-β检测的敏感性是分别约为抗病毒活性定量检测方法的10和100倍，检测的线性范围约为0.3～30AU·mL-1。该检测系统与传统抗病毒定量检测方法相比，具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等显着优势，在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究中及产业化过程中具有重要应用价值。试验Ⅲ基于指示细胞系定量检测猪、牛Ⅰ型扰素生物学活性构建了能够对Ⅰ型干扰素效应产生萤光素酶报告基因特异应答的工程细胞系MDBK-Mxp-luc。MDBK-Mxp-luc对不同来源（转染、CHO和杆状病毒）的牛、猪IFN-α／β检测范围约为0.5-100AU·mL-1；重复性良好，批次内、批次间的变异系数分别不大于5.6％和9.2％；方便快捷，IFN处理后5-6h萤光素酶表达水平最高，12h降到1／5（这与已报道的人、鼠和鱼Mx启动子检测相应Ⅰ型IFN的都不相同），整个检测过程可在14h内完成；安全，整个过程没有涉及活病毒；检测简单准确，可适用于高通量检测。MDBK-Mxp-luc细胞系还可以作为研究病毒感染与牛Ⅰ型IFN系统相互作用的分子机制的有力工具。试验Ⅳ重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究构建的重组杆状病毒，感染sf9细胞后，分别采用免疫荧光和免疫印迹证实了重组BoIFN-β在细胞内和培养上清中获得正确表达，培养上清中的含量可达106.0AU·mL-1。同时重组BoIFN-β还可以激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达，证实其具有天然Ⅰ型干扰素的生物学活性。试验Ⅴ重组牛β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究把牛β干扰素（BoIFN-β）的ORF基因亚克隆至真核稳定表达载体pCI-neo（BoIFN-β在高效启动子CMV控制下表达），并稳定转染至CHO-K1细胞，筛选出可稳定表达重组BoIFN-β的CHO细胞克隆（CHO-BoIFN-β），可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。在25cm2的细胞瓶（5mL培养液）中，重组BoIFN-β的累积表达水平达到8.4×105 AU·mL-1，每天的表达量可达5.0×105 AU·mL-1或0.5 AU／个细胞。表达的重组BoIFN-β可以诱导MDBK细胞表达牛Mx蛋白，并且能够激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达，证实其具有天然牛Ⅰ型干扰素的生物学活性。试验Ⅵ重组猪β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究把猪β干扰素（PoIFN-β）的ORF基因亚克隆至真核稳定表达载体pCI-neo（PoIFN-β在高效启动子CMV控制下表达），并稳定转染至CHO-K1细胞，筛选出可稳定表达重组PoIFN-β的CHO细胞克隆（CHO-PoIFN-β），可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。在25cm2的细胞瓶（5mL培养液）中，重组POIFN-β的累积表达水平达到7.7×105 AU·mL-1，每天的表达量可达4.6×105 AU·mL-1或0.46 AU／个细胞。表达的重组PoIFN-β可以诱导PK15细胞表达猪Mx蛋白，并且能够激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达，证实其具有天然猪Ⅰ型干扰素的生物学活性。此外，其可以完全保护PK15细胞抵抗1000 TCID50的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和伪狂犬病毒（PRV）的感染，显示了良好的临床应用前景。试验Ⅶ重组鸡β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究把鸡β干扰素（ChIFN-β）的ORF基因亚克隆至真核稳定表达载体pCI-neo（ChIFN-β在高效启动子CMV控制下表达），并稳定转染至CHO-K1细胞，筛选出可稳定表达重组ChIFN-β的CHO细胞克隆（CHO-ChIFN-β），可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。在25cm2的细胞瓶（5mL培养液）中，重组ChIFN-β的累积表达水平达到6.9×104 AU·mL-1，每天的表达量可达4.3×104 AU·mL-1或0.043AU／个细胞。表达的重组ChIFN-β可以诱导原代鸡胚成纤维细胞（CEFs）表达鸡Mx蛋白，并且能够激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达。此外，其还可以完全保护CEFs细胞抵抗1000 TCID50的禽流感病毒（H5N1亚型强毒株）的感染。本研究构建了能够对Ⅰ型干扰素效应产生萤荧光素报告基因特异应答反应的MDBK工程细胞系，并建立了快捷、敏感、准确、特异的Ⅰ型干扰素生物学活性新型定量检测系统。此外，本研究建立的基于CHO工程细胞的Ⅰ型干扰素生产系统具有一系列突出优点。首先，CHO很久以前即被批准用于人类和动物临床应用疫苗及细胞生物制品的制备，其安全性已经得到充分证明。其次，作为哺乳动物细胞表达系统，其产物IFN-β为最接近天然干扰素；同杆状病毒感染昆虫细胞系统表达水平相似，但完全避免了后者糖基化修饰等翻译后加工方式的差异，这对其体内生物学活性及与结构稳定性的保持、降低抗原反应性具有关键意义，并且生产、纯化工艺大大简化，简单处理甚至不经处理即可用于动物临床；同病毒刺激组织原代淋巴细胞生产系统相比，干扰素的表达水平大幅度提高，在产物纯度、生物安全性及经济成本方面更是后者无法比拟的。本研究结果为深入系统开展病原-宿主之间感染与抗感染天然免疫机制研究及Ⅰ型干扰素的生产应用研究提供了良好的技术平台和研究基础。
二、Failure to disengage PI-3K pathway signaling confers Anti-IgM resistance to growth arrest and apoptosis in the CH12 B-cell lymphoma（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Failure to disengage PI-3K pathway signaling confers Anti-IgM resistance to growth arrest and apoptosis in the CH12 B-cell lymphoma（论文提纲范文）
（1）B细胞受体复合物的表达纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源及意义 |
| 1.1.1 课题来源 |
| 1.1.2 课题意义 |
| 1.2 B细胞与体液免疫 |
| 1.3 BCR复合物简介 |
| 1.3.1 BCR复合物的表达部位及类型 |
| 1.3.2 BCR复合物的基本结构与功能 |
| 1.3.3 BCR复合物的信号通路 |
| 1.3.4 与BCR复合物相关的疾病研究 |
| 1.4 去垢剂对于膜蛋白纯化的影响 |
| 1.5 本课题的主要研究内容 |
| 1.6 本课题技术路线 |
| 第2章 实验器材及方法 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 分子克隆相关菌株与试剂 |
| 2.1.2 细胞培养及蛋白表达相关试剂 |
| 2.1.3 蛋白纯化相关试剂 |
| 2.1.4 实验中涉及的仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 表达载体构建 |
| 2.2.2 转染质粒的获取 |
| 2.2.3 细胞培养与转染 |
| 2.2.4 小量蛋白纯化实验 |
| 2.2.5 蛋白纯化 |
| 第3章 获得表达载体及初步纯化实验 |
| 3.1 表达载体的设计及合成 |
| 3.2 λIgM型 BCR复合物的初步纯化实验 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 纯化方法的优化 |
| 4.1 去垢剂筛选 |
| 4.1.1 去垢剂的初步筛选 |
| 4.1.2 去垢剂的深入筛选 |
| 4.2 表达载体的改造 |
| 4.2.1 CD79复合物更换载体 |
| 4.2.2 更换标签位置 |
| 4.3 载体改造后的表达纯化 |
| 4.4 κIgD型 BCR复合物的表达纯化 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）EGFRvⅢ靶向单克隆抗体CH12致食蟹猴特异性血小板减少的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 EGFRvⅢ及EGFRvⅢ靶向单克隆抗体CH12 |
| 1.1.2 单克隆抗体药物临床前安全性评价的难点与挑战 |
| 1.1.3 血小板减少症 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 第2章 CH12致食蟹猴特异性血小板减少症的发现 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 缓冲液 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要使用仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 食蟹猴单次静脉输注CH12毒性试验 |
| 2.2.2 食蟹猴重复静脉输注CH12毒性试验 |
| 2.2.3 SD大鼠单次静脉输注CH12毒性试验 |
| 2.2.4 SD大鼠重复静脉输注CH12毒性试验 |
| 2.2.5 临床观察及给药部位刺激性 |
| 2.2.6 安全药理 |
| 2.2.7 临床病理 |
| 2.2.8 毒代动力学检测 |
| 2.2.9 抗药抗体检测 |
| 2.2.10 病理 |
| 2.2.11 骨髓涂片 |
| 2.2.12 组织交叉反应 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 食蟹猴静脉单次输注CH12导致急性血小板减少症 |
| 2.3.2 食蟹猴静脉重复输注CH12导致血小板减少症 |
| 2.3.3 CH12单次及重复静脉给予大鼠后无不良反应 |
| 2.3.4 CH12诱发的食蟹猴血小板减少症为脱靶毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 CH12致食蟹猴特异性血小板减少症的毒性分子机制 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 缓冲液 |
| 3.1.4 抗体 |
| 3.1.5 使用仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 制备富血小板血浆及洗涤血小板 |
| 3.2.2 体外检测CH12与血小板的结合 |
| 3.2.3 体外检测血小板活化 |
| 3.2.4 体外考察CH12与血小板的结合部位 |
| 3.2.5 食蟹猴第二次单次静脉输注CH12毒性试验 |
| 3.2.6 食蟹猴给予CH12后检测血小板结合及活化 |
| 3.2.7 免疫组化实验 |
| 3.2.8 基于TMT标签的蛋白质组学 |
| 3.2.9 阻断血小板膜受体 |
| 3.2.10 构建αⅡbβ3的3D分子模型 |
| 3.2.11 多重序列对比 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CH12能够与食蟹猴血小板结合并导致其活化 |
| 3.3.2 CH12不与人血小板结合也不能使其活化 |
| 3.3.3 CH12与食蟹猴血小板的结合依赖于其F(αb')_2结构 |
| 3.3.4 体内验证CH12与血小板的相互作用 |
| 3.3.5 CH12诱导的食蟹猴血小板减少与年龄相关 |
| 3.3.6 CH12通过整合素αⅡbβ3与食蟹猴血小板结合 |
| 3.3.7 食蟹猴与人及大鼠的αⅡbβ3存在种属差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 图表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）苯并芘暴露诱导海水青鳉免疫应答的信号通路及其免疫调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 海水青鳉作为模式生物的研究进展 |
| 1.2 苯并[a]芘概述 |
| 1.3 活性氧与氧化应激 |
| 1.3.1 活性氧概述 |
| 1.3.2 ROS参与的信号转导与致病机制 |
| 1.3.3 氧化还原应激 |
| 1.3.4 污染物暴露与氧化应激 |
| 1.3.5 线粒体与ROS |
| 1.3.6 ROS的检测方法 |
| 1.4 NF-κB通路概述 |
| 1.4.1 Canonical NF-κB通路 |
| 1.4.2 Non-canonical NF-κB通路 |
| 1.4.3 两条NF-κB通路间的cross-talk |
| 1.4.4 氧化应激对NF-κB通路的调控 |
| 1.5 污染物与污染物及病原体间的交互作用 |
| 1.6 本研究的技术路线、目的和意义 |
| 1.6.1 研究的目的和意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 海水青鳉转录组文库构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 q-PCR方法的建立 |
| 2.2.2 BaP暴露对雌性海水青鳉相关基因表达的影响 |
| 2.2.3 BaP暴露对雄性海水青鳉相关基因表达的影响 |
| 2.2.4 LPS注射处理对海水青鳉相关基因表达的影响 |
| 2.2.5 PDTC注射处理对海水青鳉相关基因表达的影响 |
| 2.2.6 海水青鳉转录组文库的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 转录组学分析LPS刺激与BaP暴露对海水青鳉hepcidin表达及免疫调控差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 LPS或BaP暴露下转录组数据产出情况 |
| 3.2.2 三组处理组共同差异基因分析 |
| 3.2.3 LPS刺激与BaP暴露对海水青鳉免疫调控的异同 |
| 3.2.4 LPS对canonical NF-κB通路的作用 |
| 3.2.5 hepcidin其它调控通路的变化 |
| 3.2.6 LPS刺激与BaP暴露下免疫基因定量分析检测 |
| 3.2.7 LPS与BaP的交互作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 LPS与BaP对海水青鳉免疫通路调控 |
| 3.3.2 转录组学分析BaP与LPS对hepcidin的调控差异 |
| 3.3.3 LPS与BaP对海水青鳉其它免疫基因的调控 |
| 第4章 BaP与LPS联合暴露对海水青鳉的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RNA-seq文库构建 |
| 4.2.2 LPS与BaP的交互作用在全基因水平上的分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 BaP暴露产生低浓度ROS抑制NF-κB通路 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 BaP处理3d后对海水青鳉氧化还原相关基因表达的影响 |
| 5.2.2 DIT-29细胞转染条件确立 |
| 5.2.3 H_2O_2和BaP处理对DIT-29细胞中NF-κB通路的影响 |
| 5.2.4 BaP对NF-κB通路的作用能够被ROS抑制剂所抑制 |
| 5.2.5 H_2O_2和BaP处理下DIT-29细胞ROS变化 |
| 5.2.6 持续、生理学浓度H_2O_2处理下DIT-29细胞中ROS及NF-κB通路变化 |
| 5.2.7 H_2O_2、H_2O_2ss和BaP处理下DIT-29细胞中NF-κB通路蛋白水平变化 |
| 5.2.8 EMSA检测H_2O_2、H_2O_2ss和BaP处理下NF-κB与启动子位点结合 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 canonical NF-κB通路抑制对海水青鳉的影响 |
| 6.1 材料方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Canonical NF-κB通路抑制剂抑制了哺乳动物细胞中NF-κB通路但激活了DIT-29细胞中该通路 |
| 6.2.2 RelA和NIK过表达均能够激活DIT-29细胞中的NF-κB通路 |
| 6.2.3 Canonical NF-κB通路抑制剂处理对non-caonical NF-κB通路蛋白的影响 |
| 6.2.4 NF-κB通路抑制对海水青鳉的影响 |
| 6.2.5 Canonical NF-κB通路抑制下海水青鳉免疫相关基因表达随时间变化 |
| 6.2.6 Canonical NF-κB通路抑制对海水青鳉抵抗病原菌侵染能力的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 附录 |
| S1 H_2O_2瞬时检测体系及持续表达体系的构建 |
| S2 本研究中使用到的引物序列 |
| S3 BaP与LPS共处理12h或2d后差异基因富集分析 |
| S4 海水青鳉NIK与RelA序列 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 在学期间参加的科研项目及成果 |
| 致谢 |
（4）胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 胶质瘤患者人类巨细胞病毒感染、表达 |
| 第一章 胶质瘤血液人类巨细胞病毒抗原血症及IGG、IGM抗体表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 胶质瘤组织及外周血中HCMVDNA水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 胶质瘤组织中HCMV病毒蛋白PP65、IE1-72的表达水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 脂质体介导HCMV-IE1转染胶质瘤U251细胞株增殖、侵袭、凋亡的实验研究 |
| 第一章 稳定表达HCMV-IE1胶质瘤U251细胞株的构建及鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 表达HCMV-IE1的神经胶质瘤U251细胞株的增殖、侵袭和凋亡水平的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）Rictor/mTORC2通路在卵子发生与早发性卵巢功能不全中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 4-VCD破坏早期卵泡的发育,并且抑制卵泡RICTOR/MTORC2信号通路的活性 |
| 3.2 卵母细胞中RICTOR基因的缺失模拟了VCD对卵母细胞中RICTOR/MTORC2通路的作用效果 |
| 3.3 卵巢中RICTOR缺失引起细胞凋亡和卵泡丢失 |
| 3.4 卵母细胞内RICTOR敲除导致小鼠的生育能力下降 |
| 3.5 特异性卵母细胞RICTOR敲除小鼠的激素分泌异常 |
| 3.6 来自于母本的RICTOR基因对胚胎发育来说是非必需的 |
| 4 讨论 |
| 4.1. MTORC1和MTORC2信号通路的不同功能与调节机制 |
| 4.2. MTORC1和MTORC2信号通路在卵子发生中的作用 |
| 4.3. 卵母细胞RICTOR敲除可部分模拟去氧乙烯基环己(4-VINYLCYCLOHEXENE DIEPOXIDE,4-VCD)对卵巢的化学毒性作用 |
| 4.4. RICTOR通过MTORC2/AKT/FOXO3A/促凋亡蛋白信号轴,调控卵泡凋亡和闭锁 |
| 4.5. RICTOR敲除导致小鼠生育力、内分泌改变 |
| 4.6. 来自母本的RICTOR基因对胚胎发育不一定必需 |
| 4.7. 卵母细胞特异性敲RRICTOR小鼠模型的成功构建,是研究POI的理想模型 |
| 5 结论 |
| 6 不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）鸡β2-微球蛋白在马立克氏病毒感染与致肿瘤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英对照缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 马立克氏病毒及其肿瘤模型的研究进展 |
| 综述二 β2-微球蛋白作为癌症治疗靶分子的研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 鸡β2-微球蛋白的克隆与原核表达 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 鸡β2-微球蛋白优势多肽序列的选择与单克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 稳定表达鸡β2-微球蛋白293T细胞的筛选与鉴定 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 鸡β2-微球蛋白及其MHC-Ⅰ在马立克氏病毒感染不同细胞中基因表达水平检测 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 抗鸡β2-微球蛋白单克隆抗体可诱导MSB1细胞凋亡 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 鸡胚成纤维细胞过表达鸡β2-微球蛋白对马立克氏病毒感染复制的影响 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
（7）BTG1基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 BTG1 基因真核表达质粒的构建和高表达BTG1 的稳定转染细胞株的建立和鉴定 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 BTG1 对乳腺癌生长增殖和凋亡 的影响及其机制研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 BTG1 对乳腺癌肿瘤浸润转移的 影响及其机制的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 BTG1 对乳腺癌 放射敏感性的影响及其机制的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| BTG1 在乳腺肿瘤组织中的信号通路图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文分类词表 |
| 博士生期间的科研活动 |
| 致谢 |
（8）抗肺癌中药单体的筛选及水飞蓟素抑癌机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、中药成分抗肿瘤作用的研究进展 |
| 二、细胞凋亡与信号转导在肿瘤发生发展中的作用 |
| 三、水飞蓟素抗肿瘤作用的研究进展 |
| 四、MAPK家族成员在肿瘤细胞耐药中的作用 |
| 正文 |
| 第一部分 抗肺癌中药单体的筛选 |
| 1 引文 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 水飞蓟素诱导高转移表型肺癌细胞系（Anip973）细胞凋亡的分子机制研究 |
| 1 引文 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第三部分 水飞蓟素通过MAPK信号转导通路逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第四部分 水飞蓟素对肺癌细胞Anip973 裸鼠体内成瘤、增殖、凋亡以及血管形成的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 寄生虫抗肿瘤研究进展 |
| 1 肿瘤治疗研究现状 |
| 2 寄生虫抗肿瘤效应 |
| 3 旋毛虫抗肿瘤研究 |
| 4 结语 |
| 第二章 抑制消减杂交(SSH)技术在基因克隆方面的研究进展 |
| 1 SSH 的原理和技术路线 |
| 2 SSH 技术的评价 |
| 3 SSH 的应用研究进展 |
| 4 结语 |
| 第三章 抑癌基因的研究进展 |
| 1 抑癌基因的提出和发现 |
| 2 抑癌基因的作用模式 |
| 3 抑癌基因的性质和功能 |
| 4 抑癌基因的研究前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫感染诱导的抗SP2/0 骨髓瘤细胞动物模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 旋毛虫感染诱导的 SP2/0 骨髓瘤细胞消减 cDNA 文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 旋毛虫感染诱导的肿瘤细胞上调表达基因的筛选和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 荧光定量PCR 和RT-PCR 对已知和未知功能基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| CURRICULUM VITAE |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
（10）重组牛、猪和鸡β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 I型干扰素的基础和应用研究进展 |
| 1 干扰素研究历史、分类和功能 |
| 2 I型干扰素的结构和受体 |
| 3 I型干扰素的信号转导路径 |
| 4 病毒诱导I型干扰素的表达 |
| 5 I型干扰素诱导的基因转录和表达 |
| 6 病毒逃避I型干扰素系统的机制 |
| 7 I型干扰素的生物学活性定量分析 |
| 8 I型干扰素药物 |
| 9 畜禽I型干扰素的基础和应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第二章 基于重组VSV*GFP病毒的干扰素抗病毒活性定量分析方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测鸡I型干扰素生物学活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于指示细胞系定量检测猪、牛I型扰素生物学活性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 重组牛β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 重组猪β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 重组鸡β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、Failure to disengage PI-3K pathway signaling confers Anti-IgM resistance to growth arrest and apoptosis in the CH12 B-cell lymphoma（论文参考文献）
- [1]B细胞受体复合物的表达纯化[D]. 周敏佳. 哈尔滨工业大学, 2020
- [2]EGFRvⅢ靶向单克隆抗体CH12致食蟹猴特异性血小板减少的分子机制研究[D]. 张亦婷. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2019(07)
- [3]苯并芘暴露诱导海水青鳉免疫应答的信号通路及其免疫调控机制研究[D]. 崔倩. 厦门大学, 2019(08)
- [4]胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响[D]. 陈同庆. 安徽医科大学, 2018(04)
- [5]Rictor/mTORC2通路在卵子发生与早发性卵巢功能不全中的作用及其机制研究[D]. 汪丽萍. 南方医科大学, 2017(11)
- [6]鸡β2-微球蛋白在马立克氏病毒感染与致肿瘤中的作用研究[D]. 郁川. 扬州大学, 2013(01)
- [7]BTG1基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究[D]. 朱然. 苏州大学, 2011(06)
- [8]抗肺癌中药单体的筛选及水飞蓟素抑癌机制研究[D]. 李文海. 第四军医大学, 2008(02)
- [9]旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究[D]. 邓柏林. 吉林大学, 2007(05)
- [10]重组牛、猪和鸡β干扰素在CHO细胞中的高效稳定表达及其生物学活性研究[D]. 陈伟业. 南京农业大学, 2007(05)