一、细胞因子与病毒性心肌炎研究进展（论文文献综述）
孙琳[1]（2021）在《IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡》文中指出研究背景病毒性心肌炎（Viral Myocarditis,VMC）是由多种病毒感染引起的淋巴细胞性心肌炎,因具体的发病机制尚不十分清楚,故针对该疾病的特异性治疗手段有限。白介素37（Interleukin-37,IL-37）作为一种抗炎和免疫调节剂,在系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosu,SLE）、强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）、类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）等自身免疫性疾病中发挥强大的免疫调节作用。目前有研究证实,IL-37在心血管疾病如动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）、急性冠脉综合征（Acute Coronary Syndrome,ACS）及心力衰竭（Heart Failure,HF）的发生发展中也发挥重要的作用。IL-37可以通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen-actived Protein Kinase,p38 MAPK）通路减轻炎性浸润,调节免疫失衡,抑制细胞凋亡。病毒性心肌炎的发病机制与心肌淋巴细胞浸润和心肌细胞凋亡密切相关。IL-37在病毒性心肌炎中是否可以通过调节p38 MAPK信号通路抑制病毒性心肌炎心肌细胞的凋亡尚未得到论证。研究目的1.柯萨奇 B 组 3 型病毒（Coxsackievirusgroup B type 3,CVB3）提取、扩增、纯化,通过腹腔注射构建VMC小鼠模型,重组IL-37干预VMC小鼠,观察CVB3及IL-37对小鼠心肌组织的病理损伤情况。2.通过对各组小鼠的体重,死亡率,一般生命体征,血清炎性细胞因子表达,心肌组织病理学检测,心脏超声心脏功能检测,凋亡相关蛋白的分子生物学及免疫病理学表达,研究IL-37对急性VMC心肌炎性细胞,心脏功能的调节作用。3.探讨p38 MAPK通路在急性VMC的表达以及IL-37对p38 MAPK通路表达的影响。研究方法1.模型构建及实验分组小鼠40只（品系:BALB/c）,雄性,周龄（4-6周）,随机分4组,每组10只,分别为对照组（正常小鼠,Control）,单纯药物组（正常小鼠+IL-37,Control+IL-37）,实验组（病毒组,Virus）,药物治疗组（病毒+IL-37,Virus+IL-37）。其中①实验组小鼠于第0天腹腔注射CVB3（CVB3原液（108TCID50）:25μl,加入PBS 75μl配成100μl）和200μl生理盐水;②对照组小鼠于第0天腹腔注射100μl磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline,PBS）和200μl生理盐水;③单纯药物组小鼠于第0天腹腔注射100μl PBS和200μl生理盐水,第5、8、11天腹腔注射200μl溶有重组IL-37（2μg）的生理盐水和100μl PBS;④药物治疗组小鼠于第0天腹腔注射CVB3（CVB3原液（108TCID50）:25μ]加入PBS 75μl配成100μl）和200μl生理盐水,于第5、8、11天腹腔注射200μl溶有重组IL-37（2μg）的生理盐水和100μl PBS。构建相应的动物模型,以14天为观察研究终点。2.小鼠一般情况、体重变化,生存曲线观察记录小鼠的活动度、毛发颜色、体重等一般情况的变化及小鼠死亡情况,构建小鼠体重变化曲线及生存曲线。3.心功能检测模型构建14天后,对所有小鼠进行心脏超声,异氟醚吸入麻醉四组小鼠,通过小动物高分辨率超声成像系统（Vevo 2100,Fuji Visual Sonics）测量四组小鼠的心脏血流动力学参数。二维超声在胸骨长轴、短轴切面采集胸骨旁长轴图像（Parasternall Long-axis View,PLAX）图像、胸骨旁短轴图像（Parasternall S hort-axis View,PSAX）、M型超声图像,观察小鼠心肌活动度。12 MHz探头测 IVS-s,IVS-d,LVID-s,LVID-d,LVPW-s,LVPW-d,LVEF,以上数据用于评价小鼠心脏功能,后麻醉处死提取心脏组织。4.心肌病理学检测模型构建14天后,戊巴比妥钠（浓度:2%,用量:70mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠,打开胸腔,留取小鼠心肌组织,拍照留取大体标本图片。心尖取血,多聚甲醛过夜浸泡固定,脱水石蜡包埋,常规制备5μm厚度的石蜡病理切片进行病理学检查。苏木素-伊红染色（Hematoxylin&Eosin,HE）观察各组小鼠心肌炎性细胞浸润,Masson染色观察心肌纤维化,拍照、留存,统计分析。5.ELISAELISA法检测各组小鼠血清TNF-α,IL-1,C-TnI表达;评估各自小鼠炎性细胞因子及心肌坏死标志物的表达。6.蛋白免疫印迹实验（Western Blot）提取小鼠心肌组织总蛋白,Western Blot法测定凋亡相关蛋白、p38 MAPK通路相关蛋白的表达;7.免疫组织化学染色（IHC）石蜡病理切片行IHC法测定特异性淋巴细胞及凋亡相关蛋白表达,正置光学微镜下观察,拍照,留存,统计分析。8.TUNEL石蜡病理切片行TUNEL法测定四组小鼠心肌细胞凋亡水平及凋亡相关蛋白表达,正置光学显微镜下观察观察各组心肌细胞凋亡水平,拍照,留存,统计分析。研究结果1.各组小鼠一般情况及体重变化我们观察到,对照组小鼠饮食良好,好动活泼,毛发浓密,触感柔顺光滑,毛发颜色鲜亮,抓取时挣扎、抵抗感明显,给予刺激,反应明显;与对照组相比,病毒组小鼠病毒性心肌炎的体征明显,包括饮食减少,活动量减少,毛发稀疏,触感粗糙,毛发颜色灰暗,抓取时挣扎、抵抗感不明显,给予外界刺激,反应不明显。而接受重组IL-37干预的小鼠则表现出明显的改善。对照组、单纯药物组小鼠体重一直上升,病毒组和药物治疗组小鼠体重明显下降。第1-4日,与对照组相比,病毒组小鼠的体重表现为明显的下降（p<0.05）,药物治疗组体重也明显减轻（p<0.05）。自第4日开始,与对照组相比,病毒组小鼠的体重下降更为显着（第6日（p<0.01）,第8日（p<0.01）,第10日（p<0.001）,第12日（p<0.001）,第14日（p<0.001））,药物治疗组明显降低了体重减轻的速率（第 6 日（p<0.05）,第 8 日（p<0.05）,第 10 日（p<0.01）,第 12 日（p<0.01）,第14日（p<0.01））。对照组和单纯药物组之间无明显差异。2.生存曲线分析对照组和单纯药物组中没有小鼠死亡,生存率为:100%,病毒组小鼠中生存率为:60%,药物治疗组生存率为:90%。与对照组相比,病毒组生存率明显降低（p=0.0208）,与病毒组相比,药物治疗组生存率也有显着统计学差异（p=0.0238）。3.IL-37减轻了病毒性心肌炎心肌损伤和心脏重塑在第14天进行动物取材,对照组和单纯药物组小鼠心脏红润,无水肿,心脏表面光滑,无坏死组织沉积,可观察到血管在心脏表面清晰走形。与对照组相比,病毒组小鼠心脏大体标本表现为明显的苍白水肿,心肌非常松弛,肉眼可观察到心脏表面有大片的白色坏死组织,心脏表面血管观察不清。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心脏表面略有发白,心脏组织苍白肿胀明显减轻,心脏表面白色坏死组织面积明显减少。HE染色切片中,对照组及单纯药物组心肌组织心肌纤维结构清晰、规整,形态均匀,大小正常,心肌间质中未见异常细胞浸润。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维结构排列紊乱,心肌细胞水肿,形态不均,大小各异,部分心肌细胞溶解坏死,心肌间质中可见大量炎性细胞浸润。药物治疗组小鼠心肌纤维排列紊乱程度明显改善,心肌细胞仍有水肿,形态,大小仍有异常,心肌间质中仍可见炎性细胞浸润,但较病毒组轻。与对照组相比,病毒组心肌炎性平均病理评分增高（p<0.001）,与病毒组相比,药物治疗组心肌炎平均病理评分明显降低（p<0.01）。Masson染色病理切片中,对照组及单纯药物组未见明显胶原纤维沉积,与对照组相比,病毒组小鼠心肌间质可见明显的胶原纤维沉积,纤维化增加（p<0.001）。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心肌组织胶原纤维沉积明显减轻,纤维化面积明显降低（p<0.01）。我们还观察到一个值得探究的现象,单纯药物组小鼠的心脏外膜表现为炎性细胞浸润,心肌纤维坏死。药物治疗组的小鼠也表现出同样的现象。对照组心脏心外膜未见异常。4.IL-37改善了病毒性心肌炎小鼠心脏功能小鼠心脏超声检查中,与对照组相比,病毒组小鼠在胸骨旁短轴视图（PSAX）和胸骨旁长轴视图（PLAX）中观察到随心肌运动的不均一的弥漫的高回声影,同时,与对照组相比,M型超声图像显示病毒组小鼠心室明显扩大,室壁运动能力明显减弱。药物治疗组小鼠在PLAX,PSAX仍有随心肌运动的不均一的高回声影,但面积明显减少,心室仍有扩大,室壁活动仍有减弱,但较病毒组明显减轻。另外,与对照组相比,病毒组左室射血分数（LVEF）（p<0.05）明显下降,IVS-s（p<0.05）、IVS-d（p<0.05）明显变薄,LVID-s（p<0.05）、LVID-d（p<0.05）明显缩小,LVPW-s（p<0.01）,LVPW-d（p<0.01）显着降低。而与病毒组相比,药物治疗组左室射血分数（LVEF）（p<0.05）明显升高,IVS-s（p<0.05）、IVS-d（p<0.05）明显增厚,IVID-s（p<0.05）、LVID-d（p<0.05）明显扩大,LVPW-s（p<0.05）,LVPW-d（p<0.05）显着增高。5.IL-37减少了病毒性心肌炎血清炎性细胞因子及心肌损伤标志物的表达TNF-α,C-TNI,IL-1与病毒性心肌炎的发生发展密切相关,IL-1和TNF-α是重要的促炎细胞因子,C-TNI是心肌坏死的重要指标。与对照组相比,病毒组TNF-α（p<0.01）,C-TnI（p<0.05）,IL-1（p<0.001）的表达水平明显升高。与病毒组相比,药物治疗组降低了 TNF-α（p<0.05）,C-TnI（p<0.05）,IL-1（p<0.05）的产生。6.IL-37减少了病毒性心肌炎淋巴细胞、巨噬细胞的浸润采用IHC法标记CD3+T淋巴细胞,CD4+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞,CD68+巨噬细胞,评估病毒性心肌炎炎性细胞浸润情况。对照组心肌纤维致密,排列均匀,心肌细胞大小,染色正常,心肌间质未见明显淋巴血细胞浸润。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维水肿增粗,大小不均,心肌间质可见大量CD3+T淋巴细胞,CD4+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞,CD68+巨噬细胞浸润,正置光学显微镜下可见阳性染色面积显着增加。药物治疗组也可见以上炎性细胞浸润,但较病毒组减轻。对四组小鼠炎性细胞染色阳性率进行统计学分析,与对照组相比,病毒组小鼠心肌CD3+T淋巴细胞（p<0.001）,CD4+T淋巴细胞（p<0.001）,CD8+T 淋巴细胞（p<0.001）,CD68+巨噬细胞（p<0.001）有明显差异。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心肌CD3+T淋巴细胞（p<0.01）,CD4+T淋巴细胞（p<0.01）,CD8+T淋巴细胞（p<0.05）,CD68+巨噬细胞（p<0.01）有统计学差异。7.IL-37抑制了病毒性心肌炎心肌细胞凋亡采用IHC法标记细胞凋亡相关蛋白,评估病毒性心肌炎心肌凋亡情况。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维变性坏死,大量染色阳性棕褐色异常细胞核。药物治疗组较病毒组心肌坏死程度较轻。统计学分析与对照组相比,凋亡相关蛋白 Cleved-Caspase3（p<0.001）,Caspase3（p<0.01）,Cleved-Caspase8（p<0.01）,Caspase8（p<0.01）,Bax（p<0.001）的蛋白IHC染色阳性率增加。与病毒组相比,药物治疗组 Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.05）,Cleved-Caspase8（p<0.05）,Caspase8（p<0.05）和 Bax（p<0.01）蛋白 IHC 染色阳性率降低。相反,与对照组相比,病毒组中Bcl-2（p<0.01）表达下降,但在药物治疗组中Bcl-2（p<0.05）升高。Western Blot法分析来评估凋亡相关蛋白表达水平。对照组相比,病毒组Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.01）,Cleved-Caspase8（p<0.01）,Caspase8（p<0.01）,Bax（p<0.01）蛋白相对表达水平显着升高,Cleved-Caspase3/Caspase3（p<0.05）,Cleved-caspase8/Caspase8（p<0.01）有明显统计学差异;而同病毒组相比,药物治疗组 Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.05）,Cleved-Caspase8（p<0.05）,Caspase8（p<0.05）,Bax（p<0.05）相对表达量明显减少。此外药物治疗组的 Cleved-Caspase3/Caspase3（p<0.05）,Cleved-caspase8/Caspase8（p<0.05）的比率也低于病毒组。病毒组中Bcl-2（p<0.05）的相对表达和Bcl-2/Bax（p<0.001）比值相较与对照组下降,而药物治疗组中Bcl-2（p<0.05）相对表达量及Bcl-2/Bax（p<0.05）的表达上升。TUNEL法标记心肌凋亡细胞,与对照组相比,病毒组心肌组织中可见大量细胞核核膜破裂、分解、深染、变旧、皱缩。药物治疗组心肌细胞TUNEL染色阳性及细胞核形态变化较病毒组减轻。统计学分析结果为:与对照组相比,病毒组心肌凋亡细胞数量显着增多（p<0.001）,与病毒组相比,药物治疗组心肌凋亡细胞数量降低（p<0.01）。8.IL-37可能通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡Western Blot法检测四组小鼠心肌细胞p38 MAPK及p-p 38MAPK蛋白的相对表达,各组心脏组织中总p38 MAPK蛋白量的表达无显着差异。与对照组相比,病毒组p-p 38MAPK蛋白的表达显着增加（P<0.05）,相反,与病毒组相比,药物治疗组p-p 38MAPK蛋白的表达水平明显降低（P<0.05）。另外与对照组相比,病毒组p-p 38 MAPK/p38MAPK（P<0.01）比例升高,而与病毒组相比,药物治疗组中p-p 38 MAPK/p38 MAPK（P<0.05）比例降低。研究结论1.IL-37可减轻急性VMC小鼠心肌病理损伤;2.IL-37可减轻急性VMC小鼠的死亡率,改善心功能,减轻炎性因子的表达和炎性细胞的浸润,减少凋亡相关蛋白的表达。3.急性VMC心肌p38 MAPK信号通路表达增高,IL-37可抑制p38 MAPK信号通路的表达。
孙琳[2]（2021）在《白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎》文中研究表明背景:病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）是指由于感染各类嗜心肌性病毒所导致的心肌非特异性疾病,VMC是导致青年人发生心力衰竭和心源性猝死的重要原因。临床表现为乏力、胸痛、心力衰竭、恶性心律失常、休克,甚至发生心脏骤停。虽然大多数病毒性心肌炎患者能够自愈或经治疗后好转,但有部分患者进展为扩张型心肌病、心律失常和严重的心力衰竭,极大地影响了患者的生活质量和寿命。现阶段仍然没有特异性的针对病毒性心肌炎的有效治疗方法,目前临床上应用的抗病毒治疗及对症支持治疗,效果并不显着。一直以来,国内外学者长期致力于探究病毒性心肌炎的发病机制,目前广为接受的机制包括病毒对心肌的直接损伤、免疫反应过度激活及各种细胞因子介导的心肌损伤,然而其具体机制仍不完全清楚。焦亡（Pyroptosis）是一种新型的炎症性细胞程序性死亡,由炎症小体介导,并且伴有包括IL-1β和IL-18在内的多种炎性细胞因子释放,与凋亡不同。炎症小体是一种胞内蛋白复合体,由三部分组成:胞浆内模式识别受体、适配蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶原-1（Caspase-1）,炎症小体激活GSDMD,导致细胞膜孔形成,细胞破裂,释放IL-1β和IL-18。炎症小体与许多炎症性疾病有关,如心肌梗死和缺血再灌注损伤。最近的研究表明,在VMC患者和VMC小鼠模型中存在炎性小体。因此,心肌细胞焦亡在VMC发病进程中可能具有重要作用,而阻断这一过程有希望成为治疗VMC的新靶点。白介素-37（IL-37）属于IL-1家族,是一种新型的潜在的炎症抑制因子。在自身免疫性疾病、风湿性疾病、恶性肿瘤等疾病中发挥抗炎作用,而小鼠体内不表达IL-37。我们先前的动物实验研究表明,IL-37能够减轻小鼠病毒性心肌炎的心脏内炎症反应,降低小鼠的死亡率。然而,IL-37对病毒性心肌炎心肌细胞焦亡的作用及其机制尚不清楚。因此,本研究通过建立小鼠病毒性心肌炎模型,应用IL-37对模型小鼠进行干预,研究IL-37对病毒性心肌炎发病过程中的具体作用,并进一步探讨IL-37参与心肌细胞焦亡的影响及其机制,为病毒性心肌炎的治疗提供崭新的治疗靶点。我们的实验主要围绕以下两个部分展开:第一部分:小鼠病毒性心肌炎动物模型的构建研究背景及意义心肌炎是指心肌组织内的非特异性炎性疾病,全球每年约有150万人患心肌炎,可以表现为急性、亚急性或者慢性心肌炎。任何年龄阶段的人群均可能患心肌炎,但以青少年最为多见。病毒是其最常见的病原体,肠道病毒属的柯萨奇病毒最为多见。细菌、真菌、寄生虫、立克次体等也可以引起心肌炎,但临床上相对比较少见。病毒性心肌炎的患者症状表现差异较大,主要取决于心肌的病变所累及的范围,轻症患者可以没有任何自觉症状,部分患者发病前存在7-20天左右的前驱期,表现为发热、乏力,肌肉疼痛等感染症状。随后临床表现为胸痛、心律失常、充血性心力衰竭、心源性休克甚至心脏骤停。一般认为,造成VMC患者心肌损害的原因主要如下:病毒复制的直接损伤;免疫反应被触发后过度激活;炎症反应过程中细胞因子的作用以及各种原因诱导的心肌细胞凋亡。病毒入侵后在心肌内复制,并导致免疫系统激活,其病理生理学进展过程通常有三个阶段:急性阶段、亚急性阶段和慢性阶段。急性阶段是指病毒对心肌的直接毒性作用,亚急性阶段主要表现为T细胞及B细胞的活化及其引发的自身免疫反应,慢性阶段表现为心肌弥漫纤维化与心脏泵功能障碍,如扩张性心肌病。大量病理学证据表明,病毒性心肌炎表现为心肌炎性细胞浸润,主要包括单核细胞,包括淋巴细胞,巨噬细胞,树突状细胞（DC）和自然杀伤（NK）细胞。病毒性心肌炎患者的预后取决于发病原因、临床症状的严重程度和起始治疗是否及时。其预后不良的因素包括射血分数降低和左束支传导阻滞等。轻度心肌炎患者通常预后良好,约有50%的VMC患者可自行缓解。然而,仍有25%的VMC患者可发展为心功能不全,严重者发展为扩张性心肌病。重症心肌炎最常见的死亡原因是心源性休克,其1年内死亡率为20%,5年死亡率为50%。然而现阶段仍无特异性的治疗方法,单纯抗病毒治疗及对症支持治疗,效果并不明显。在本实验的第一部分中,为了模拟病毒性心肌炎的发病进程,我们对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液,观察病毒性心肌炎的病理学特征,探究其病理机制,为VMC的治疗提供新的思路。研究目的1.通过对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液,建立急性病毒性心肌炎模型,观察小鼠心肌损伤的病理学改变。2.通过对小鼠体重、活力、毛发、心脏超声、心肌病理学切片等进行观察与监测,评估使用CVB3 Nancy株构建小鼠病毒性心肌炎模型的效果。研究方法1.建立动物模型将12只雄性6周龄balb/c小鼠饲养于山东省医学科学院SPF类动物房,随机分为对照组和模型组,每组6只。Day 0对对照组小鼠腹腔注射100μl PBS,对模型组小鼠腹腔注射25μl 109TICD50病毒液（加入75μl PBS稀释至100μl）,饲养9天后建立急性心肌炎动物模型。2.超声心动图Day 9用3%异氟醚麻醉小鼠,使用Visual Sonics高分辨率Vevo 2100系统（Visualsonics Inc.,加拿大多伦多）采集胸骨旁长轴图像,记录每组小鼠左心室射血分数（LVEF）,缩短分数（LVFS）,收缩期室间隔厚度（IVSs）,舒张期室间隔厚度（IVSd）,收缩期左室内径（LVIDs）,舒张期左室内径（LVIDd）,收缩期左室后壁厚度（LVPWs）,舒张期左室后壁厚度（LVPWd）。3.心肌组织病理学检测于Day 9心脏超声检查后收集各组小鼠的心脏标本,石蜡包埋切片后进行苏木精和伊红（H&E）染色,Masson染色检测心肌纤维化程度。4.ELISA 检测收集各组小鼠外周血,离心收集上层血清,ELISA检测心肌损伤标志物cTnI与炎症因子IL-1β、IL-18。研究结果1.模型组小鼠一般状态较差对照组小鼠活力良好,毛色鲜亮;与对照组小鼠相比,模型组小鼠活力欠佳,不喜活动,毛发暗淡无光泽,抓取时反应不明显。与对照组相比,VMC模型组小鼠体重自第三天开始明显下降,心脏重量/体重比值升高。2.模型组小鼠左心功能下降与对照组小鼠相比,模型组小鼠心脏超声示IVSs（P<0.01）,IVSd（P<0.05）明显减小,LVEF、LVFS测量值下降,表明对小鼠腹腔注射CVB3后室间隔明显变薄,心肌收缩功能存在受损的可能性。3.模型组小鼠心肌炎症损伤明显对照组小鼠切片HE染色显示心肌细胞规律排列,未见明显炎症浸润,模型组小鼠HE染色可见部分心肌细胞坏死及炎症病灶,间质内炎症细胞浸润明显,病理学评分较对照组升高（P<0.0001）。模型组小鼠比对照组小鼠血清心肌损伤标志物 cTnI（P<0.01）、IL-1β（P<0.05）、IL-18（P<0.05）明显升高。4.模型组小鼠心肌纤维化明显Masson染色可见对照组小鼠心肌间质内无明显胶原纤维分布,模型组小鼠心肌可见灶性坏死伴胶原纤维增生,间质内可见较多胶原纤维分布。研究结论1.对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液能够成功构建小鼠VMC模型。2.病毒性心肌炎小鼠心肌损伤表现为炎性细胞因子表达升高,炎症浸润增加及心肌纤维化加剧。第二部分:IL-37对VMC小鼠心肌细胞焦亡的作用及机制研究研究背景及意义病毒性心肌炎是指机体感染嗜心肌病毒后,心肌组织内出现的非特异性炎症,其临床症状及体征轻重不一。尽管部分患者临床表现轻微,甚至症状表现呈自限性,病毒性心肌炎仍然能够引起一系列严重的并发症。据统计,VMC能够占到年轻人猝死原因的10%左右。VMC的发病机制尚不完全清楚。近期有研究证实,炎症小体的过度激活可能引起心肌炎、动脉粥样硬化及结肠炎等疾病。炎症小体又称焦亡小体,是一种细胞内的蛋白复合体,由胞质内的模式识别受体（PRR）、适配蛋白ASC与半胱氨酸蛋白酶原-1（Caspase1）构成,其中研究最为广泛的模式识别受体是NOD样受体家族的NLRP3。当NLRP3被细胞毒素、ATP或胆固醇等激活后,进一步募集ASC与Caspase1,炎症小体激活后切割IL-1β与IL-18。同时,NLRP3裂解Gasdermin D,释放其N末端结构域,形成细胞膜孔,释放炎性因子,引起一系列免疫反应。因此,抑制炎症小体表达或为病毒性心肌炎的治疗提供新的思路。IL-37是IL-1家族的一种潜在炎症抑制因子,对机体固有免疫和适应性免疫存在一定抑制作用。IL-37在人外周血单核细胞和树突状细胞中低表达,而小鼠体内不表达IL-37。IL-37已被证实能够改善CVB3引起的小鼠病毒性心肌炎,然而其具体机制并不清楚。因此,本部分实验通过应用重组人IL-37对病毒性心肌炎小鼠干预,观察其对心肌炎小鼠炎症浸润及NLRP3炎症小体表达的影响,探讨IL-37对病毒性心肌炎的作用及具体机制。研究目的:1.构建病毒性心肌炎模型,通过IL-37对病毒性心肌炎小鼠进行干预,观察IL-37对病毒性心肌炎小鼠一般状态、心功能和心肌病理学切片的影响。2.通过检测各组小鼠心肌细胞的炎症小体的表达,探讨IL-37减轻小鼠病毒性心肌炎的具体机制。研究方法:1.IL-37干预病毒性心肌炎小鼠将32只雄性6周龄balb/c小鼠饲养在山东省医学科学院SPF级动物房,随机分为4组:对照组（n=6）、IL-37对照组（n=6）、模型组（n=10）、实验组（n=10）。Day 0对对照组、IL-37对照组小鼠各腹腔注射100μtlPBS,同时对模型组、实验组小鼠腹腔注射25μl 109TICD50病毒液（加入75μl PBS稀释至100μl）。Day3、Day7对对照组、模型组小鼠腹腔注射200μl PBS,同时对IL-37对照组、实验组腹腔注射2μg IL-37（加入200μl PBS溶解）,饲养9天后建立急性心肌炎动物模型。2.超声心动图评估小鼠心功能Day 9用异氟醚麻醉小鼠,采集胸骨旁长轴图像,记录每组小鼠左心室射血分数（LVEF）,缩短分数（FS）,收缩期室间隔厚度（IVSs）,舒张期室间隔厚度（IVSd）,收缩期左室内径（LVIDs）,舒张期左室内径（LVIDd）,收缩期左室后壁厚度（LVPWs）,舒张期左室后壁厚度（LVPWd）。3.心肌组织病理学检测收集各组心脏标本,石蜡包埋后用苏木精和伊红（H&E）染色、Masson染色分别检测心肌组织的炎症变化及纤维化程度,免疫荧光检测各组大鼠心肌组织GSDMD蛋白表达情况。4.ELISA 检测收集各组小鼠外周血,离心收集上层血清,ELISA检测心肌损伤标志物cTnI与炎症因子IL-1β、IL-18。5.蛋白印迹实验收集各组小鼠心肌组织,提取心肌组织总蛋白后,Western blot检测NLRP3、ASC dimer、cleavaged caspase 1、NFkB P65 及 phospho-P65 在心肌组织中的表达。6.RT-PCR从液氮中取出各组小鼠心肌组织,液氮研磨组织提取总RNA,PCR检测NFκB P65的mRNA表达水平。研究结果1.IL-37改善病毒性心肌炎小鼠一般状态与模型组小鼠相比,实验组小鼠活力较好,毛色光滑,抓取时反应明显。与模型组相比,实验组小鼠体重同样呈现持续下降趋势,心脏重量/体重比值低于模型组小鼠（P<0.05）。2.IL-37改善病毒性心肌炎小鼠心功能与模型组小鼠相比,实验组小鼠LVEF（P<0.05）、LVFS（P<0.05）、IVSs（P<0.01）和IVSd（P<0.01）均有不同程度的改善,表明实验组小鼠心脏室间隔厚度高于模型组,左室收缩功能较模型组有所改善。3.IL-37降低病毒性心肌炎小鼠心肌炎症损伤小鼠心肌切片HE染色显示,与模型组相比,实验组小鼠心肌炎症病灶浸润较少,心肌细胞坏死减少,间质内炎症细胞分布较少。外周血Elisa检测显示,与模型组小鼠相比,实验组小鼠cTnI（P<0.01）与IL-18（P<0.05）表达明显下降。4.NLRP3炎症小体在模型组小鼠表达升高,在实验组中表达降低Western blot检测显示:模型组小鼠NLRP3（P<0.01）、ASC（P<0.05）与cleaved-caspase 1（P<0.05）蛋白比对照组升高,实验组小鼠NLRP3（P<0.05）、ASC dimer（P<0.001）与cleaved-caspase 1（P<0.05）蛋白比模型组表达降低。GSDMD的免疫荧光染色检测显示:模型组中GSDMD的表达水平高于对照组（P<0.01）;实验组GSDMD的表达水平低于模型组（P<0.01）。5.IL-37可能通过抑制NFκB降低心肌炎小鼠NLRP3炎症小体表达Western blot检测显示:模型组小鼠比对照组NFκB P65（P<0.05）、phospho P65（P<0.01）的表达明显升高;实验组 P65（P<0.01）、phosphoP65（P<0.01）的表达低于模型组,IL-37对照组中P65（P<0.05）、phospho P65（P<0.05）的表达水平明显低于对照组。RT-PCR检测发现模型组P65 mRNA表达高于对照组（P<0.05）,实验组P65 mRNA表达水平明显低于模型组（P<0.05）,IL-37对照组P65 mRNA比对照组表达水平明显下降（P<0.05）。研究结论1.IL-37可以减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌损害,改善小鼠一般状态。2.NLRP3炎症小体参与CVB3诱导的病毒性心肌炎,IL-37抑制NLRP3炎症小体表达。3.IL-37可能通过抑制NFκB通路改善小鼠病毒性心肌炎。
聂抒[3]（2020）在《干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用》文中提出病毒性心肌炎（VMC）是由病毒感染和继发的免疫反应等多种因素共同作用引起的心肌炎性病变,也是引起青少年心源性猝死和心衰最主要的病因之一,目前尚无特异而有效的临床治疗方法。已发现Toll样受体9（TLR9）信号通路在柯萨奇病毒B3（CVB3）感染诱发VMC过程中活化并起加重心脏炎症及损伤作用,而TLR9信号途径中的关键转录因子干扰素调节因子5（IRF5）也与多种心脏炎症的发生发展密切相关。为了探讨TLR9-IRF5信号通路在柯萨奇病毒性心肌炎发生发展中的作用及干预此通路对该疾病的治疗作用,本文选择感染柯萨奇病毒性心肌炎患者为研究对象,检测患者血清中IRF5参与调控的细胞因子和心包积液中TLR9-IRF5信号通路主要因子的表达水平;应用CVB3感染Balb/c小鼠和H9C2细胞建立VMC小鼠和细胞模型,检测TLR9-IRF5信号在柯萨奇病毒性心肌炎病程中是否活化及其致病作用,以及采用免疫抑制性脱氧寡核苷酸AAAG ODN对模型小鼠的TLR9-IRF5信号进行干预。结果发现:TLR9-IRF5信号通路主要因子在柯萨奇病毒性心肌炎患者心包积液及IRF5参与调控的细胞因子在患者血清中的表达水平明显升高;TLR9-IRF5信号途径的活化对心脏炎症及损伤有加重作用;在柯萨奇病毒性心肌炎病程中适时干扰TLR9-IRF5信号,如在CVB3感染小鼠后第4天给予AAAG ODN,可明显减轻小鼠的心肌损伤。综上,TLR9-IRF5信号参与了柯萨奇病毒性心肌炎的致病过程,而在疾病病程中适时干预TLR9-IRF5信号可减轻心肌的炎症反应和损伤。本研究为治疗柯萨奇病毒性心肌炎提供了有价值的实验数据。
吴晓燕[4]（2019）在《加减三仁汤治疗湿热侵心型小儿病毒性心肌损伤临床观察》文中认为目的:探究加减三仁汤治疗湿热侵心型小儿病毒性心肌损伤的临床效果,并观察其对患儿伴随症状、心电图、心肌酶等的影响。方法:选择广州市中医医院儿科门诊和病房2018年11月2019年8月收治的60例湿热侵心型病毒性心肌损伤患儿为本次研究对象,随机分为对照组与试验组各30例。对照组给予西医基础治疗（维生素C、辅酶Q10、肌苷）。试验组在对照组西医治疗基础上加用三仁汤治疗（杏仁6g、蔻仁10 g、薏苡仁15 g、厚朴6 g、陈皮6 g、滑石15 g、枳壳10 g、法半夏10 g、茯苓10 g、瓜萎皮6 g、薤白5 g、莱菔子6g）,两组均治疗1个月。结果:疾病疗效:试验组临床治愈17例,显效7例,有效4例,无效2例,治疗有效率93.33%;对照组临床治愈7例,显效7例,有效8例,无效8例,治疗有效率73.33%。差异有统计学意义（P<0.05）。症候疗效及评分:试验组治愈18例,显效9例,有效3例,无效0例,治疗有效率100.00%;对照组治愈9例,显效7例,有效7例,无效7例,治疗有效率76.67%,差异有统计学意义（P<0.05）。试验组患儿治疗后疲倦乏力、纳呆、心悸、太息、胸闷憋气、气促气短、腹胀症状记分分布明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。两组患儿治疗后中医症状评分比较,差异有统计学意义（P<0.05）。心肌酶谱:治疗后心肌酶谱（LDH、AST、CK、CK-MB、HBDH）数据比较,试验组各指标均明显低于对照组,数据差异有统计学意义（P<0.05）。心电图:试验组心动过速、心动过缓正常例数多于对照组,数据比较差异有统计学意义（P<0.05）;早搏、ST-T改变、传导阻滞两组患儿数据比较,差异无统计学意义（P>0.05）。cTnI、Mb、BNP水平:两组患儿治疗后cTnI、Mb、BNP水平数据比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:加减三仁汤治疗湿热侵心型小儿病毒性心肌损伤与常规西医疗法比较能有效改善患儿心肌损伤症状,特别是疲倦乏力、纳呆、心悸、太息、胸闷憋气、气促气短、腹胀。同时,还能降低心肌酶水平,保护心功能。
杨慧[5]（2019）在《芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用》文中提出目的:探讨新兽药芩芪口服液的急性毒性与长期毒性,评价其安全性。研究芩芪口服液对脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）所致的病毒性心肌炎（viralmyocarditis,VMC）的治疗作用及其分子机制。方法:1、急性毒性试验:采用最大给药量测定芩芪口服液急性毒性,评价其安全性。2、长期毒性试验:将80只SD大鼠随机分为芩芪口服液低、中、高剂量组和空白对照组,每组20只,雌雄各半,连续给药30天。停止给药24 h和15 d后进行剖检、血液生化检查和病理组织切片观察。3、VMC模型的建立:观察小鼠106TCID50EMCV攻毒后3、7、10、14 d不同时间点心肌病理变化及心肌组织病毒载量、IL-1β、IL-6、TNF-α含量变化。4、药效学试验:180只雄性昆明小鼠随机平均分为对照组、模型组,芩芪口服液低、中、高剂量组,利巴韦林阳性对照组。模型组、各治疗组小鼠腹腔注射0.2 mL含有106TCID50EMCV的培养液,对照组注射0.2 mL的培养液。小鼠攻毒24 h后,芩芪口服液低、中、高剂量组小鼠灌胃0.1 mL分别含0.6、1.2、2.4 g·mL-1芩芪口服液6 d;阳性对照组腹腔注射0.1mL利巴韦林6 d;对照组及模型组小鼠灌服蒸馏水6d。于实验第3天每组处死8只小鼠,第7天将各组存活小鼠称重后处死,取心脏固定、冻存。心脏组织进行病理积分,qRT-PCR检测心肌EMCV载量、IL-6、IL-23A、IL-17A、TGF-βmRNA的表达,流式细胞术检测脾脏中Th17细胞与Treg细胞的比率。结果:1、急性毒性试验证明芩芪口服液安全无毒。长期毒性试验中,与空白相比,芩芪口服液各组大鼠的外观体征、行为活动、体增重、血液学和血液生化指标均无显着性差异（P>0.05）;系统剖检与脏器病理组织学检查,均未见与药物毒性相关的组织病理变化,停药后也未见药物延迟性毒性反应。2、EMCV感染小鼠可造成小鼠心肌损伤与炎症,成功建立VMC模型。3、药效学试验:（1）攻毒后第3 d、7 d芩芪口服液各剂量组均可显着降低VMC小鼠心肌病理损伤（P<0.05）;（2）攻毒第3 d,芩芪口服液各处理组IL-6、IL-23A、IL-17A mRNA均低于模型组,中剂量组最佳;第7 d芩芪口服液各组IL-6、IL-23A、IL-17A mRNA均显着低于模型组（P<0.05）。第3 d芩芪口服液高剂量与第7 d芩芪口服液中剂量TGF-βmRNA显着高于模型组（P<0.05）;EMCV感染3 d、7 d芩芪口服液各组病毒载量显着低于与模型组（P<0.05）;（3）第7 d芩芪口服液中、高剂量与模型组相比可显着降低脾淋巴细胞中Th17/Treg细胞比率（P<0.05）。结论:1、芩芪口服液对大小鼠均安全无毒,为靶动物的临床试验提供了依据。2、芩芪口服液可降低病毒及炎症带来的心肌损伤,调节机体Th17/Treg的稳态。
顾丽雯[6]（2019）在《苏州大学附属儿童医院心肌炎临床特征研究》文中认为第一部分:2014-2018年单中心儿童心肌炎临床特征分析目的:回顾性分析住院儿童心肌炎所有临床症状,尤其是首发、早期临床症状,为心肌炎的诊断,尤其是危重病例的识别提供临床经验,从而减少误诊率,降低患儿死亡率。方法:通过对苏州大学附属儿童医院2014年01月至2018年12月共145例心肌炎患儿的临床资料进行回顾性分析,包括一般资料（性别、年龄、起病日期、就诊日期、住院日期）、首发临床表现、辅助检查、治疗、预后等,并将其分为暴发性心肌炎（Fulminant Myocarditis,FM）组与非FM组进行对比统计分析。结果:（1）心肌炎以冬春季节起病多见。本资料共145例心肌炎患儿,男性79例,女性66例。FM组共47例（32.4%）,男19例,女28例;非FM组共98例（67.6%）,男60例,女38例,FM组中女性比例（58.6%）高于非FM组女性比例（38.8%）（P<0.05）。（2）FM组首发临床表现中消化系统症状31例（66.0%）、神经系统症状11例（23.4%）、面苍/急促45例（95.7%）、食纳差36例（76.6%）、精神差31例（66.0%）明显高于非FM组（P<0.01）。（3）病初心肌损伤指标肌钙蛋白I（Cardiac TroponinI,cTnI）、肌酸激酶同工酶质量（MB isoenzyme of Creatine Kinase mass,CK-MB mass）、肌红蛋白（Myoglobin,MYO）、B 型钠尿肽（Brain Natriuretic Peptide,BNP）在 FM组升高程度较非FM组显着（P<0.01）。入院首次心电图（Electrocardiogram,ECG）表现比较:FM组病初室性心动过速发生率（19.1%）、Ⅲ°房室传导阻滞（Atrial Ventricular Block,AVB）发生率（10.6%）高于非FM组（P<0.01）,而心室颤动发生率（4.3%）、心室扑动发生率（4.3%）、高度AVB发生率（4.3%）、T波低平/倒置发生率（34.0%）高于非FM组（P<0.05）,但FM组中病初室性早搏发生率（10.6%）明显低于非FM组（P<0.01）。入院首次超声心动图（Ultrasound Cardiogram,UCG）表现:FM组左室收缩功能下降比例（73.3%）、心脏增大比例（75.6%）、室间隔增厚比例（37.8%）、心包积液比例（22.2%）、室壁运动异常比例（48.9%）明显高于非FM组（P<0.01）。（4）145例患儿中死亡4例（2.8%）（均为FM患儿）,存活141例（97.2%）,治愈 114 例（78.6%）。结论:儿童心肌炎在冬春季节发病率较高,各年龄段均可发病。呼吸道和消化道症状是心肌炎患儿最为常见的首发症状,心脏损伤表现在临床中却相对少见。通常表现为消化道症状、神经系统症状,伴面苍、精神食纳欠佳的患儿,则需警惕FM。患儿心肌损伤标志物、ECG、UCG在病初多有异常,灵敏度高,因此应作为临床一线辅助检查。在临床实践中需注意,ECG表现为Ⅲ°/高度AVB、室性心律失常（如室性心动过速、心室扑动、心室颤动）常提示FM可能,而出现室性早搏则在非FM中多见。心肌炎尤其是FM常病情危重,早期病死率高,故临床疑似或确诊心肌炎者均应收住入院观察治疗。第二部分:单中心十五年儿童暴发性心肌炎临床特征分析目的:探讨儿童FM的流行病学、临床表现及预后特征,为FM的早期识别、诊治提供临床经验。方法:收集我院2004年01月至2018年12月临床诊断为FM的病例资料,回顾性分析其性别、年龄、发病时间、临床症状、辅助检查、治疗手段及预后,并比较存活组与死亡组临床特征、治疗及预后。结果:（1）本资料共70例FM患儿,男性29例（41.4%）,女性41例（58.6%）,其中新生儿2例,婴幼儿33例,发病主要集中在冬春季节,年发病例数由2004到2018年逐年增加。（2）起病前3周内,有70.0%的患者有明确前驱感染史,其中41例（58.6%）为呼吸道感染,消化道感染8例（11.4%）,最为多见。（3）FM首要症状以心外表现为主,呼吸道症状41例（58.6%）、消化道症状37例（52.9%）较为多见;典型心脏症状在年长儿中多见,主要包括胸闷13例（18.6%）、胸痛6例（8.6%）、心悸4例（5.7%）。婴幼儿中表现为精神欠佳28例、拒乳/食纳差27例、面苍/大汗23例。（4）首诊辅助检查中,肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of Creatine Kinase,CK-MB）升高 20/23（86.9%）,CK-MB mass 升高 37/46（80.4%）,cTnI 升高 60/67（89.6%）,MYO 升高 27/60（45.0%）,BNP 升高 30/50（60.0%）。ECG 异常占 98.6%,最常见的是T波改变28例（40.0%）、ST-T段改变25例（35.7%）、窦性心动过速25例（35.7%）,其中Ⅲ°/高度AVB14例（20.0%）,室性心动过速8例（11.4%）。UCG异常者占89.7%,其中左室收缩功能减弱47例（69.1%）、心脏增大45例（66.2%）最为多见,另外室间隔增厚16例（23.5%）,室壁运动异常25例（36.8%）,心包积液15例（22.1%）。（5）70例FM患儿中,死亡患儿11例,59名患儿存活。死亡组中出现呼吸促/费力（72.7%）、呼吸心跳骤停（27.3%）、心室颤动（18.2%）的比例明显高于存活组（P<0.01）。（6）治疗过程中,使用磷酸肌酸组存活率（79.7%）明显高于未使用磷酸肌酸组存活率（20.3%）（P<0.01）,联合使用两种及两种以上营养心肌药物者存活率（78.0%）明显高于未联合使用者存活率（22.0%）（P<0.01）。使用静脉用免疫球蛋白（Intravenous Immune Globulin,IVIG）组存活率（86.4%）高于未使用IVIG组存活率（13.8%）（P<0.05）。（7）70例FM患儿死亡率达15.7%,生存率为84.2%,存活59例中有43例（61.4%）痊愈,有2例安装永久起搏器,2例患儿失访。结论:儿童FM多见于冬春季节,各年龄段可见,其起病迅猛,病程进展极快,疾病早期死亡率高。FM的首发临床症状不典型,多以消化道或呼吸道症状起病,对于确诊FM患儿早期使用大剂量IVIG及心肌营养药物治疗疗效确切,有助于提高存活率。患儿病程中出现呼吸心跳骤停和心室颤动后存活率较低。
颜克鹏[7]（2018）在《固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制》文中进行了进一步梳理目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是多病因引起的血清淀粉酶、脂肪酶显着升高为特征的胰腺炎症损伤疾病。AP由胆石病、高血脂、酗酒、感染、遗传因素等诱导,发病机制和临床治疗策略均不十分清楚。可引起胰腺炎的病毒包括:流行性腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒等。柯萨奇病毒中的B3、B4型均可引起胰腺炎,B3型柯萨奇病毒（Coxsackievirus B Type 3,CVB3）感染诱导的病毒性心肌炎研究较为深入广泛,而CVB3诱导的急性胰腺炎的发病机制缺乏研究。CVB3为小核糖病毒科无衣壳正链RNA病毒。经粪口途径感染心脏、胰腺、脑、肝脏等,导致心肌炎、胰腺炎、病毒性脑炎、肝炎等。CVB3诱导急性病毒性心肌炎的机制主要由急性期（0-3天）病毒大量复制直接损伤心肌和心脏局部浸润免疫细胞炎症效应损伤所介导。病毒感染早期心脏局部,固有免疫激活介导的炎症细胞因子、趋化因子分泌及多种免疫细胞（主要为巨噬细胞和T细胞）的浸润,是急性病毒性心肌炎的主要致病细胞;心肌局部M1型巨噬细胞浸润介导的炎症损伤（TNF-α和IL-1β）和后期心脏局部过度的Th1/Th17免疫炎症损伤（IFN-γ和IL-17A）,是介导病毒性心肌炎的主要免疫效应机制:NK和γδT细胞等也发挥了重要的早期促炎和调控功能。很多研究证实CVB3感染早期心脏局部上调的IL-17A及IL-17-IL-17RA通路应答在心肌炎和心肌纤维化进程中发挥关键致病作用。胰腺是CVB3感染肠道入血后的首要器官,且胰腺CVB3的复制水平高于心脏,提示CVB3感染的致死首先来自于急性胰腺损伤,其次来自于急性心肌炎。然而迄今,CVB3感染诱导的急性胰腺炎的免疫发病机制未见详尽报道。我们的小鼠预试验发现:1)CVB3在胰腺组织的复制最高,心脏、肝脏次之;第3天的胰腺组织大量坏死主要来自于病毒复制;2)相对于病毒性心肌炎显着的免疫炎症浸润,CVB3感染后的胰腺坏死程度高于免疫浸润损伤;3)急性心肌炎和急性胰腺炎的共同特征是发现感染早期IL-17A的显着上调;IL-17A敲除小鼠感染CVB3后病毒性心肌炎显着减轻、小鼠生存率提高,提示IL-17A及其通路也可能在急性胰腺炎发病中发挥关键作用。IL-17A及IL-17A/IL-17RA通路是已知的感染性和自身免疫性组织炎症损伤的关键核心机制。IL-17A通路所介导的中性粒细胞组织浸润、Th17应答极化及其炎症效应,是其介导组织损伤的主要机制。IL-17A的来源主要有固有免疫细胞（ILC3、γδT、中性粒细胞）、T细胞（Th17）和组织细胞等。我们的预实验发现:病毒感染早期（3天）诱导了胰腺内γδT细胞上调浸润;同时该群细胞分泌较高水平的IL-17A。CVB3感染心肌细胞早期,γδT细胞是分泌IL-17A的主要细胞且促进急性心肌炎的发展。提示γδT细胞主导的IL-17A通路在CVB3诱导的胰腺炎中发挥重要作用。基于以上,我们提出了科学假设:CVB3感染胰腺早期的innate IL-17A可能在病毒性胰腺炎发病中发挥重要促炎作用,γδT是CVB3感染早期胰腺IL-17A的重要分泌细胞,并促进Th17分化及炎症损伤效应。本研究在CVB3感染C57BL/6小鼠诱导的急性胰腺炎模型中,明确胰腺早期IL-17A的分泌动力学;流式细胞术明确innate IL-17A的来源细胞及分泌IL-17A的γδT亚群;通过IL-17A-/-小鼠、TCRδ-/-小鼠、中和单抗和转输试验明确γδT17在CVB3病毒性胰腺炎中的作用;并探讨了 IL-23响应的γδT17促进胰腺Th17炎症效应的可能机制。本研究旨在创新性阐明γδT17及其IL-17A通路在CVB3急性胰腺炎发病中的作用和机制。研究方法:1.C57BL/6小鼠急性CVB3胰腺炎模型的建立:以2000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠,7天小鼠死亡率约为30%-60%,体重减轻率为25%,第三天胰腺病毒载量约106 PFU/g。第3～7天可见胰腺腺泡细胞坏死崩解及炎症细胞浸润。2.组织HE染色鉴定心肌炎、胰腺炎病理:胰腺组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制备5μm石蜡切片,H&E染色。3.组织病毒滴度测定:胰腺组织20mg,0.5ml PBS匀浆重悬,离心取上清,按1 0-1—1 0-10梯度稀释待用。Hela细胞按80%密度铺96孔板,胰腺匀浆30μl组织样本稀释液加至细胞表面,8复孔,37℃培养1小时,PBS洗三遍,加2%FBS DMEM培养,连续5天观察细胞病变情况。以细胞皱缩、折光性变差、飘起等大于50%视为病变孔。计算组织病毒TCID50/g,乘0.7换算PFU/g。4.胰腺、脾脏、外周血淋巴细胞分离与流式细胞术鉴定:小鼠胰腺组织以胶原酶IV和DNA酶Ⅰ消化,经75%-40%不连续Percoll密度梯度离心分离单个核免疫细胞:脾脏、外周血细胞经去除红细胞和过滤获得单个核细胞。T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、yδT细胞表型分别为CD45+CD3+、CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD45+CD11b+F4/80+、CD45+CD11b+Ly6C+和CD45+CD3+TCRδ+。5.IL-17A+细胞的胞内染色鉴定:单个核淋巴细胞首先经PMA和离子霉素刺激5小时,而后加入Golgi阻断剂作用1小时,收集洗涤后先经表面标志单抗CD4、CD8、TCRδ+、CD11b、Ly6G染色;经固定和穿膜后,再以荧光标记anti-IL-17A、IFNγ、IL-4染色,流式测定。6.中和单抗清除试验:在病毒感染-1和+3天,分别通过尾静脉注射120μg anti-Vγ4单抗,逐天经外周血检测清除效率。7.体外培养和激活Vγ4细胞:Vy4 mAb抗体包板4℃过夜,取单个脾细胞,以anti-CD28（1μg/ml）,rmIL-2（2ng/ml）培养基重悬,培养48h后,换rmIL-2（2ng/ml）的新鲜培养基培养;培养第3-4天始有活化γδT细胞出现,调整细胞浓度为0.7-1 ×106/ml。每1.5天更换培养基至第6天。Vγ4γδT细胞得率约2×107/脾。8.体外转输Vγ4细胞试验:WT和TCRδ KO小鼠,在CVB3感染-1和+3天分别通过尾静脉注射106新鲜培养Vγ4细胞,检测输注效率。9.外源注射重组IL-23试验:小鼠尾腹腔注射重组rIL-23（4μg）,1天后注射CVB3,观察小鼠发病情况。10.Elisa检测外周血及组织匀浆液细胞因子水平:胰腺组织30mg匀浆,1ml PBS（含有PMSF）重悬,离心取上清。依照eBioscience细胞因子检测试剂盒检测IFNy,IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-17A 等蛋白含量。11.脂肪酶活性测定:外周血血清样本、空白（双蒸水）,标准品分别与试剂混合均匀,37℃孵育100秒,570nm检测吸光度,根据公式计算样本脂肪酶活力。12.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;两组间比较以t-检验;多组间比较以 one-way ANOVA 和 Bonferroni multiple comparison test 分析;生存曲线以Log-rank test 比较;以Graphpad Prism 5统计软件进行分析。结果:1、CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了急性病毒性胰腺炎以2000 TCID50的CVB3经腹腔感染C57BL/6雄性小鼠,感染7天体重下降率20%,死亡率为30～60%。第7天小鼠胰腺石蜡切片H&E染色显示:感染小鼠胰腺呈大量胰腺腺胞细胞坏死和炎性细胞浸润,脂肪酶水平明显升高,提示已成功建立了急性AP小鼠模型。2、CVB3急性胰腺炎小鼠胰腺IL-17A水平在感染早期显着升高且IL-17A显着促进了胰腺炎发病程度以ELISA、WB、IHC、IF法检测小鼠胰腺IL-17A水平,发现:CVB3感染后胰腺IL-17A水平显着增高,且在感染第3天达高峰。为证实IL-17A在急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染IL-17A-/-小鼠,发现:与WT小鼠相比,感染7天IL-17A-/-小鼠体重减轻显着降低,生存率明显提高;病毒滴度无明显变化;胰腺炎性细胞浸润和组织坏死明显改善;胰腺TNF-α等促炎细胞因子水平显着降低;提示IL-17A在急性病毒性胰腺炎发病中发挥关键的促炎作用。3、γδT细胞是CVB3感染早期期胰腺固有IL-17A的主要分泌细胞之一且主要为Vγ4 γδT亚群为明确感染早期胰腺增高的IL-17A的细胞来源,以流式检测CVB3感染小鼠0、3、7天小鼠胰腺浸润免疫细胞。发现:CVB3感染第3天可见胰腺γδT细胞比例显着增高,而CD4+Th细胞比例无明显变化。γδT细胞第3天浸润达高峰（2.2%,104/胰腺）,显着高于未感染组（0.8%,103/胰腺）;而CD4+Th细胞浸润于第7天达高峰（30%,106/胰腺）。胞内染色鉴定感染早期胰腺IL-17A+细胞类型,发现:感染3天,胰腺CD3+T细胞系分泌IL-17A的主要细胞。比较CD3+T中CD4+T、CD8+T、γδT、NKT 细胞发现:感染第 3 天 CD8+T（0.08%）和 NK（0.02%）几乎不分泌IL-17A,而CD4+T（0.24%）和γδT（0.31%）是分泌IL-17A的主要细胞;30%以上的γδT细胞分泌IL-17A,而仅6%的CD4+T分泌IL-17A（p<0.05）,提示CVB3感染胰腺早期增高的IL-17A主要由γδT和CD4+T分泌,γδT分泌效率显着高于CD4+Th17。检测γδT细胞亚群发现:γδT亚群Vγ1和Vγ4浸润比例和绝对数相当;而第3天胰腺分泌IL-17A的γδT主要是Vγ4细胞亚群。4、CVB3感染TCRδ-/-小鼠诱导的急性胰腺炎显着减轻为证实γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染TCRδ-/-小鼠,发现:γδT细胞缺失后,小鼠CVB3胰腺炎发病显着降低,胰腺细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α和IL-6水平均显着降低;病毒载量无变化。提示γδT细胞在胰腺炎发病中发挥致病作用。5、以中和抗体清除Vγ4 γδT细胞显着减轻CVB3急性胰腺炎发病为证实CVB3感染胰腺早期分泌IL-17A的Vγ4 γδT细胞亚群的作用,以Vγ4中和抗体于-1、+3天尾静脉注射小鼠清除体内Vγ4细胞,0天感染CVB3。结果显示:Vγ4中和抗体清除90%以上外周血Vγ4 γδT;清除Vγ4γδT使CVB3感染小鼠诱导的急性胰腺腺泡细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显着降低;提示Vγ4 γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中发挥促炎作用。6、过继转输Vγ4 γδT细胞显着加重CVB3病毒性胰腺炎体外诱导培养正常和IL-17A-/-小鼠来源的Vy4 γδT细胞,以106细胞/只小鼠尾静脉回输TCRδ-/-小鼠,1天后感染CVB3,发现:向发病减轻的TCRδ-/-小鼠回输Vγ4 γδT可显着加重病毒性胰腺炎发病,而回输IL-17A-/-来源Vγ4 γδT,则急性胰腺炎发病显着减轻。提示Vγ4 γδT所分泌的IL-17A确实在CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病中发挥关键促炎作用。7、IL-17A+Vγ4 γ8T细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关IL-17A-IL-17RA通路的效应之一是趋化中性粒细胞的器官浸润。流式检测发现:CVB3感染第3天诱导了胰腺中性粒细胞的大量浸润。而TCRδ-/-、IL-17A-/-小鼠及中和抗体清除了 Vγ4的感染小鼠胰腺中性粒细胞浸润比例和数目显着减少。清除Vγ4 γδT的小鼠外周血中性粒细胞被显着抑制90%,其向胰腺的浸润被显着抑制80%以上。提示胰腺早期浸润的IL-17A+Vγ4γδT细胞,显着促进中性粒细胞胰腺浸润并发挥促损伤功能。其次发现:清除Vγ4γδT小鼠脾脏及外周血的IFNγ+CD4+T（Th1）细胞比例及绝对数明显增加,而IL-17A+CD4+T（Th17）细胞的比例及绝对数明显减少;提示Vγ4 γδT细胞分泌的IL-17A通过抑制Th1应答、促进Th1 7炎症应答加剧病毒性胰腺炎。8、感染早期胰腺上调的IL-23激活浸润IL-23R+Vy4 γδT细胞向γδT17分化从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎为明确感染早期激活胰腺γδT细胞的机制,发现:CVB3感染极早期（day1）胰腺显着上调IL-23表达,而γδT细胞组成型高表达IL-23R,为证实IL-23-IL-23R通路对胰腺早期浸润Vγ4 γδT细胞的激活,对WT、TCRδ-/-小鼠外源腹腔注射IL-23,1天后感染CVB3,发现显着加剧WT小鼠急性胰腺坏死及炎症浸润,而不改变TCRδ-/-小鼠胰腺病理;同时,rIL-23显着增高注射12小时后体内胰腺诱导的IL-17A+γδT（而非Th17）比例。提示CVB3感染早期上调的胰腺局部IL-23,经由IL-23R通路激活Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A,从而促进病毒性胰腺炎病理。结论:1、CVB3感染C57BL/6小鼠第7天诱导了以胰腺腺泡细胞坏死、免疫浸润和血清胰酶增高为特征的急性病毒性胰腺炎。2、CVB3感染诱导小鼠胰腺早期（day1～3）上调表达IL-17A且其显着促进CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病。3、感染早期胰腺分泌IL-17A的主要细胞为Vγ4γδT17和CD4+Th17细胞,但γδT17先于CD4+T浸润胰腺、且其分泌IL-17A的效率显着高于Th17。4、γδT细胞敲除小鼠经CVB3诱发的急性胰腺炎发病显着减轻。中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后感染CVB3诱导的急性胰腺炎发病显着减轻。过继转输IL-17A+Vγ4 γδT显着加重CVB3诱导的急性胰腺炎;而转输IL-17A-/-来源的Vγ4 yδT细胞则使加重的胰腺炎显着减轻,提示Vγ4 γδT来源的固有IL-17A促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。5、IL-17A+Vγ4 γδT细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进γδT17分泌的IL-17A对于嗜中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关。6、感染早期胰腺上调的IL-23经IL-23R通路激活浸润Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。
劳慧敏[8]（2017）在《基于JAK/STAT信号通路探讨养心活血解毒方对病毒性心肌炎心肌损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理目的:评价养心活血解毒方对心肌JAK/STAT信号通路的干预疗效,探讨养心活血解毒方发挥作用的可能存在的机制,找寻治疗病毒性心肌炎的新靶点。方法:健康SPF级BALB/c小鼠常规饲料喂养1周后,腹腔注射柯萨奇B3病毒建立病毒性心肌炎模型。选取造模成功小鼠随机分成模型对照组、利巴韦林组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,另设空白组。空白组和模型对照组给予生理盐水,中药低中高剂量组给予中药养心活血解毒方,利巴韦林组给予利巴韦林颗粒。灌胃14天后观察小鼠一般情况、生存情况、体重变化,HE染色观察心肌病理改变,检测小鼠血清心肌酶谱水平,ELISA法检测小鼠血清IL-6、IL-10含量,免疫组化法观察心肌FAS、FASL在心肌中的表达,Western Blot观察JAK2、STAT3蛋白在心肌中的蛋白含量。结果:1.小鼠一般情况:养心活血解毒方高、中剂量可明显改善小鼠生活质量,各中药组死亡率较低,中药各组小鼠体重减少不明显,优于其他各组（P<0.05）。2.小鼠心肌酶的变化:与模型对照组相比,各治疗组CK-MB均降低（P<0.05）,其中以中药中剂量组CK-MB降低明显（P<0.05）,中药低、高剂量组与利巴韦林组CK-MB水平相当（P>0.05）;与模型对照组相比,各治疗组LDH均降低（P<0.05）,其中中药中、高剂量组降低最为明显（P<0.05）,中药中、高剂量组之间比较无差异。3.心肌组织光镜下观察病理改变:模型对照组心肌受损较重,心肌细胞出现灶性病变,部份心肌纤维断裂溶解,少量炎性细胞浸润,出现片状变性、坏死,炎症细胞灶状分布在坏死心肌的周围。利巴韦林组心肌病变程度较模型组轻,中药中高剂量组心肌病变较轻。4.ELISA检测血清IL-6、IL-10水平:与空白组比较,模型对照组血清IL-6的水平明显升高（P<0.05）,与模型对照组比较,各治疗组均可降低IL-6水平,中药中剂量组降低显着（P<0.05）。与空白组比较,模型对照组血清IL-10的水平明显降低（P<0.05）,与模型对照组比较,中药各组均可升高IL-10水平,中药高、中剂量组升高显着,优于中药低剂量组（P<0.05）。5.免疫组化法检测心肌FAS、FASL阳性表达:与模型对照组相比较,中药中、高剂量组FAS阳性表达降低最为明显（P<0.05）。与模型对照组相比较,中药中、高剂量组FASL阳性表达降低最为明显（P<0.05）,与利巴韦林组表达相当（P>0.05）。6.Western Blot检测心肌JAK2、STAT3蛋白:与空白组相比,模型对照组小鼠JAK2含量显着升高（P<0.05）,与模型对照组比较,各治疗组JAK2蛋白含量显着下降（P<0.05）,中药高、中剂量组、利巴韦林组下降最为显着（P<0.05）;与空白组相比,模型对照组小鼠STAT3蛋白含量显着升高（P<0.05）,与模型组比较,各治疗组STAT3蛋白含量显着下降（P<0.05）,中药高剂量组下降最为显着（P<0.05）。结论:1.养心活血解毒方可以提高病毒性心肌炎小鼠的生存质量,降低死亡率,促进模型小鼠体重的增长,减轻心肌损伤。2.养心活血解毒方可以减轻病毒性心肌炎小鼠心肌病理改变,降低血清心肌酶谱水平,降低病毒性心肌炎小鼠血清中IL-6的水平,升高血清中IL-10的水平,可抑制炎症,对心肌起到保护作用。3.养心活血解毒方可以降低病毒性心肌炎小鼠心肌组织中FAS、FASL的表达,减少心肌细胞的凋亡;降低心肌组织中JAK2、STAT3蛋白的表达,减少心肌细胞的损伤。
韦斌[9]（2017）在《分泌IL-10B细胞在小鼠病毒性心肌炎发病中的作用及其机制》文中进行了进一步梳理病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是由病毒感染所致的一种心肌炎症性疾病。大部分的VMC可以完全康复,但少部分进展为扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）。目前VMC的发病机制尚未完全阐明。研究表明T细胞在VMC的发病环节中扮演重要角色,其中Th1细胞在VMC急性期即出现显着增高并分泌IFN-Y参与心肌炎症反应,Th17细胞通过分泌IL-17加重心肌损伤和促进纤维化。调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一类新发现的具有调节性功能的B细胞。其中最重要的亚型是分泌IL-10B细胞（IL-10-producing B cells）。分泌IL-10B细胞通过IL-10,在细胞水平调节其他细胞,尤其是效应性T细胞。已有的研究表明,调节性B细胞在一些免疫炎症性疾病中具有调节作用。然而,在VMC中,是否存在分泌IL-10B细胞,作用机制如何,目前尚未见报道。为此,本研究用柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3,CVB3）建立小鼠VMC模型,深入探索分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中的作用及其机制,为VMC的治疗寻求新靶点。本研究主要通过以下三部分进行。第一部分分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病过程中的变化目的:探讨分泌IL-10B细胞在VMC发病过程中的动态变化,及其与Th1、Th17细胞和心肌病理等指标的关系。方法:4周龄BALB/c小鼠80只,随机分为VMC组（n=50）和对照组（n=30）,两组BALB/c小鼠均设1、2、4周3个时点亚组。CVB3腹腔注射建立小鼠VMC模型,每个时点亚组小鼠分别为12只、18只、20只。腹腔注射PBS建立对照组,每个时点亚组小鼠均为10只。在相应时间点从两组各取10只小鼠,用流式细胞术检测脾脏分泌IL-10B细胞、CD1dhiCD5+B细胞、Th1细胞及Th17细胞,并且对心肌组织进行HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分。结果:1、VMC组心肌组织HE染色显示,CVB3感染后1周出现心肌细胞局灶坏死和炎症细胞的浸润;第2周亚组心肌细胞坏死病灶增加、炎症细胞浸润明显增多;第4周亚组未见心肌细胞坏死、炎症细胞浸润不明显。对照组各亚组心肌组织病理均正常。2、VMC组心肌病理积分在1、2、4周亚组分别为2.30±0.48、2.90±0.74及1.40±0.52,与对照组各亚组（均为0）相比均显着增高（P均<0.01）,并且VMC组第2周亚组明显高于第1周亚组（P<0.05）及第4周亚组（P<0.01）。3、VMC组各亚组脾脏分泌IL-10B细胞与对照组各亚组比较,1、2、4周亚组比例均明显升高（2.70%±0.69%versus 0.90%±0.36%;3.10%±0.50%versus 1.18%±0.31%;1.37%±0.35%versus 0.97%±0.21%。P 均<0.01）,并且 VMC 组第 1、2 周亚组均明显高于第4周亚组（P均<0.01）。4、VMC组各亚组脾脏Th1细胞与对照组各亚组比较,1、2、4周亚组均显着增高（6.62%±L 00%versus 3.44%±1.34%;8.28%±2.04%versus 3.52%±1.15%;5.61%±1.14%versus 3.97%±1.01%。P均<0.01）,并且VMC组第2周亚组明显高于第1周亚组（P<0.05）及第4周亚组（P<0.01）。5、VMC组各亚组脾脏Th17细胞与对照组各亚组相比,在1、2、4周亚组均显着增高（2.46%±0.50%versus 0.98%±0.40%,P<0.05;5.35%±1.11%versus 1.12%±0.51%,P<0.01;2.49%±0.48%versus 0.98%±0.27%,P<0.01）,并且 VMC 组第 2 周亚组明显高于第1及第4周亚组（P均<0.01）。6、与对照组各亚组比较,VMC组1、2、4周亚组脾脏CD1dhiCD5+B细胞均明显增高（5.32%±1.20%versus 2.10%±0.66%;5.56%±1.03%versus 2.70%±0.63%;4.85%± 1.02%versus 2.85%±0.6%。P均<0.01）,VMC组各亚组间无明显差别（P均>0.05）。结论:CVB3腹腔注射成功建立小鼠VMC模型;VMC小鼠的脾脏分泌IL-10B细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且呈先高后低的变化趋势,而CD1dhiCD5+B细胞在发病过程中持续增多;VMC小鼠Th1细胞和Th17细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且第2周达高峰;伴随VMC模型的心肌炎发生、发展及恢复的病理改变,小鼠的分泌IL-10B细胞、Th1细胞和Th17细胞比例有相应平行动态改变趋势。第二部分 分泌IL-10B细胞对VMC小鼠Th1和Th17细胞的调节作用研究一、目的:探讨过继分泌IL-10B细胞对缺乏T和B细胞小鼠VMC的影响。方法:4周龄雄性BALB/c背景的SCID小鼠40只随机分成干预组（n=20）和对照组（n=20）。CVB3感染SCID小鼠建立VMC模型。干预组CVB3感染SCID小鼠前1天,尾静脉注射来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞。对照组注射生理盐水作为阴性对照。观察两组小鼠的生存情况,并在第14天从每组中随机选取8只小鼠,对心肌组织进行HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分。结果:1、干预组心肌病理积分与对照组比较无明显差别（3.28±0.28 versus 3.47±0.24,P>0.05）。2、两组的中位生存时间无差异（8.70d±0.57d versus 7.93d±0.65d,P>0.05）。结论:过继分泌 IL-10B细胞不能减轻缺T和B细胞的急性VMC小鼠的心肌组织的病理改变,也不能延长VMC小鼠的生存时间,提示分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中通过T细胞而起作用。研究二、目的:探讨过继分泌IL-10B细胞对缺B细胞小鼠VMC的影响。方法:SCID 小鼠 60 只随机分成 3 组:na（?）ve 组（n=20）、sensitized 组（n=20）和contro1组（n=20）。尾静脉注射CD4+T细胞同时腹腔注射CVB3建立一个缺乏B细胞的小鼠VMC模型。在VMC模型建立前1天,分别尾静脉注射来源正常 BALB/c 小鼠（na（?）ve 组）、急性 VMC BALB/c 小鼠（sensitized 组）的分泌IL-10B细胞,contro1组注射生理盐水作为阴性对照。观察3组小鼠14天的生存情况,并在第14天从各组中随机选取10只小鼠,HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分,RT-PCR检测Th1转录因子T-bet和Th17转录因子ROR γ t的mRNA表达量,流式细胞术检测脾脏Th1和Th17细胞的比例。结果:1、与对照组比较,naive组的心肌病理积分无变化（2.12±1.07 versus 2.87±0.85,P>0.05）,而 sensitized 组心肌病理积分显着减低（1.21±0.60 versus 2.87±0.85,P<0.01）。2、与对照组比较,na（?）ve组的中位生存时间无显着差异（12.50d±0.70d versus 11.05d±0.68d,P>0.05）,而sensitized组中位生存时间明显延长（13.4d±0.24d versus 11.05d±0.68d,P<0.05）。3、与对照组比较,na（?）ve组的VMC小鼠中脾脏Th1 和 Th17 细胞的比例无变化（4.10%± 1.74%versus5.83%±2.02%;2.24%±1.34%versus 2.92%± 1.32%。P 均>0.05）,而 sensitized 组 VMC 小鼠脾脏Th1和Th17细胞的比例均显着降低（3.20%±2.31%versus5.83%±2.02%,P<0.01;1.35%±1.24%versus2.92%±1.32%,P<0.05）。4、与对照组比较,naive组心肌T-bet mRNA和ROR γ t的mRNA表达量均无明显变化（3.76±1.49 versus4.62±2.60;155±0.90 versus2.67±1.92.P均>0.05）,而sensitized组心肌T-bet和ROR γ t的mRNA表达量均明显降低（1.31±1.28 versus 4.62±2.60,P<0.01;1.30±0.35 versus 2.67±1.92,P<0.05）。结论:免疫性过继来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞可减轻缺B细胞小鼠的心肌炎病理改变、延长生存时间,其机制主要通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例;过继来源于正常小鼠的分泌IL-10B细胞不能调节缺B细胞VMC小鼠的T-bet和ROR Y t的mRNA转录以及Th1细胞和Th17细胞的比例,因而缺B细胞VMC小鼠的心肌炎病理表现及生存时间也没有受到影响。提示分泌IL-10B细胞通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例,从而抑制VMC小鼠心肌的炎症损伤。第三部分过继分泌IL-10B细胞对小鼠VMC发病过程的影响目的:探讨不同时点过继分泌IL-10B细胞对VMC小鼠心肌损伤及预后的影响。方法:4周龄BALB/c小鼠40只随机分成干预组（n=20）和对照组（n=20）。CVB3感染BALB/c小鼠建立VMC模型。干预组分别于CVB3感染前1天,VMC第3天或第7天尾静脉注射来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞。对照组尾静脉注射生理盐水。观察两组小鼠14天的生存情况并在第14天从每组中随机选取10只小鼠,HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分,流式细胞术检测脾脏Th1和Th17细胞的比例。结果:1、与对照组比较,VMC模型建立前过继分泌IL-10B细胞的干预组VMC小鼠的中位生存时间明显延长（13.80d±0.11d versus 11.80d±0.62d,P<0.05）,心肌病理积分明显低于对照组（2.08±0.54 versus 2.98±0.55,P<0.01）,脾脏Th1和Th17细胞的比例均显着降低（4.57%±2.04%versus8.71%±2.29%;3.58%±0.57%versus5.36%± 1.08%。P 均<0.01）。2、与对照组比较,VMC第3天过继分泌IL-10B细胞的干预组不能延长VMC小鼠中位生存时间（12.95d±0.37dversus 11.75d±0.64d,P>0.05）,但心肌病理积分明显减低（2.08±0.54 versus 2.94±0.30,P<0.01）,脾脏Th1 和 Th17 细胞的比例均显着降低（5.23%±1.94%versus8.17%±2.21%;3.35%±0.62%versus5.14%±1.20%,P 均<0.01）。3、与对照组比较,VMC第7天过继分泌IL-10B细胞的干预组VMC小鼠的中位生存时间无显着差异（12.55d±0.49d versus 12.20d±0.57d,P>0.05）,心肌病理积分无变化（2.47±0.66 versus3.01±0.56,P>0.05）,脾脏 Th1 和 Th17 细胞的比例亦无显着差异（4.60%± 1.97%versus 6.27%± 2.02%;4.03%± 0.60%versus4.87%±1.18%。P 均>0.05）。结论:在CVB3建立小鼠VMC前过继分泌IL-10B细胞可下调Th1和Th17细胞比例,从而减轻心肌炎症损伤、延长VMC小鼠的生存时间;VMC小鼠在发病的第3天过继分泌IL-10B细胞可下调Th1和Th17细胞比例从而减轻心肌炎症损伤,但不能延长生存时间;VMC小鼠在发病第7天过继分泌IL-10B细胞不能下调Th1和Th17细胞比例,也不能改变心肌炎症损伤及VMC小鼠生存时间。本研究结果提示:1、VMC小鼠的分泌IL-10B细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且呈先高后低的变化趋势;伴随VMC模型的心肌炎发生、发展及恢复的病理改变,小鼠的分泌IL-10B细胞、Th1细胞和Th17细胞比例有相应平行动态改变趋势。2、分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中通过T细胞而起作用,并且主要通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例,从而抑制VMC小鼠心肌的炎症损伤。3、在发病前或发病早期过继分泌IL-10B细胞,可下调Th1和Th17细胞比例,从而减轻VMC小鼠的心肌炎症损伤。
张圳[10]（2017）在《miR-19b在病毒性心肌炎中作用机制的研究》文中研究说明背景病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是最为常见的心肌炎类型,主要是由柯萨奇病毒B（Coxsackievirus B,CVB）所引发。相关统计资料表明,造成婴儿猝死的疾病中大约有20%是由病毒性心肌炎或者由其引发的致死性室性心律失常所引起,且持续活动的病毒性心肌炎患者的预后情况通常较不理想,严重威胁儿童生命健康。当机体发生持续性慢性炎症时,往往能够造成心肌细胞生长抑制、肥大、凋亡率增高,此外还会进一步引发心肌纤维化、扩张型心肌病以及心力衰竭等。迄今为止,国内外依然缺乏治疗病毒性心肌炎的有效手段,因此,寻找诊断病毒性心肌炎的分子标志物有助于提前采取有效措施减缓或抑制该病的进展,同时还能以此作为分子靶标达到治疗的目的。mi R-19b属于mi RNA家族成员,在进化上高度保守,在多种生物的胚胎心脏中均有表达。以往研究表明mi R-19b的表达缺失时,能够导致新生小鼠室间隔缺损,提示mi R-19b可能参与了早期心脏发育过程。提示mi R-19b可能在早期即参与了心脏发育过程。也有研究表明,mi R-19b的表达水平在扩张型心肌病患者心肌重构的心肌组织中发生显着上调。尽管mi R-19b在心脏发育过程中发挥着重要作用,但目前有关mi R-19b与病毒性心肌炎发生和发展相关性的研究依然相对较少。目的本研究探讨病毒性心肌炎患儿循环血中mi R-19b的表达变化及其与心肌病变严重程度的相关性,同时分析其表达对心肌细胞增殖和凋亡的影响,并对其中的相关机制进行研究,旨在为病毒性心肌炎的临床诊断及开发新的靶向治疗药物奠定基础。方法（1）本研究采集来自于2014年6月2015年6月在吉林大学第一医院住院收治的病毒性心肌炎患儿外周血,共50例。荧光定量PCR检测外周血样本中mi R-19b表达;检测血清中c Tn I和CK-MB的表达;测定患儿左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）;分析mi R-19b表达与上述检测指标的相关性。（2）采用酶两步消化法分离培养原代SD大鼠乳鼠心肌细胞。将mi R-19b mimic和mi R-19b inhibitor转染上述细胞,荧光定量PCR检测转染后细胞中mi R-19b的表达。将CVB3感染上述细胞,CCK-8实验检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。运用生物信息学软件预测mi R-19b的靶基因,构建含有荧光素酶报告基因的TLR23’UTR（野生型）和TLR2 3’UTR-mut（突变型）质粒,并将之分别与mi R-19b mimic共转染乳鼠心肌细胞,检测上述细胞中荧光素酶的表达。分别将mi R-19b mimic和mi R-19b inhibitor共转染乳鼠细胞,随后用CVB3感染上述细胞,检测细胞中TLR2m RNA和蛋白的表达。（3）构建mi R-19b过表达病毒性心肌炎大鼠模型,检测上述模型大鼠心肌组织中mi R-19b的表达。将CVB3分别感染上述大鼠模型以及正常SD大鼠,HE染色法观察心肌组织病理学变化,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测TLR2蛋白的表达。结果（1）在重症VMC组中,恢复期时血浆mi R-19b的表达量明显高于急性期;在轻症VMC组中,恢复期时血浆mi R-19b的表达量明显高于急性期。病毒性心肌炎患儿血清中c Tn I水平明显高于对照组患儿。在重症VMC组中,恢复期时血清c Tn I水平明显低于急性期;在重症VMC组中,恢复期时血清c Tn I水平明显低于急性期。病毒性心肌炎患儿血清中CK-MB水平明显高于对照组患儿。在重症VMC组中,恢复期时血清CK-MB水平明显低于急性期;在轻症VMC组中,恢复期时血清CK-MB水平明显低于急性期。EF检测结果表明,重症期患儿EF明显低于对照组;重症VMC组恢复期患儿EF与对照组相比无显着差异;轻症VMC组急性期患儿EF与对照组相比无明显差异;轻症VMC组恢复期患儿与对照组相比无显着差异。重症VMC患儿急性期血浆mi R-19b表达水平与血清c Tn I含量呈负相关,重症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与血清c Tn I含量无明显相关性;轻症VMC患儿急性期血浆mi R-19b表达水平与血清c Tn I含量呈负相关,轻症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与血清c Tn I含量无明显相关性。而对照组患儿血浆mi R-19b表达水平与血清c Tn I含量无显着相关性。重症VMC患儿急性期血浆mi R-19b表达水平与血清CK-MB含量呈负相关,重症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与血清CK-MB含量无明显相关性;轻症VMC患儿急性期血浆mi R-19b表达水平与血清CK-MB含量呈负相关,轻症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与血清CK-MB含量无明显相关性。对照组患儿血浆mi R-19b表达水平与血清CK-MB含量无显着相关性。重症VMC患儿急性期血浆mi R-19b含量与EF之间存在明显正相关,重症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与EF之间无显着相关性;轻症VMC患儿急性期血浆mi R-19b含量与EF之间无明显相关性,轻症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与EF之间无显着相关性。对照组患儿血浆mi R-19b表达水平与血清EF含量无显着相关性。重症VMC患儿急性期血浆mi R-19b含量与FS之间存在明显正相关,重症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与FS之间无显着相关性;轻症VMC患儿急性期血浆mi R-19b含量与FS之间无明显相关性,轻症VMC患儿恢复期血浆mi R-19b表达水平与FS之间无显着相关性。对照组患儿血浆mi R-19b表达水平与血清FS含量无显着相关性。（2）转染mi R-19b mimic后乳鼠心肌细胞中mi R-19b的表达明显高于对照组;转染mi R-19b inhibitor后乳鼠心肌细胞中mi R-19b的表达明显低于对照组。与对照组相比,mi R-19b mimic组在48 h、72 h、96 h时的存活率均明显增高,而mi R-19b inhibitor组相应时间点时的存活率均明显降低。与对照组相比,mi R-19b mimic组细胞的凋亡率明显降低,mi R-19b inhibitor组细胞的凋亡率明显增高。TLR2为mi R-19b的靶基因。构建的携带有荧光素酶报告基因的野生型TLR2 3’UTR载体与mi R-19b mimic共转染乳鼠心肌细胞后细胞中荧光素酶表达水平明显降低,而突变型TLR2 3’UTR载体与mi R-19b mimic共转染后细胞中荧光素酶的表达量则无明显变化。TLR m RNA检测结果表明,与对照组相比,mi R-19b mimic组细胞中TLR m RNA的表达水平明显降低,而mi R-19b inhibitor组细胞中TLR m RNA的表达水平明显增高。TLR2蛋白检测结果表明,与对照组相比,mi R-19b mimic组细胞中TLR蛋白的表达水平明显降低,而mi R-19b inhibitor组细胞中TLR蛋白的表达水平明显升高。（3）转基因大鼠模型心肌组织中mi R-19b的表达水平明显高于对照组。正常SD大鼠在感染CVB3后大量心肌细胞发生坏死崩解,细胞核以及细胞轮廓消失,在心肌细胞间隙内可观察到大量炎症细胞浸润,且浸润部位心肌纤维排列紊乱,心肌组织被破坏。心肌炎转基因大鼠感染CVB3后心肌细胞崩解数量显着减少,细胞核和细胞轮廓较为清晰,心肌细胞间隙可见少量炎性细胞浸润。感染CVB3后心肌炎转基因大鼠心肌细胞的凋亡率明显低于正常SD大鼠。感染CVB3后心肌炎转基因大鼠心肌组织中TLR2蛋白的表达明显低于正常SD大鼠。结论（1）mi R-19b在病毒性心肌炎中表达降低;（2）mi R-19b与病毒性心肌炎疾病严重程度及病程相关;（3）mi R-19b通过靶向抑制TLR2的表达促进心肌细胞增殖,抑制其凋亡,从而抑制病毒性心肌炎的发展。（4）mi R-19b对由CVB3感染所引起的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与mi R-19b抑制TLR2蛋白的表达,从而减轻心肌细胞炎症反应,抑制心肌细胞凋亡有关。
二、细胞因子与病毒性心肌炎研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞因子与病毒性心肌炎研究进展（论文提纲范文）
（1）IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 IL-37在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分：CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎动物模型的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第二部分：IL-37在VMC小鼠心肌细胞焦亡中的作用及潜在机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 柯萨奇病毒 |
| 2 柯萨奇病毒性心肌炎 |
| 2.1 病毒性心肌炎 |
| 2.1.1 病毒性心肌炎的病原学 |
| 2.1.2 病毒性心肌炎的诊断标准 |
| 2.1.3 病毒性心肌炎的治疗 |
| 2.2 柯萨奇病毒感染诱发心肌炎的致病过程 |
| 2.3 柯萨奇病毒性心肌炎中介导心脏损伤的因素 |
| 2.3.1 病毒直接介导的心脏损伤 |
| 2.3.2 固有免疫反应介导的心脏损伤 |
| 2.3.3 获得性免疫反应介导的心脏损伤 |
| 3 TLR9-IRF5 信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.1 TLR家族简介 |
| 3.2 TLR信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.3 TLR9 介导的信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.3.1 TLR9 信号通路 |
| 3.3.2 TLR9 信号途径在病毒性心肌炎发病机制中的研究 |
| 3.4 病毒性心肌炎中TLR9 的配体 |
| 3.4.1 mtDNA |
| 3.4.2 HMGB1 |
| 3.5 TLR9 信号途径中参与病毒性心肌炎的关键分子 |
| 3.5.1 MyD88 |
| 3.5.2 NF-κB |
| 3.5.3 IRFs |
| 3.6 IRF5 在心肌炎中的作用 |
| 3.6.1 IRF5 的生理功能 |
| 3.6.2 IRF5 对炎症的调控 |
| 3.6.3 IRF5 介导的心脏损伤 |
| 3.7 TLR9/ IRF5 信号拮抗剂应用的研究现状 |
| 3.7.1 TLR9 拮抗剂应用的研究现状 |
| 3.7.2 IRF5 拮抗剂的研究现状 |
| 3.7.3 TLR9/ IRF5 信号拮抗剂的临床应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 TLR9-IRF5 信号通路相关分子在柯萨奇病毒性心肌炎患者中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者纳入与排除标准 |
| 2.1.2 临床指标采集 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者血清中IRF5 相关细胞因子的表达检测 |
| 2.3.2 柯萨奇病毒性心肌炎患者心包积液中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者血清中IRF5 相关细胞因子的表达水平 |
| 3.2 柯萨奇病毒性心肌炎患者的心包积液细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平 |
| 3.3 柯萨奇病毒性心肌炎患者的心包积液上清中TNF-α和IL-6 的表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 TLR9-IRF5 信号通路在柯萨奇病毒性心肌炎小鼠中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.0 实验动物与细胞 |
| 2.1 ODNs |
| 2.2 病毒 |
| 2.3 实验试剂与器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 CVB3 的扩增与毒力检测 |
| 2.4.2 CVB3 感染BAlB/c小鼠建立VMC动物模型 |
| 2.4.3 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织病理变化的动态检测 |
| 2.4.4 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子m RNA表达水平的动态检测 |
| 2.4.5 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌组织中HMGB1 的检测 |
| 2.4.6 CVB3 感染H9C2 细胞建立VMC细胞模型 |
| 2.4.7 CVB3 感染后H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子m RNA表达水平的动态检测 |
| 2.4.8 HMGB1 中和抗体干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.9 氯喹干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.10 AAAG ODN干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.11 检测Cp G1826 干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.12 检测AAAG ODN干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.13 检测氯喹干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.14 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子与心肌损伤的关系 |
| 3.1.1 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠模型的建立 |
| 3.1.2 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织病理动态变化 |
| 3.1.3 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的动态变化 |
| 3.1.4 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平与心肌损伤程度的相关性分析 |
| 3.2 CVB3 感染诱发心肌细胞中TLR9-IRF5 信号活化 |
| 3.2.1 CVB3 感染后心肌细胞中HMGB1 表达水平 |
| 3.2.3 CVB3 感染后心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.2.4 HMGB1 中和抗体对CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.2.5 氯喹对CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.2.6 AAAG ODN对 CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.3 干扰TLR9-IRF5 信号对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.1 Cp G1826对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.2 氯喹对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.3 AAAG ODN对 CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CVB3 感染过程中HMGB1 的释放与TLR9 信号的激活 |
| 4.2 CVB3 感染后TLR9-IRF5 信号的激活与心肌损伤 |
| 5 小结 |
| 第三章 调节TLR9-IRF5 信号通路对小鼠柯萨奇病毒性心肌炎的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2 ODNs |
| 2.3 实验试剂与器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 AAAG ODN干预柯萨奇病毒性心肌炎小鼠 |
| 2.4.2 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠体重及一般状态影响的检测 |
| 2.4.3 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏炎症的检测 |
| 2.4.4 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9 信号通路主要因子的表达检测 |
| 2.4.5 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周免疫器官中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达检测 |
| 2.4.6 AAAG ODN干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中病毒载量检测 |
| 2.4.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AAAG ODN对柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的影响 |
| 3.1.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的一般状态 |
| 3.1.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的心脏损伤程度 |
| 3.2 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.2.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子在感染后第7天的表达水平 |
| 3.2.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子在感染后第14天的表达水平 |
| 3.3 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周免疫器官中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.3.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠脾脏中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.3.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周血白细胞的中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.4 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中病毒载量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AAAG ODN干预后对柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏中TNF-ɑ和 IL-6 表达水平的影响 |
| 4.2 不同时间应用AAAG ODN对柯萨奇病毒性心肌炎影响差异的可能机制 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）加减三仁汤治疗湿热侵心型小儿病毒性心肌损伤临床观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1. 病机 |
| 1.1 病毒感染 |
| 1.2 免疫损伤 |
| 1.3 其他因素 |
| 2. 诊断 |
| 2.1 AST |
| 2.2 CK |
| 2.3 LDH |
| 2.4 其他酶 |
| 3. 非酶蛋白 |
| 3.1 cTnI |
| 3.2 Mb |
| 3.3 其他 |
| 4. 心电图 |
| 4.1 动态心电图 |
| 4.2 高频心电图 |
| 4.3 超声心动图 |
| 4.4 磁共振成像 |
| 5. 病原诊断 |
| 5.1 病毒分离 |
| 5.2 抗体检测 |
| 5.3 免疫性测定 |
| 5.4 分子生物学 |
| 6. 小儿病毒性心肌损伤的西医治疗原则 |
| 6.1 个体化治疗 |
| 6.2 集束化治疗 |
| 7. 中医研究 |
| 7.1 中医对心肌损伤的认识 |
| 7.2 中医对心肌炎的治疗 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1. 临床资料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 一般资料 |
| 1.3 诊断标准 |
| 1.4 纳入标准 |
| 1.5 排除标准 |
| 1.6 脱落标准 |
| 1.7 剔除标准 |
| 1.8 终止及退出标准 |
| 1.9 样本含量确定 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.4 疗效判断 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 一般情况分析 |
| 3.2 临床结果分析 |
| 第三部分 讨论 |
| 1. 立题依据 |
| 2. 本课题方药 |
| 3. 临床研究结果分析 |
| 3.1 一般结果 |
| 3.2 结果分析 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（5）芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 病毒性心肌炎研究进展 |
| 1.1 病原学研究进展 |
| 1.2 发病机制研究 |
| 1.3 防治研究 |
| 1.3.1 疫苗防治 |
| 1.3.2 中药防治 |
| 2 芩芪口服液中单味中药药理研究进展 |
| 2.1 黄芩研究现状 |
| 2.2 黄芪研究现状 |
| 2.3 丹参研究现状 |
| 2.4 板蓝根研究现状 |
| 2.5 连翘研究现状 |
| 前言 |
| 试验部分 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 实验动物、细胞株、病毒 |
| 1.2 主要试剂与药物 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 芩芪口服液对小鼠急性毒性试验 |
| 2.2 芩芪口服液对大鼠长期毒性试验 |
| 2.3 BHK-21 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.4 EMCV的扩增、收获 |
| 2.5 EMCV的毒力测定 |
| 2.6 EMCV 3D基因质粒的制备 |
| 2.7 VMC动物模型制备 |
| 2.8 芩芪口服液对VMC小鼠的影响 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 小鼠急性毒性试验结果 |
| 3.2 大鼠长期毒性试验结果 |
| 3.3 EMCV毒力测定 |
| 3.4 EMCV3D基因质粒的制备 |
| 3.5 小鼠VMC模型评价 |
| 3.6 芩芪口服液对VMC的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 芩芪口服液安全性评价 |
| 4.2 EMCV感染小鼠模型的评价 |
| 4.3 芩芪口服液对小鼠急性病毒性心肌炎中Th17/Treg平衡的影响 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）苏州大学附属儿童医院心肌炎临床特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分: 2014-2018年单中心儿童心肌炎临床特征分析 |
| 前言 |
| 临床资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 单中心十五年儿童暴发性心肌炎临床特征分析 |
| 前言 |
| 临床资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童心肌炎诊疗进展 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 致谢 |
（7）固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-17A在CVB3感染早期胰腺显着上调并促进病毒性胰腺炎损伤 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 小鼠、细胞和病毒 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了严重的致死性急性病毒性胰腺炎 |
| 3.2 CVB3感染显着上调胰腺局部早期IL-17A分泌 |
| 3.3 上调的IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎中发挥促炎有害作用 |
| 4、讨论 |
| 第二部分 γδT细胞是急性胰腺炎小鼠胰腺早期IL-17A的重要来源 |
| 1、引言 |
| 2、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 胰腺早期innate IL-17A的主要来源之一是胰腺浸润γδT细胞 |
| 4、讨论 |
| 第三部分: IL-17A~+γδT增加小鼠对CVB3的易感性并显着促进急性胰腺炎发病 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 γδT细胞促进CVB3急性胰腺炎发病 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后病毒性胰腺炎显着减轻 |
| 3.3 TCRδ~(-/-)小鼠回输WT小鼠Vγ4 γδT细胞加重病毒性胰腺炎 |
| 4、讨论 |
| 第四部分 γδT17细胞促进CVB3病毒性胰腺炎的机制与促进中性粒细胞胰腺浸润和诱导Th17应答相关 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 缺失IL-17A或γδT小鼠胰腺炎减轻均伴随胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4γδT细胞后胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.3 清除Vγ4 γδT小鼠感染CVB3后上调IFNγ~+CD4~+Th1下调IL-17A~+Th17应答 |
| 4、讨论 |
| 第五部分 早期IL-23-IL-17通路激活胰腺γδT17细胞的机制探讨 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染第1天诱导胰腺IL-23显着上调表达 |
| 3.2 注射重组IL-23显着加重CVB3诱导胰腺炎的严重程度 |
| 3.3 注射重组IL-23后显着增加体内诱导的IL-17A~+γδT应答 |
| 4、讨论 |
| 结论和思考 |
| 1、结论 |
| 2、创新性 |
| 3、不足和未尽工作 |
| 参考文献 |
| 综述: IL- 17A~+γδT细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
（8）基于JAK/STAT信号通路探讨养心活血解毒方对病毒性心肌炎心肌损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献回顾 |
| 一、古代医家对病毒性心肌炎中医病名病因病机的认识 |
| (一) 病名追溯 |
| (二) 病因病机认识 |
| 二、现代医家对病毒性心肌炎病机治法的认识 |
| (一) 病毒性心肌炎诊断及中医病因 |
| (二) 病机研究 |
| (三) 病毒性心肌炎治疗方法 |
| 三、现代医家对病毒性心肌炎发病机制的认识 |
| (一) 病毒对心肌的直接损伤 |
| (二) 免疫机制介导的心肌损伤 |
| (三) 心肌纤维化 |
| 四、心肌组织JAK/STAT通路研究进展 |
| (一) JAK/STAT信号通路的组成 |
| (二) JAK/STAT信号通路的活化与调控 |
| (三) 心肌JAK/STAT信号通路的生理生理学意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 养心活血解毒方对病毒性心肌炎小鼠心肌损伤的保护作用 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 二、结果 |
| (一) 小鼠一般情况 |
| (二) 生存情况 |
| (三) 体重变化 |
| (四) 对小鼠血清CK-MB水平的影响 |
| (五) 对小鼠血清LDH水平的影响 |
| (六) HE染色观察各组小鼠的病理变化 |
| 实验二 养心活血解毒方对病毒性心肌炎小鼠心肌组织JAK/STAT通路的干预效应 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 二、结果 |
| (一) ELISA检测各组小鼠血清IL-6、IL-10的含量 |
| (二) 免疫组化法测定心肌组织FAS、FASL蛋白阳性表达 |
| (三) Western Blot检测心肌组织JAK2、STAT3蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 一、病机讨论 |
| (一) 气阴两虚 |
| (二) 热毒 |
| (三) 瘀血 |
| 二、组方配伍及方药分析 |
| (一) 组方依据及方解分析 |
| (二) 中药溯源及现代药理分析 |
| 三、疗效及机理分析 |
| (一) 各对小鼠一般情况、生存情况、体重变化的影响 |
| (二) 调节心肌酶谱水平 |
| (三) 对心肌组织形态学的影响 |
| (四) 对小鼠血清IL-6、IL-10含量的影响 |
| (五) 对小鼠心肌组织FAS、FASL表达的影响 |
| (六) 对小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白的影响 |
| 结语 |
| 创新性和不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（9）分泌IL-10B细胞在小鼠病毒性心肌炎发病中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 分泌IL-10B细胞在小鼠病毒性心肌炎发病过程中的变化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 分泌IL-10B细胞对VMC小鼠Th1和Th17细胞的调节作用 |
| 研究一 过继分泌IL-10B细胞对缺T和B细胞小鼠病毒性心肌炎的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 过继分泌IL-10B细胞对缺B细胞小鼠病毒性心肌炎的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 过继分泌IL-10B细胞对小鼠VMC发病过程的影响 |
| 研究一 过继分泌IL-10B细胞对小鼠发生病毒性心肌炎的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 过继分泌IL-10B细胞对已发生病毒性心肌炎小鼠的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 附录 |
| 综述1 |
| 参考文献 |
| 综述2 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（10）miR-19b在病毒性心肌炎中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 病毒性心肌炎发病机制研究新进展 |
| 2.1.1 病毒直接损伤 |
| 2.1.2 免疫损伤 |
| 2.1.3 细胞凋亡 |
| 2.1.4 自噬 |
| 2.2 MicroRNA与心血管疾病的研究进展 |
| 第3章 miR-19b在病毒性心肌炎患儿循环血中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 待测血清样本采集与保存 |
| 3.2.2 心肌肌钙蛋白及肌酸磷酸激酶同工酶检测 |
| 3.2.3 血浆miR-19b表达检测 |
| 3.2.4 左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）检测 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RNA质量检测结果 |
| 3.3.2 荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3.3 cTn I含量检测结果 |
| 3.3.4 CK-MB含量检测结果 |
| 3.3.5 病毒性心肌炎患儿左心室射血分数和短轴缩短率检测结果 |
| 3.3.6 病毒性心肌炎患儿血浆miR-19b与血清cTnI相关性分析结果 |
| 3.3.7 病毒性心肌炎患儿血浆miR-19b与血清CK-MB相关性分析结果 |
| 3.3.8 病毒性心肌炎患儿血浆miR-19b与EF和FS相关性分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 miR-19b对病毒性心肌炎心肌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 转染后乳鼠心肌细胞中miR-19b的表达 |
| 4.2.2 CCK-8 检测结果 |
| 4.2.3 细胞凋亡检测结果 |
| 4.2.4 miR-19b作用靶点预测 |
| 4.2.5 miR-19b作用靶点分析结果 |
| 4.2.6 TLR2 mRNA和蛋白表达检测 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 miR-19b对病毒性心肌炎转基因大鼠模型的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 心肌组织miR-19b表达检测结果 |
| 5.2.2 心肌组织病理学观察结果 |
| 5.2.3 心肌组织TUNEL染色观察结果 |
| 5.2.4 western blot检测心肌组织中TLR2蛋白的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、细胞因子与病毒性心肌炎研究进展（论文参考文献）
- [1]IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡[D]. 孙琳. 山东大学, 2021(12)
- [2]白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎[D]. 孙琳. 山东大学, 2021(09)
- [3]干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用[D]. 聂抒. 吉林大学, 2020(08)
- [4]加减三仁汤治疗湿热侵心型小儿病毒性心肌损伤临床观察[D]. 吴晓燕. 广州中医药大学, 2019(08)
- [5]芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用[D]. 杨慧. 山西农业大学, 2019(07)
- [6]苏州大学附属儿童医院心肌炎临床特征研究[D]. 顾丽雯. 苏州大学, 2019(05)
- [7]固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制[D]. 颜克鹏. 苏州大学, 2018(06)
- [8]基于JAK/STAT信号通路探讨养心活血解毒方对病毒性心肌炎心肌损伤的保护作用[D]. 劳慧敏. 山东中医药大学, 2017(08)
- [9]分泌IL-10B细胞在小鼠病毒性心肌炎发病中的作用及其机制[D]. 韦斌. 广西医科大学, 2017(10)
- [10]miR-19b在病毒性心肌炎中作用机制的研究[D]. 张圳. 吉林大学, 2017(11)