一、低分子肝素钠凝胶的抗炎作用（论文文献综述）
张庆冬[1]（2021）在《外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用》文中指出肝素（Heparin,HP）/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）是由重复二糖单元组成的一类线性的聚阴离子酸性多糖,是一类重要的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）。HP/HS广泛地分布于细胞表面或细胞间基质中,甚至在某些细胞内环境中也有发现。自1935年起,HP由于其良好的抗凝血活性被广泛地应用于临床治疗中。由于HP/HS在生物合成过程中,其多糖骨架在众多修饰酶的作用下,形成了异常复杂的结构,使得HP/HS能与多种活性蛋白分子相互作用进而参与影响一些生理及病理过程。尽管高度复杂的结构赋予了HP/HS多种多样的生物学活性,但同时也阻碍了研究学者们对HP/HS构效关系的研究。细菌来源的肝素酶（Heparinase,Hepase）是一类专一性降解HP/HS底物的多糖裂解酶。Hepases在HP/HS的构效关系研究、HP/HS寡糖及低分子肝素（Low-molecular-weight-heparin,LMWH）的制备过程中具有着重要的应用。已鉴定的肝素酶分为三类:Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ,均为内切型裂解酶。然而,对HP/HS结构研究非常重要的外切型肝素酶（exoHepase）却一直未见报道。我们从 NCBI（The National Center for Biotechnology Information）数据库中筛选到了 5个来自PL152亚家族的exoHepase基因,并对它们进行了克隆表达纯化和深入的酶学性质、底物特异性研究、结构研究以及初步应用。主要成果包括以下几个方面:（1）PL152亚家族肝素酶的筛选及活性鉴定:我们从NCBI数据库中筛选了 5个指认为Hepase的候选基因,分别命名为BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep。通过对它们进行生物信息学分析,我们发现BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 归类于 PL152 亚家族,并且它们基本由N端的信号肽,DUF4962结构域以及C端Hepase-Ⅱ-Ⅲ家族结构域组成。并且,它们与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ,Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ相似度极低,反而与来源于PL151亚家族的外切型褐藻胶裂解酶Atu3025相似度最高。在对BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 进行异源表达纯化并验证活性之后发现,它们仅降解HP/HS底物,并不降解褐藻胶底物,其中它们对HP底物的活性远高于对HS底物的活性。因此我们得出结论,PL15家族的两个亚家族的酶类具有不同的底物选择性:PL151亚家族中的裂解酶专一性地降解褐藻胶底物;PL152亚家族中的裂解酶专一性地降解HP/HS底物。（2）PL152亚家族肝素酶的酶学性质研究:由于BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HP/HS底物的酶活较低,因此我们首先制备了一批硫酸化度较高的底物HP-FαⅢ（Hepase Ⅲ降解HP的终产物）来对PL152亚家族肝素酶的酶学性质进行研究。实验结果证明:PL152家族的肝素酶大多适应于中性pH以及低温环境,如20℃。当环境温度高于30℃时,它们的酶活急剧下降,表明它们对温度比较敏感。研究显示,Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+等重金属离子均能对PL152家族的肝素酶的酶活产生强烈的抑制作用。二价金属离子如Ca2+、Ba2+和Mg2+等能对这些肝素酶的活性产生明显的促进作用,与之相应的,二价金属离子螯合剂EDTA和EGTA均能对这些肝素酶的活性呈现出不同程度的抑制作用,表明二价金属离子在PL152亚家族的肝素酶的活性中发挥着非常重要的作用。此外,适当浓度的盐（NaCl或KCl）能够显着地促进上述PL152亚家族肝素酶酶活,表明盐参与了该类肝素酶的催化过程。经研究,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对 HP-FαⅢ的酶活分别为 49.89、61.86、26.75、24.25 和 12.15 U/mg。BIexoHep 和 BCexoHep对 HP 的比酶活分别为 0.75 和 1.14 U/mg。BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep对 HP 的比酶活极低,小于 0.5 U/mg。此外,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HS的比酶活均远小于0.5 U/mg。以上结果表明,PL152亚家族的肝素酶倾向于降解硫酸化度较高的底物。（3）PL152亚家族肝素酶的降解模式及降解方向研究:我们分别用PL152亚家族的肝素酶 BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对HP多糖进行时间梯度降解,发现在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物,在该过程中没有明显的大分子量不饱和寡糖被检测到;之后我们又用它们对饱和的HP十三糖（DP13）进行时间梯度降解,同样的,在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物。这说明它们都是之前一直未见报道的外切型肝素酶（exoHepase）。进一步地研究表明,本论文中的PL152亚家族的exoHepases不能降解还原端荧光标记的HP DP13,意味着HP糖链还原端标记引入的荧光基团阻碍了 PL152亚家族exoHepases对底物的降解,从而证明该类酶对底物的降解是从还原端开始的,并以二糖为单位向非还原端逐次切割底物。这是Hepases研究领域首次发现的外切型肝素酶,不但填补了该领域的空白状态,更为HP/HS的构效关系研究提供了亟需的工具酶。（4）exoHepases的底物结构选择性研究:为了探究这类PL152亚家族exoHepases的底物特异性,我们首先制备了一些结构确定的HP四糖,分别为:P4-4（AUAl-4GlcNAc6S 1-4GlcA1-4GlcNS6S 和ΔUA1-4GlcNAc6S 1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-5（AUA1-4GlcNS 1-4GlcA 1-4GlcNS6S和 ΔUA1-4GlcNS1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-6（ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4GlcAl-4GlcNS6S）、P4-7（AUA2S1-4GlcNS6S 1-4GlcA 1-4GlcNS6S）和 P4-8（ΔUA2S1-4GlcNS6S1-4IdoA2S1-4GlcNS6S）。研究发现,HP 四糖 P4-4、P4-5、P4-6、P4-7和P4-8均能被过量的exoHepases彻底降解,说明exoHepases对底物中的糖醛酸构型没有选择性。然而,我们发现exoHepases对糖醛酸构型存在不同的倾向性:exoHepases倾向于降解含IdoA2S的底物,其次为含GlcA的底物,相比之下,对含IdoA的底物的偏好性最差。此外,exoHepases倾向于降解硫酸化度较高的底物,底物的硫酸化度越高,如P4-8（六硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越高;底物的硫酸化度越低,如P4-4（三硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越低。该种现象解释了为什么exoHepases对高硫酸化度的HP底物降解活性好,却对低硫酸化度的HS底物降解活性好差。尽管exoHepases对高硫酸化度的底物降解活性较强,然而当底物中有3-O硫酸化修饰时,如磺达肝癸钠,便对exoHepases的活性产生了抗性,不能被降解完全。（5）exoHepases的结构及催化模式研究:通过对所鉴定的exoHepases中一个代表性酶BIexoHep进行结构研究,我们发现BIexoHep的结构主要由三个结构域组成:N末端小的β-折叠结构域,中心（α/α）5不完整桶状结构域和C端β-三明治结构域。BIexoHep的晶体结构呈现为单体而不是二聚体形式,并且每个BIexoHep蛋白分子中都含有两个Ca2+。BIexoHep难以单独成晶,需要与HP二糖产物共结合方能产生稳定的蛋白晶体。BIexoHep的结构与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ以及Hepase Ⅲ的结构之间相似度很低,但是通过将BIexoHep与Hepase II叠加分析发现,两者的的活性中心组成尤为相似,意味着两者的催化机制可能存在一定的相似性。关键氨基酸突变研究揭示了 BIexoHep的潜在底物催化机制:（1）降解含IdoA的底物时,His337作为Bronsted碱夺取IdoA中C5的质子,而Tyr390充当Bronsted酸向1-4糖苷键中的氧提供质子,从而完成β消除反应;（2）当降解含GlcA的底物时,Tyr390将同时充当Bronsted碱和酸完成β消除反应。进一步,通过制备和解析BIexoHep与HP四糖底物的共晶结构,我们发现在BIexoHep的结构中,有一个半开放的、狭长的呈“L”形的催化腔。BIexoHep特殊的半开放“L”形反应通道由两个几乎相互垂直的部分组成:带正电荷的进口部分与带负电荷的出口部分。正是该特殊反应通道的存在,赋予了 BIexoHep外切酶活性。结合关键氨基酸突变实验,我们提出exoHepases的底物外切催化机制假设:（1）首先,环境中带负电荷的游离HP糖链在电荷吸引的作用下,其还原端与“L”反应通道带正电的入口部分结合;（2）在电性吸引的作用力下,HP糖链深入“L”反应通道带正电的入口部分,一旦还原端二糖到达“+1”和“+2”位点,还原端二糖将通过β-消除机制被降解下来;（3）被降解下来的HP不饱和二糖在带负电荷的氨基酸残基Asp335的电性排斥作用下,迅速地被推入带负电荷的出口部分,然后在氨基酸残基Pro67和Asp281电性排斥作用下迅速从出口释放。（6）exoHepase的初步应用:我们利用exoHepases从HP/HS底物还原端以二糖为单位进行酶解的特性开发出了一种新型的HP/HS酶学测序方法。该测序方法通过用BIexoHep对HP不饱和寡糖进行不完全降解,进而制备相应的非还原端UDP4、UDP6、UDP8...UDP2n。然后,通过分析比较这些不饱和寡糖的二糖组成,进而推测出完整的HP寡糖序列。在本论文中,我们运用该方法,成功地对 5 种HP 八糖进行了初步测序,分别为:P8-1ΔUA1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS6S-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4Glc NS、P8-2ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS 6S、P8-3ΔUA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S1-4GlcNS6S-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA1-4GlcN S6S、P8-4ΔUA1-4GlcNS6S1-4HexUA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexUA2S1-4GlcNS6S1-4HexUA2S1-4GlcNS6S 和P8-5△UA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S 1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4G lcNS6S。该方法操作简易,以二糖为单位对HP寡糖进行序列鉴定,大大地简化了实验步骤;利用荧光标记,极大的降低了样品的用量和提高了分析检测的灵敏度;理论上该方法不仅能对复杂HP八糖进行测序,还可以对更大分子量的HP/HS寡糖进行序列分析。本论文对来自PL152亚家族的5个exoHepases进行了详细的酶学性质研究、底物特异性研究、三维结构与催化机制研究和初步应用。本论文对exoHepases的研究不仅填补了 Hepases领域的空白,更是为HP/HS结构研究提供了潜在的工具酶。
宋良琛[2]（2020）在《消栓饮对创伤性肢体深静脉血栓兔股静脉血管TMmRNA、mEPCRmRNA表达的影响》文中认为目的:本实验建立创伤性深静脉血栓兔模型,以消栓饮进行干预,观察其对大兔股静脉血管组织TMm RNA、m EPCRm RNA表达的影响,探讨消栓饮抗深静脉血栓形成的机制。方法:将36只成年新西兰大白兔,3-5月龄,适应性喂养1周后,随机选取27只采用钳夹联合石膏外固定法建立创伤性股静脉血栓兔模型,造模成功后随机分为A消栓饮组,B低分子肝素钠组,C生理盐水组,剩下的归为D假手术组,每组9只;之后分组给药喂养,连续1周,在术后第1、3、7d第二次给药后4h取股静脉血管进行实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测;对实验数据进行统计学分析。结果:造模成功后的相同时间段里,完成造模的消栓饮组、低分子肝素钠组、生理盐水组的TMm RNA、m EPCRm RNA的表达均明显低于假手术组,差异具有显着性（P均<0.01）。术后第1d,低分子肝素钠组TMm RNA、m EPCRm RNA水平较消栓饮组、生理盐水组升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;而消栓饮、生理盐水两组间无明显差异（P>0.05）。术后第3、7d,与生理盐水组相比,消栓饮与低分子肝素钠两组TMm RNA、m EPCRm RNA水平均显着升高（P<0.01）,而消栓饮与低分子肝素钠两组间差异无显着性（P>0.05）。在同组内不同时间点的比较,消栓饮与低分子肝素钠两组术后第3、7d的TMm RNA、m EPCRm RNA表达较术后第1d均升高,具有统计学意义（P<0.05）,术后第7d较第3d升高,差异具有显着性（P<0.05）;生理盐水组的TMm RNA、m EPCRm RNA在第3d达到最低值,但与第1、7d相比无明显差异（P>0.05）;假手术组的TMm RNA、m EPCRm RNA一直保持最高表达,且不同时间点的表达差异无显着性（P>0.05）。结论:中药消栓饮能提升创伤性深静脉血栓兔股静脉血管上TMm RNA、m EPCRm RNA的表达,促进蛋白C抗凝系统活性,达到治疗DVT的目的。
杜振兴[3]（2020）在《南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究》文中认为肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖,具有较高含量的硫酸基,是已知负电荷密度最高的生物大分子,具有良好的抗凝血作用,是临床使用最广泛的抗凝血剂,近年来有研究还发现肝素具有降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用,是重要的粘多糖类生化药物之一。目前,肝素主要以猪小肠黏膜、牛肺等组织为原料,经过提取分离得到,然而以家畜内脏为原料提取肝素存在污染高和安全质量风险等问题。此外,该来源肝素因抗凝作用过强,用药过程中容易出现出血效应等副作用,这限制了肝素非抗凝血活性的开发利用。从海洋生物中寻找提取肝素新的替代原材料越来越受到关注。前人研究已发现,一些海洋生物源肝素具有与传统肝素类似的药理活性,但抗凝血作用相对缓和,能够有效降低其用药出现的出血副作用。我们的前期研究发现一些海洋贝类富含酸性粘多糖。本研究从南海常见8种贝类中提取肝素,并比较其抗凝血活性,筛选出肝素效价较高的原料,对其结构进行解析,并评价其出血效应和抗血栓活性,以期为海洋生物源肝素的开发利用以及抗血栓活性多糖的研究提供参考。本课题主要研究内容及结果如下:（1）8种贝类肝素粗品的提取及抗凝血活性比较以南海常见8种贝类（海蚌、泥蚶、蛏子、文蛤、钝缀锦蛤、海湾扇贝、象拔蚌、菲律宾蛤蜊）为原料,采用双酶酶解、乙醇醇沉以及Sevag脱蛋白等方法制备肝素粗品,并对其理化性质和抗凝血活性进行比较分析。最终筛选出海蚌肝素和文蛤肝素为最优实验对象,其中肝素含量分别为239.2μg/mg和214.8μg/mg,硫酸基含量分别为6.2%和7.7%。两种贝类肝素主要含有Glc N、Glc A、Ido A和Glc等单糖,并且符合肝素的紫外和红外吸收特征,其抗凝血作用约为传统肝素的1/2。（2）海蚌、文蛤肝素的分离纯化及理化性质利用离子交换法和乙醇醇沉法对海蚌肝素和文蛤肝素进行分离纯化,并且对其理化性质进行分析,通过紫外光谱扫描分析其纯度,以及通过醋酸纤维电泳实验对其进行糖胺聚糖种类鉴定。结果表明,海蚌肝素和文蛤肝素经不同浓度Na Cl梯度洗脱分别获得三个组分（G1、G2、G2和M1、M2、M3）。其中,G2和M2为最优组分,其电泳迁移率与肝素最接近,提取率分别为1.17 mg/g和0.53 mg/g,肝素含量分别为88.1%和61.4%,效价分别为149.6 U/mg和122 U/mg,达到了商品化肝素的程度。（3）海蚌、文蛤肝素的结构表征采用高效液相凝胶色谱法测定G2和M2的分子量和纯度,采用刚果红实验分析其三股螺旋结构,利用同步热分析仪分析其结构热稳定性,采用红外光谱、单糖组成、二糖组成和核磁共振分析其糖链结构。结果表明,G2和M2分子量分别为30.99 k Da和22.58k Da,并且G2和M2均不具有三股螺旋结构,且结构热稳定良好。此外,G2和M2的糖链结构与肝素相似。G2主要的二糖重复单元为:→4)-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS3S6S-（1→（12.03%）、→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（25.81%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（33.32%）、→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS-（1→（26.53%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS-（1→（9.88%）和少量的→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc（1→（1.63%）。G2的四糖结构单元为:→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS3S6S-（1→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S（或Glc NAC）-（1→.和→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S（或Glc NAC）-（1→。M2的二糖重复片段为:→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS6S-（1→（31.19%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc（1→（23.21%）、→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS（1→（13.87%）,→4）-α-Ido A2S-（1→4）-α-Glc NS（1→（8.95%）,→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NAc6S（1→（7.39%）和→4）-β-Glc A-（1→4）-α-Glc NS6S(1→（7.63%）。（4）海蚌、文蛤肝素抗血栓活性通过分析海蚌肝素和文蛤肝素的抗凝血活性和纤溶活性评价抗血栓活性。其中,通过测定凝血三项指标（APTT、PT、TT）分析其抗凝血活性,通过琼脂糖纤维蛋白平板法分析其体外纤溶活性,通过测定t-PA、u-PA和PAI-1分析其体内纤溶活性,通过小鼠断尾实验评价其出血效应。结果表明,G2和M2均具有良好的抗凝血活性,其中G2主要通过外源凝血途径、内源凝血途径和阻止纤维蛋白的形成而发挥抗凝血作用;M2主要通过外源凝血途径和内源凝血途径发挥抗凝血作用。此外,琼脂糖纤维蛋白平板法测得G2和M2的纤溶活性分别为1.96±0.11 U/mg和1.41±0.10 U/mg。G2能通过促进t-PA和u-PA的释放,同时抑制PAI-1的释放,从而发挥体内纤溶活性;M2通过促进t-PA和u-PA的释放而发挥纤溶活性。M2的纤溶能力与传统肝素相近,而在6～12mg/kg剂量范围内,G15的体内纤溶活性是传统肝素的2.2～3.8倍。此外,小鼠断尾实验表明G2和M2的出血副作用低于传统肝素,强度降低为传统肝素的1/3～1/2。
陈玥婷[4]（2020）在《加减胶艾汤促进胎盘DAF表达抑制aPL诱导补体异常激活介导的胚胎损伤》文中认为目的:本课题通过建立抗磷脂抗体（a PL）阳性流产小鼠模型,观察研究加减胶艾汤对a PL阳性流产模型小鼠母胎界面促衰变因子DAF的表达及补体激活介导的炎症反应的影响,试从补体炎症的角度探讨加减胶艾汤治疗a PL阳性流产的病理机制,为加减胶艾汤的临床保胎疗效补充有力的理论及实验依据。方法:1.将90只8-10周龄雌性Balb/c小鼠随机分为空白组20只、造模组70只。以人β2糖蛋白I（β2-GPI）与无菌PBS溶解,最终浓度为100ug/0.25ml。第1天与完全弗氏佐剂（CFA）1:1比例混合,颈背部皮下注射主动免疫70只造模组小鼠,空白组注射生理盐水代替;第8天与不完全弗氏佐剂（IFA）1:1比例混合,方法同前,对造模组小鼠进行加强免疫,空白组同前进行;第15天小鼠断尾采血,检测抗磷脂抗体阳性者视为造模成功。2.将造模成功小鼠随机分为中+西药组、西药组、模型组,未造模成功的小鼠及原空白组共为正常对照组,均与健康雄鼠按2:1进行合笼,以见到阴栓或阴道涂片可见精子者为妊娠第0.5天,于妊娠D15天处死孕鼠,摘眼球取血,计算各组胚胎丢失情况,ELISA法检测小鼠血清抗β2-GPI抗体水平。3.免疫组织化学染色观察胎盘DAF的表达及C3在母胎界面的沉积,HE染色观察造模及给药对鼠母胎界面组织形态学的影响。Western-blot定量检测胎盘中DAF的表达,并通过ELISA检测其炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α及补体C3含量。结果:1.造模后小鼠胎盘DAF表达低于正常对照组（P<0.05,P<0.01）,2.IL-1β、IL-8、TNF-α、C3含量高于正常对照组（P<0.05,P<0.01）,母胎界面大量C3沉积及中性粒细胞浸润,胎盘组织呈片状、碎屑状坏死,胚胎吸收率明显升高,证明造模方法可靠。3.加减胶艾汤干预后,中+西药组小鼠胎盘DAF的表达高于模型组及西药组（P<0.05,P<0.01）;中+西药组C3、IL-1β、IL-8、TNF-α含量低于模型组及西药组（P<0.05,P<0.01）;中+西药组胎盘中性粒细胞浸润及炎症损伤小于模型组及西药组（P<0.05）;中+西药组胚胎吸收率低于模型组及西药组（P<0.01,P<0.05）。结论:根据以上实验结果得出,模型组母胎界面IL-1β、IL-8、C3、TNF-α的含量最高,胎盘DAF的表达最低,表明造模可靠。中+西药组小鼠胎盘DAF的表达明显升高,C3、IL-1β、IL-8、TNF-α的含量明显降低,所得结果均较模型组及西药组理想,证明加减胶艾汤干预后,可通过促进胎盘组织DAF的表达,从而抑制a PL介导的补体过度激活,减轻补体介导的炎症反应,降低模型小鼠的胚胎吸收率,其疗效优于单独使用阿司匹林。但鉴于中药组方的多靶点性,以及细胞因子网络的复杂性,考虑加减胶艾汤对a PL阳性流产的治疗效果可能存在其他作用机制,仍需我们进一步研究探讨。
侯德坤,李书胜,巩腾飞[5]（2020）在《低分子肝素的制备技术及临床应用进展》文中研究指明低分子肝素是一类由普通肝素经物理、化学或酶解聚反应而得到的分子量较低的肝素总称,较肝素有更优的抗血栓活性,且出血等副作用少,半衰期长,生物利用度高,是一类很有价值的抗凝血药物。本文对低分子肝素的制备技术及其临床应用进行了介绍和评述,并对低分子肝素的发展前景作了展望。
周斯仪[6]（2019）在《鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价》文中研究表明鱼鳔作为水产品加工副产物之一,富含胶原蛋白、多肽和黏多糖等活性物质,是药食两用的滋补珍品,中医认为其具有补肾益精、散瘀消肿等功效,但其作用效果和功效因子不明。本课题以鱼鳔为原料提取类肝素化合物,并对其进行分离纯化、结构鉴定以及体外抗凝血和抗炎活性评价,以期为进一步阐明鱼鳔糖胺聚糖的结构组成和构效关系提供参考,为鱼鳔功效因子的开发与利用奠定基础。主要研究内容及结果如下:（1）建立并优化鱼鳔类肝素的提取工艺:采用酶法提取类肝素,并在单因素试验基础上,以加酶量、酶解时间和温度为影响因子,以类肝素得率为响应值,采用响应曲面法进行优化。结果表明,最佳提取条件为:2709碱性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解温度50℃,时间20 h,在该条件下类肝素得率为（1.79±0.05）%,与预测值相差3.24%。（2）鱼鳔类肝素的分离纯化与理化性质分析:采用大孔阴离子交换树脂吸附、氯化钠溶液梯度洗脱和乙醇沉淀进行分离纯化,并以氯化钠浓度、pH、温度为影响因子,吸附率为响应值,采用响应曲面法优化静态吸附工艺。结果表明,最佳吸附条件为:氯化钠浓度6.0 mg/mL,pH 8.0,温度45℃;梯度洗脱分离出四个组分,F1、F2、F3和F4,其中F4的得率最高,为（2.22±0.02）%。理化性质分析结果显示从F1到F4,类肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基含量逐渐升高,蛋白质含量递减;醋酸纤维素薄膜电泳结果显示,F1为单一条带,迁移率最低;F2和F3有四个条带;F4为单一条带,迁移率最大。选取得率最高且理化性质与肝素最接近的组分F4进行结构鉴定。（3）鱼鳔类肝素的结构鉴定:通过紫外光谱、高效凝胶色谱、柱前衍生-高效液相色谱、傅里叶红外光谱、酶裂解-质谱/质谱和核磁共振鉴定F4一级结构。结果表明:F4类肝素含量为（85.79±0.63）%;重均分子质量约为115844±1401 u;单糖组成为葡萄糖醛酸、N-乙酰基半乳糖胺和少量的艾杜糖醛酸、半乳糖;且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基轴向伸缩等特征吸收峰。最终确定鱼鳔类肝素主要组成是由重复的二糖单位[→4GlcUAβ1→3Gal NAc（4S）β1→]构成的硫酸软骨素A。（4）不同分子量鱼鳔类肝素抗凝血与抗炎活性评价:为探讨分子量对其抗凝血和抗炎活性的影响,首先采用透明质酸酶对F4进行降解得到两个低分子量类肝素组分:DP1和DP2,其重均分子量分别为6089±33 u和4963±37 u;再通过测定活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和血浆凝血酶时间评价不同分子量的鱼鳔类肝素体外抗凝血活性;采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价其体外抗炎活性。结果表明,与肝素钠相比,鱼鳔类肝素的抗凝血作用较缓和,且分子量越低抗凝血活性越弱;各组分均能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO的过量分泌和ROS水平升高并存在剂量依赖性,且分子量越低效果越显着。进一步分析表明,低分子量的鱼鳔类肝素是通过抑制炎症细胞分泌NO、ROS、IL-6、IL-1β和IL-10等炎症介质来缓解LPS诱导RAW264.7细胞发生的炎症反应。
舒丽霞[7]（2019）在《低分子肝素对肾病综合征大鼠蛋白尿的影响及机制探讨》文中进行了进一步梳理目的:观察低分子量肝素对肾病综合征大鼠蛋白尿的影响,探讨肾小球内皮细胞表面糖萼在LMWH影响NS大鼠蛋白尿生成中的作用。方法:将30只8周龄健康雄性SD大鼠随机平均分为5组:正常对照组（Control）,模型组（Model）,低分子肝素治疗5、7、9天组（Treat1、Treat2、Treat3）。除Control组外,余各组大鼠给予尾静脉注射阿霉素制备NS模型,造模成功后各治疗组于皮下注射LMWH,Treat1、2、3组分别连续注射5、7、9天。给药后收集24h尿液并检测尿蛋白含量;同时用Elisa试剂盒检测肾静脉血浆硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate;HS）、乙酰肝素酶（Heparanase;HPSE）、Syndecan-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和血总胆固醇（Cholesterol total;TC）及血浆白蛋白含量;蛋白免疫印迹法（WB）检测大鼠肾皮质GCX核心蛋白Glypican-1及Syndecan-1含量;取大鼠肾脏组织做HE染色,观察行LMWH治疗后其病理改变;取大鼠肾皮质行透射电镜检查,观察大鼠肾小球内皮细胞表面GCX厚度。结果:LMWH治疗组大鼠血浆HS含量较模型组减少（P<0.05）、HPSE含量较模型组增加（P<0.05）、Syndecan-1较模型组升高,Syndecan-1在给药第9天出现下降趋势（P>0.05）;血浆TNF-α、IL-6含量较模型组明显降低（P<0.05）,但治疗组间比较无明显差异;24小时尿蛋白含量显着下降,血浆白蛋白水平回升,血浆TC含量明显减少;WB检测结果示肾皮质内Glypican-1及Syndecan-1含量较模型组增加;HE染色结果显示LMWH治疗后肾小管内透明管型明显减少。透射电镜检查结果示:模型组大鼠肾小球内皮细胞表面GCX厚度显着低于正常对照组,LMWH治疗各组肾小球内皮表面GCX增厚。结论:LMWH可减少肾小球内皮糖萼的脱落,从而保护内皮糖萼,并有效降低肾病综合征大鼠血清TNF-α及IL-6含量;减少尿蛋白量,促进血浆白蛋白提升,这可能是其对肾病综合征肾脏的保护机制之一。
茅怡铭[8]（2019）在《还原响应型支化聚β-氨基脂siRNA递送载体及其用于急性肺损伤的抗炎治疗研究》文中指出急性肺损伤（acute lung injury,ALI）以及其进展为更危重阶段的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是由肺内部和/或肺外部的各种非心脏原因（如严重感染,创伤,休克,吸入有害气体,病理性产科,中毒等）引起的,以进行性呼吸困难和难治性低氧血症为特征的急性炎症反应综合征,可引起呼吸功能不全,甚至并发严重的呼吸衰竭。我们通常将ALI/ARDS的病因分为两大类:即直接肺损伤因素以及间接肺损伤因素。直接肺损伤因素主要包括:各类肺部感染、胸部或肺部外伤等。间接肺损伤因素主要包括:休克、脓毒血症、全身炎症反应综合征、弥漫性血管内凝血等。肺部失控的炎症反应和/或全身失控的炎症反应是ALI/ARDS的最主要的发病机制。参与ALI/ARDS炎症反应的细胞因子主要包括:白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-12（IL-12）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）,它们亦被称为促炎细胞因子（pro-inflammatory cytokines,PIC）;参与炎症反应的细胞主要有:多形核白细胞（PMN）、巨噬细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等。RNA干扰（RNAi）是指由与靶基因序列具有同源性的双链RNA分子（dsRNA）诱导同源mRNA发生高效且特异性的降解,从而引起基因静默的现象。介导RNA干扰的分子主要包括以下几种:siRNA、微小RNA（microRNA,miRNA,miR）和shRNA等。目前主要依靠两套载体系统以介导RNA干扰分子的导入,即病毒载体及非病毒载体。非病毒载体,尤其是纳米材料级载体,越来越受到国内外研究者的关注。RNA干扰技术作为一种高效的基因沉默技术,是本世纪重大的科技进展之一,近十余年来已在基础生物医学研究领域中得到了广泛应用和快速发展,为许多疾病的治疗提供了新的手段和希望。通过RNA干扰技术选择性沉默肺泡巨噬细胞内相关炎症因子的表达可有效抑制炎症反应,进而达到治疗急性肺损伤的目的。因此我们将肺泡巨噬细胞内的TNF-α mRNA作为RNA干扰的靶点,用于急性肺损伤的抗炎治疗。已开发的大多数阳离子聚合物纳米材料载体由于其不能在体内降解而具有一定的细胞毒性;较高的表面电势往往也会导致这些材料载体被快速清除出体外。针对这些问题,本论文设计了一种还原响应型的非线性阳离子载体材料（BP-S）,在降低载体材料的细胞毒性同时,实现siRNA的可控性释放。此外,我们在纳米复合物的表面包载羧基功能化甘露聚糖（Man-COOH）,从而降低复合物的表面电势,提高复合物的体内循环时间;同时外包的羧基功能化甘露聚糖（Man-COOH）能特异性识别巨噬细胞表面的甘露糖受体,从而增强巨噬细胞对复合物的摄取,提高复合物的转染效率以有利于对急性肺损伤的治疗。第一部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α的制备及表征目的:合成聚合物BP-S、BP-C、LP,纳米复合物BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA、M/BP-S/siRNA,并对它们进行表征。方法:首先合成2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（SSDA）,然后通过A2+B3+C2迈克尔加成聚合的方法分别成功合成了新型还原可降解的支化聚β-氨基酯BP-S、不敏感的BP聚合物BP-C以及线性聚合物LP。将各聚合物与siRNA混合分别形成纳米复合物BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA。将羧基功能化的甘露聚糖（Man-COOH）与BP-S/siRNA复合物混合最终合成纳米复合物M/BP-S/siRNA。使用400 MR核磁共振氢谱（1H NMR）对2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（SSDA）和BP-S进行表征。使用凝胶渗透色谱法（GPC）、动态光散射（DLS）、琼脂糖凝胶电泳实验、肝素钠置换实验对各聚合物和纳米复合物进行表征。结果:通过400 MR核磁共振氢谱（1H NMR）对2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（SSDA）的表征,我们证明含有二硫键的还原敏感单体合成成功。通过凝胶渗透色谱法（GPC）对各聚合物进行表征,我们证明了BP-S、BP-C以及LP等三种聚合物的分子量之间的差异并不显着。通过400 MR核磁共振氢谱（1H NMR）表征BP-S的结构证明了BP-S的高度支化结构,通过凝胶渗透色谱法（GPC）证明了BP-S的还原敏感性。使用动态光散射（DLS）表征二元纳米复合物BP-S/siRNA和三元纳米复合物M/BP-S/siRNA的粒径和表面电荷,证明了这种结构更有利于细胞对它们的摄取。通过动态光散射（DLS）、琼脂糖凝胶电泳实验、肝素钠置换实验,我们证明了BP-S/siRNA复合物可以高效缩合siRNA且具有还原敏感性。最后,我们在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中对纳米复合物的粒径进行了监测,证明了M/BP-S/siRNA具有良好的血清稳定性。结论:二元纳米复合物BP-S/siRNA可以高效缩合siRNA且具有还原敏感性,更有利于siRNA的可控性释放。三元纳米复合物M/BP-S/siRNA相比二元纳米复合物BP-S/siRNA具有更好的血清稳定性。第二部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-αα的细胞学研究目的:对纳米复合物 BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA 以及 M/BP-S/siRNA进行一系列的细胞学研究,以验证各种纳米复合物的细胞内动力学、细胞毒性以及体外基因沉默效率等特点。方法:使用流式细胞技术针对小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）摄取各纳米复合物做定量检测。使用流式细胞技术针对加用甘露聚糖后的小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）对M/BP-S/FAM-siRNA、BP-S/FAM-siRNA的摄取做定量检测。同时使用人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5 cells）作为对照组细胞进行相关的定量检测。使用共聚焦显微技术研究各纳米复合物的内涵体逃逸情况和各纳米复合物的siRNA的胞内释放情况。使用MTT法研究各纳米复合物在小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）中的细胞毒性。使用酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）外的TNF-α蛋白的表达水平。使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）测定小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）内的TNF-αmRNA的表达水平。结果:流式细胞技术的结果提示:小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）对M/BP-S/FAM-siRNA、BP-S/FAM-siRNA、BP-C/FAM-siRNA等的摄取水平均较高（以三元纳米复合物M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平最佳）,明显优于商业转染材料PEI/FAM-siRNA和LP/FAM-siRNA。在甘露聚糖存在的情况下,小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7 cells）对M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平明显下降,而BP-S/FAM-siRNA的摄取水平几乎未发生明显变化。人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5 cells）对M/BP-S/FAM-siRNA与BP-S/FAM-siRNA的摄取水平相差不大。的甘露聚糖存在的情况下,人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5 cells）对M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平和BP-S/FAM-siRNA的摄取水平几乎未发生明显变化。共聚焦显微技术的结果提示:相比于二元纳米复合物BP-S/FAM-siRNA,三元纳米复合物M/BP-S/FAM-siRNA更能有效逃逸内涵体。相比于BP-C,BP-S更能实现siRNA的胞内释放。MTT法的结果提示:就纳米材料本身的细胞毒性而言,聚合物BP-S以及聚合物LP的细胞毒性小于聚合物BP-C;聚合物BP-S、聚合物BP-C以及聚合物LP的细胞毒性均明显小于商业转染材料PEI。随着各聚合物/siRNA质量比的逐渐增大,各纳米复合物的细胞毒性也逐渐变大。各纳米复合物中以M/BP-S/siRNA的细胞毒性最小,LP/siRNA及BP-S/siRNA的细胞毒性较小,BP-C/siRNA的细胞毒性较大,PEI/siRNA的细胞毒性最大。酶联免疫吸附实验（ELISA）的结果提示:随着聚合物BP-S/siTNF-α质量比的不断增加,BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力逐渐增加。当聚合物BP-S/siTNF-α质量比为30时,其抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳。Man-COOH与BP-S/siRNA质量比在0.3时,其抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳。在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳,明显优于纳米复合物BP-S/siTNF-α以及纳米复合物BP-C/siTNF-α。纳米复合物BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力排第二,明显优于纳米复合物BP-C/siTNF-α以及纳米复合物LP/siTNF-α。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的结果提示:在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α降低细胞内TNF-α mRNA表达水平的能力最好,显着优于纳米复合物BP-S/siTNF-α以及纳米复合物BP-C/siTNF-α。纳米复合物BP-S/siTNF-α降低细胞内TNF-α mRNA表达水平的能力排第二,明显优于纳米复合物BP-C/siTNF-α以及纳米复合物LP/siTNF-α。结论:三元纳米复合物M/BP-S/siRNA相比于其他二元纳米复合物（BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA）具有细胞摄取率高、能有效逃逸内涵体、更容易实现siRNA的胞内释放、细胞毒性小、基因沉默效率高等优势。第三部分 小鼠急性肺损伤模型的制备目的:通过气管滴注LPS以建立小鼠急性肺损伤模型,为后续实验的开展打下坚实的基础。方法:选取健康雄性6～8周龄的BALB/c小鼠共8只,体重均在18-20 g范围之内,将所有小鼠随机分为2组,分别为LPS组和正常组,每组各4只。LPS组小鼠使用气管内滴注LPS溶液（2.5 mg/kg）诱导急性肺损伤。正常组小鼠气管内滴注等容量的0.9%无菌生理盐水。造模24小时后处死小鼠并收集小鼠的肺组织。评估两组小鼠的肺组织病理情况,酶联免疫吸附实验（ELISA）测定肺组织中TNF-α的表达水平,实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）测定肺组织中TNF-a mRNA的表达水平。结果:小鼠的肺组织病理情况结果提示:正常组小鼠的肺组织形态基本正常,而LPS组小鼠的肺组织可见明显的病变改变。LPS组小鼠肺组织病理评分明显高于正常组,其差异有统计学意义（p<0.05）。酶联免疫吸附实验（ELISA）的结果提示:LPS组小鼠肺组织中TNF-α的表达水平明显高于正常组。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的结果提示:LPS组小鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达水平明显高于正常组。结论:LPS能显着诱导小鼠产生急性肺损伤,动物模型建模成功,这为我们后续实验的开展奠定了坚实的基础。第四部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与机制的研究目的:利用各种纳米复合物治疗小鼠的急性肺损伤并研究各种纳米复合物的体内抗炎效率和生物安全性。方法:选取健康雄性6～8周龄的BALB/c小鼠共24只,体重均在18-20g范围之内。将所有小鼠随机分为6组,分别为正常组、LPS组、M/BP-S/siNC组、PEI/siTNF-α组、BP-S/siTNF-α组以及M/BP-S/siTNF-α组,每组各4只。LPS组小鼠使用气管内滴注LPS溶液（2.5 mg/kg）诱导急性肺损伤。正常组小鼠气管内滴注等容量的0.9%无菌生理盐水。M/BP-S/siNC 组、PEI/siTNF-α组、BP-S/siTNF-α 组以及M/BP-S/siTNF-α组小鼠分别在LPS诱导2小时后于气管内滴注相应的纳米复合物（均为500μg siRNA/kg）溶液。造模24小时后处死小鼠,收集小鼠的心肝脾肺肾等组织,收集小鼠支气管肺泡灌洗液,收集小鼠动脉血和静脉血。纳米复合物的体内抗炎效率研究包括:使用酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫荧光法分析评估小鼠肺组织中的TNF-α和IL-6的表达水平。使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）测定小鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达水平。使用比色法测定小鼠肺组织中髓过氧化物酶（MPO）表达水平。使用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α和IL-6的表达水平。使用BCA蛋白定量分析测定小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白质的表达水平。对小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞计数进行测定。评估各组小鼠的肺组织病理情况。小鼠血气分析的测定。纳米复合物的生物安全性研究包括:小鼠血常规及血生化检测,小鼠各器官（心、肝、脾、肺、肾）的病理学评估。结果:酶联免疫吸附实验（ELISA）的结果显示:在小鼠肺组织中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6表达的能力最佳,其次是纳米复合物BP-S/siTNF-α,再次是商业转染材料PEI/siTNF-α。M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6表达的能力明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义（p<0.05）。免疫荧光染色的结果显示:在小鼠急性肺损伤模型中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α能最有效的沉默TNF-α mRNA并降低TNF-α以及IL-6的表达水平。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的结果显示:在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α降低小鼠肺组织中TNF-α mRNA表达水平的能力最佳,明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义（p<0.05）。BP-S/siTNF-α降低小鼠肺组织中TNF-α mRNA表达水平的能力排在第二,明显优于商业转染材料PEI/siTNF-α。肺组织中髓过氧化物酶（MPO）的测定结果显示:小鼠气管内滴注三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α后,小鼠肺组织中MPO的表达水平显着降低,明显低于BP-S/siTNF-α组和商业转染材料PEI/siTNF-α组,其差异有统计学意义（p<0.05）。酶联免疫吸附实验（ELISA）的结果显示:在小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6蛋白表达水平的能力最佳,其次是二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,再次是商业转染材料PEI/siTNF-α。M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6蛋白表达水平的能力明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义（p<0.05）。小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白质表达水平测定和细胞计数测定的结果显示:经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白质的表达水平和细胞总数均大幅下降,且明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α和商业转染材料PEI/siTNF-α给药的效果,其差异有统计学意义（p<0.05）。小鼠肺组织的病理学评估结果显示:经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠的肺部炎症反应明显缓解,小鼠肺组织的破坏程度明显减轻。而BP-S/siTNF-α组和PEI/siTNF-α组小鼠的肺组织中仍然可以见到比较明显的病理改变。三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α组小鼠肺组织的病理评分与正常组之间的差异不明显,但明显小于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α组和商业转染材料PEI/siTNF-α组,其差异有统计学意义（p<0.05）。小鼠血气分析的结果显示经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠的动脉血氧分压（Pa02）明显上升,二氧化碳分压（PaC02）显着下降,pH逐渐接近至正常组的pH水平,其治疗效果明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α和商业转染材料PEI/siTNF-α,差异具有统计学意义（P<0.05）。小鼠血常规及血生化的结果显示:三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α组小鼠的血常规检测结果及血生化检测结果与正常组的相比差异不显着;而商业转染材料PEI/siTNF-α组小鼠血常规及血生化检测中的某些指标与正常组的相比差异明显。小鼠各器官（心、肝、脾、肺、肾）的病理学评估的结果显示:M/BP-S/siTNF-α组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织的形态结构与正常组的相比未见明显差异。结论:M/BP-S/siTNF-α可以在小鼠肺组织中介导高效的TNF-α mRNA沉默以有效缓解炎症症状,有利于小鼠急性肺损伤的抗炎治疗,同时M/BP-S/siTNF-α还有具有生物安全性高,无组织器官毒性等优点。
姚小兰[9]（2019）在《蚂蟥水提物调控Sirtuin 1抑制炎症干预深静脉血栓形成》文中指出目的:本课题组前期研究发现蚂蟥水提取物（AEW）显着抑制深静脉血栓（DVT）形成。因此,本课题进一步从凝血系统、纤溶系统、血小板活性、全血粘度及Sirtuin 1（SIRT1）调节的炎症反应探讨AEW干预DVT形成的作用机制。方法:（1）AEW对DVT形成的影响时效关系考察:大鼠按体重随机分为假手术组、模型组和AEW（104.2 mg生药/kg/d）组。建立狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠灌胃给予双蒸水。给药方式1:AEW组大鼠术后1h和24h灌胃给予药物;给药方式2:AEW组大鼠术后1h、24 h、2d和3d灌胃给予药物;给药方式3:AEW组大鼠造模后第3d开始灌胃给药,连续给药5 d,每天一次。检测栓重、HE染色进行组织病理学观察。量效关系考察:动物按体重随机分为假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组（34.7、104.2、312.5 mg 生药/kg/d）、肝素组（200 U/kg/d）、氯吡格雷组（25 mg/kg/d）。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予相应剂量AEW;肝素钠组大鼠于术后1h和24 h尾静脉注射肝素钠;氯吡格雷组大鼠于术前2 h和术后24 h灌胃给予氯吡格雷。肉眼观察血栓形态变化并称重。（2）从凝血系统、纤溶系统、血细胞数量、血小板活性及全血粘度探讨AEW干预DVT形成的作用机制动物按体重随机分为假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组（34.7、104.2、312.5 mg 生药/kg/d）、肝素组（200 U/kg/d）、氯吡格雷组（25 mg/kg/d）。建立狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予相应剂量AEW;肝素钠组大鼠于术后1 h和24 h尾静脉注射给予肝素钠;氯吡格雷组大鼠于术前2 h和术后24 h灌胃给予氯吡格雷。称量栓重,检测凝血四项、血常规、全血粘度和血小板聚集率。（3）AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVT的分子机制①SIRT1下调促进炎症反应进而诱导DVT形成I.SIRT1及炎症对DVT形成的影响动物按体重随机分为15组,包括正常组,假手术0.5 h、1 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组,造模0.5 h、1h、1d、3d、5 d、7 d、14 d组。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,于各时间点动物麻醉后颈总动脉采血,分离血栓（含静脉壁）并称重;HE染色进行组织病理学观察及炎性细胞计数;免疫组织化学法检测组织因子（TF）在血栓及静脉壁中的表达;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-1β（IL-1β）含量;Western blot法检测血栓（包含静脉壁）中SIRT1、磷酸化p65（p-p65）、乙酰化p65（Ace-p65）及p65的表达。II.SIRT1激动剂白藜芦醇（RES）对DVT形成的影响动物按体重随机分为5组,包括假手术组、模型组、RES低、中、高剂量（25、50、75 mg/kg/d）组。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;RES组大鼠于术前1 h和术后24 h灌胃给予相应剂量RES。分离血栓（含静脉壁）并称重;HE染色观察血栓（包含静脉壁）病理变化并进行炎性细胞计数;ELISA法检测大鼠血清IL-1β与TNF-α水平;免疫荧光法检测血栓及静脉壁SIRT1蛋白表达;Western blot法检测血栓及静脉壁SIRT1、TF、Ace-p65及p65蛋白表达;qRT-PCR检测血栓及静脉壁SIRT1 mRNA 表达。Ⅲ.SIRT1选择性抑制剂EX527对DVT形成的影响动物按体重随机分为8组,包括正常组、假手术组、假手术+RES（50 mg/kg）组、假手术+EX527（10 mg/kg）组、模型组、模型+RES（50 mg/kg）、模型+RES（50 mg/kg）+EX527（10mg/kg）、模型+EX527 组（10mg/kg）。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉DVT模型,正常组、假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;RES于术前1h和术后24 h灌胃给予;EX527于术前20 min腹腔注射给予。造模25 h后处死动物,肉眼观察血栓形态并称重;Western blot法检测血栓及静脉壁SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。②AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVTⅠ.AEW对SIRT1/NF-κB通路相关蛋白的影响动物按体重随机分为5组,包括假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组（34.7 mg、104.2、312.5 mg生药/kg/d,p.o）。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1h和24h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1h和24 h灌胃给予相应剂量AEW。术后25 h,颈总动脉采血,称量栓重,HE染色进行组织病理学观察及炎性细胞计数;检测血清TNF-α及IL-1β水平;免疫荧光法检测血栓（含静脉壁）SIRT1蛋白表达;Western blot法检测血栓（含静脉壁）SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。Ⅱ.联用SIRT1抑制剂明确AEW调控SIRT1干预DVT形成动物按体重随机分为正常组,假手术组,模型组,模型+EX527（10mg/kg）组,AEW组（104.2 mg生药/kg/d）,模型+AEW（104.2 mg生药/kg/d）+EX527（10 mg/kg）组。狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW于术后1h和24 h灌胃给予;EX527于术前20 min腹腔注射给予。术后25 h,处死动物,肉眼观察血栓形态并称重;Western blot法检测血栓（含静脉壁）SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。结果:（1）AEW对DVT形成的影响在三种给药方式下,AEW均能显着抑制DVT形成,抑制血栓炎性细胞浸润及静脉壁炎性细胞渗出。中、高剂量AEW均能抑制血栓形成。（2）从凝血系统、纤溶系统、血细胞数量、血小板活性及全血粘度探讨AEW干预DVT形成的作用机制肝素显着增加DVT大鼠血浆APTT、PT及TT值;氯吡格雷显着降低DVT大鼠血小板聚集率。AEW对凝血四项、血浆tPA及PAI-1水平、血细胞的数量、二磷酸腺苷诱导的血小板聚集率和全血粘度无影响。（3）AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVT的分子机制①SIRT1下调促进炎症反应进而诱导DVT形成I.SIRT1及炎症对DVT形成的影响各时间点假手术组大鼠的血管形态与重量同正常组大鼠的无差异。造模0.5 h无血栓形成;造模1h在结扎处下端可见红色血丝;造模1d血栓较松软,呈暗红色;随着造模时间的延长,血栓逐渐机化再通。栓重呈先升后降的趋势,在1d和3d达到最大值。组织病理学结果显示,各时间点假手术组大鼠的血管壁炎性细胞渗出和静脉腔炎性细胞浸润的情况同正常组大鼠的无差异。静脉壁中性粒细胞于造模1 h及1 d时达到最大值,血栓中性粒细胞于造模1 d达到峰值;静脉壁单核细胞渗出及血栓单核细胞浸润随造模时间呈先增加后降低的趋势,均于造模5 d达到峰值。正常组及造模0.5 h组大鼠血管无TF表达;在造模1h至14 d时,TF大量表达在中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞上及新生血管处。造模1d时大鼠血清IL-1β及TNF-α水平显着增加。同正常组相比,静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达于造模1 d时降低75.4%,而p-p65及Ace-p65的蛋白表达分别增加185.4%和92.4%。SIRT1和Ace-p65蛋白表达于造模3-14 d时趋于正常水平,p-p65蛋白表达于造模14 d趋于正常水平。Ⅱ.SIRT1激动剂RES对DVT形成的影响RES显着降低栓重、血栓炎性细胞浸润及静脉壁炎性细胞渗出,下调血清IL-1β及TNF-α至正常水平,增加大鼠血栓及静脉壁SIRT1蛋白及mRNA表达,降低Ace-p65及TF蛋白表达。Ⅲ.SIRT1抑制剂EX527对DVT形成的影响假手术组大鼠的栓重、SIRT1、Ace-p65及p-p65蛋白表达同正常组大鼠无显着差异。RES和EX527对假手术组大鼠无影响。单独使用EX527对下腔静脉狭窄大鼠的血栓形成及各指标无影响;但同模型+RES组大鼠相比,模型+RES+EX527组大鼠的栓重、Ace-p65及p-p65蛋白表达均显着升高,静脉壁及血栓组织SIRT1蛋白表达显着降低。②AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVTⅠ.AEW对SIRT1/NF-κB通路相关蛋白的影响:同模型组大鼠相比,AEW组大鼠静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达显着增加,血栓炎性细胞渗出及静脉壁炎性细胞浸润、血清IL-1β及TNF-α水平、静脉壁及血栓p-p65及Ace-p65蛋白表达均显着降低。Ⅱ.联用SIRT1抑制剂明确AEW调控SIRT1干预DVT形成:同AEW剂量组大鼠相比,AEW+EX527组大鼠的栓重、静脉壁及血栓Ace-p65蛋白表达均显着增加、静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达显着降低。结论:AEW具有显着防治DVT的作用,但不影响体循环的凝血系统、纤溶系统、血小板活性及全血粘度。SIRT1去乙酰化修饰NF-κB调节炎症反应,干预大鼠下腔静脉血栓形成。AEW可通过调控SIRT1抑制炎症反应来抑制DVT形成。
刘一娜[10]（2019）在《普通肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤及紧密连接的保护作用及机制研究》文中认为研究背景及目的脓毒症（sepsis）是感染引起的全身炎症反应,能导致脏器功能障碍。急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理生理机制是肺泡上皮屏障功能破坏、肺毛细血管内皮细胞损伤,导致非心源性肺水肿。脓毒症ALI可见血浆、肺组织细胞因子升高,血管及肺泡内纤维蛋白沉积,肺毛细血管液体渗漏增加。紧密连接蛋白是维持细胞旁物质选择性通过、增强细胞屏障功能的重要成分。体外实验发现紧密连接蛋白claudins、occludin、ZO-1的表达受到炎症因子、生长因子、凝血酶等外界刺激的影响,发生表达下调或向胞浆内移位,导致紧密连接功能异常或结构破坏。肝素类药物不仅能发挥抗凝作用,还能与炎症因子、趋化因子、补体相互作用,参与机体免疫反应,产生抗炎作用。脓毒症、感染性休克、脓毒症DIC病人应用肝素治疗能降低死亡率。用普通肝素或低分子肝素处理内毒素血症小鼠或大鼠,能减轻炎症反应及器官损伤,提高生存率。目前关于紧密连接维护细胞屏障功能的研究主要涉及神经系统肿瘤及感染、消化道肿瘤及炎症、呼吸系统炎症、糖尿病视网膜病变,而脓毒症导致的急性肺损伤是否有紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的参与,以及普通肝素是否通过保护紧密连接而治疗脓毒症ALI,目前尚不清楚。本研究通过盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠ALI模型,观察紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1是否存在表达异常,探讨普通肝素是否通过保护紧密连接蛋白减轻ALI肺水肿表现。在体外建立人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）单层,研究普通肝素能否通过保护紧密连接减轻脂多糖诱导的HLMVECs渗漏现象,初步探讨普通肝素的这一作用机制是否有ERK1/2 MAPK的参与。研究方法一、动物模型制备及分组45只雄性Wistar大鼠,随机分成3组,对照组（n=15）,脓毒症组（n=15）,脓毒症肝素治疗组（n=15）。对照组进行假手术,脓毒症组、脓毒症肝素治疗组行盲肠结扎穿孔术。脓毒症肝素治疗组在术前30分钟皮下注射普通肝素1000U/kg,术后12小时追加同样剂量普通肝素一次。对照组、脓毒症组在相同时间点皮下注射与脓毒症肝素组等体积的生理盐水。另取33只大鼠观察生存率,每12小时记录一次生存情况直至96小时。二、标本收集及处理大鼠麻醉后,行单侧支气管肺泡灌洗,回收灌洗液,离心吸取上清,分装后-80℃保存,用于ELISA检测。取左肺组织测湿干重比。切取少许右肺下叶组织块,2.5%戊二醛固定,用于透射电镜观察。余右肺下叶以4%多聚甲醛固定,用于石蜡切片、HE染色、免疫组织化学染色。右肺中叶以液氮速冻后,再-80℃保存,用于western blot检测。为评价肺微血管液体渗漏情况,予大鼠静脉注射1%伊文氏蓝溶液,1小时后处死,生理盐水灌洗肺血管后,取左肺并以超声破碎。三、细胞培养方法人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）购自上海拜力生物科技有限公司。用DMEM高糖培养基（含1%青链霉素）+10%胎牛血清,于细胞培养箱37℃、5%CO2条件下培养,每2天换液1次,培养3-4天处于对数生长期,且达到80-90%融合,可进行后续实验。用PBS、LPS、普通肝素、ERK抑制剂（U0126）分组处理细胞后进行检测。四、实验方法1.动物水平（1）HE染色观察肺组织病理表现。（2）ELISA检测BALF中IL-6含量,评估肺组织炎症反应。（3）测肺湿干重比评估肺水肿情况。（4）测定肺组织伊文氏蓝含量,评价肺微血管渗漏。（5）透射电镜观察肺气血屏障。（6）Western blot检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。（7）免疫组织化学观察肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。2.细胞水平（1）跨内皮细胞电阻测定。（2）测定HLMVECs对FITC-dextran的通透系数Pd。（3）透射电镜观察HLMVECs紧密连接超微结构。（4）ELISA检测HLMVECs上清中IL-6含量（5）Western blot检测HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。（6）Western blot检测HLMVECs p-ERK1/2、ERK1/2的表达。五、统计学分析用SPSS18.0统计软件处理数据,计量资料用`X±s表示。使用单因素方差分析（ANOVA）进行各组间比较,再用LSD法进行两两组间比较,p<0.05认为具有统计学差异。结果一、普通肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤及紧密连接的影响1.动物模型的观察对照组术后饮食、精神状态、活动及反应良好,被毛较光滑。脓毒症组出现明显精神萎靡、反应迟缓,饮食、活动减少,呼吸频率增加,排粘液便,被毛竖起。脓毒症肝素治疗组术后较对照组略萎靡,饮食、活动及反应变慢,被毛不平滑,呼吸频率稍快,但精神、反应及活动状态好于脓毒症组。脓毒症组96小时生存率最低,脓毒症肝素治疗组生存率高于脓毒症组,对照组无动物死亡。2.肺组织病理学表现对照组肺泡开放,肺泡壁、肺泡隔形态清晰。脓毒症组肺泡部分塌陷或膨胀不良,肺泡壁及肺泡隔明显增宽,肺泡隔充血肿胀,内有大量炎症细胞浸润。脓毒症肝素治疗组肺泡隔肿胀增宽程度低于脓毒症组,炎症细胞浸润减少。3.支气管肺泡灌洗液中IL-6含量脓毒症组IL-6较对照组显着增加（27.76±4.10 vs.2.25±0.24,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组IL-6明显低于脓毒症组（12.50±1.65 vs.27.76±4.10,p<0.0001）,仍高于对照组（12.50±1.65 vs.2.25±0.24,p<0.0001）。4.肺湿干重比脓毒症组肺湿重增加,明显高于对照组（8.906±1.598 vs.4.319±0.100,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组湿重低于脓毒症组（5.389±0.444 vs.8.906±1.598,p<0.0001）,但仍高于对照组（5.389±0.444 vs.4.319±0.100,p<0.0001）。5.肺组织伊文氏蓝含量脓毒症组伊文氏蓝含量明显高于对照组（44.81±5.10 vs.11.29±2.82,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组低于脓毒症组（24.94±5.90 vs.44.81±5.10,p<0.0001）,但仍高于对照组（24.94±5.90 vs.11.29±2.82,p<0.0001）。6.肺组织气血屏障超微结构观察对照组大鼠气血屏障结构完整,肺泡上皮、毛细血管内皮细胞无肿胀或溶解破坏。脓毒症组肺泡上皮可见溶解破坏、边界不清晰,血管内皮细胞肿胀。脓毒症肝素治疗组肺泡上皮损伤及血管内皮细胞肿胀轻于脓毒症组。7.Western blot检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1表达脓毒症组claudin-5、occludin、ZO-1的表达明显均低于对照组,脓毒症肝素治疗组claudin-5、occludin、ZO-1表达较脓毒症组升高,但低于对照组,差异具有统计学意义（p<0.05）8.免疫组织化学检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达对照组claudin-5主要表达于肺泡隔毛细血管内皮细胞膜及胞浆边缘,occludin、ZO-1表达于肺泡上皮、肺泡隔毛细血管内皮细胞,其中occludin位于细胞膜及胞浆边缘,ZO-1位于靠近细胞膜的胞浆内,三者呈连续、波浪线状分布。脓毒症组claudin-5、occludin、ZO-1在肺组织表达均降低,分布失去连续性,仅有少量散在点、片状浅棕色染色。脓毒症肝素治疗组claudin-5、occludin、ZO-1表达高于脓毒症组,血管内皮或上皮细胞仍有部分呈连续、波浪状分布,阳性染色强于脓毒症组。二、普通肝素、U0126对HLMVECs FITC-dextran渗漏、紧密连接和ERK1/2 MAPK信号通路的作用1.LPS导致HLMVECs TEER降低LPS能导致HLMVECs TEER较基线降低,且随LPS作用时间的延长,下降更明显。LPS作用24小时,LPS5μg/ml组TEER低于对照组,但无明显差异（p>0.05）,LPS10、20、50、100μg/ml组TEER均明显低于对照组（p<0.05）。2.LPS导致HLMVECs紧密连接蛋白表达降低LPS5μg/ml能导致HLMVECs紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达明显降低（p<0.05）,但对claudin-5作用不明显（p>0.05）。LPS10、20、50μg/ml均能导致claudin-5、occludin、ZO-1表达明显降低（p<0.05）。3.普通肝素、U0126减轻LPS诱导的FITC-dextran渗漏LPS（10μg/ml）组对FITC-dextran的通透系数Pd值明显高于对照组（21.08±1.27 vs.10.89±1.87,p<0.0001）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组Pd值明显低于LPS（10μg/ml）组（14.22±2.24 vs.21.08±1.27,p<0.005）。LPS（10μg/ml）+U0126（25μM）组Pd值也明显低于LPS（10μg/ml）组（12.84±0.57 vs.21.08±1.27,p<0.005）。4.普通肝素减轻LPS导致的HLMVECs紧密连接超微结构损伤对照组内皮细胞间存在致密的、细线状紧密连接。LPS（10μg/ml）组内皮细胞胞浆与细胞膜交界处有大量空泡形成,细胞之间缝隙增大,紧密连接开放、断裂,结构不完整。LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组内皮细胞之间紧密连接结构未断裂,能封闭细胞间隙。5.普通肝素抑制LPS诱导的内皮细胞IL-6释放LPS（10μg/ml）组细胞上清中IL-6水平明显高于对照组（p<0.0001）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组IL-6水平显着低于LPS（10μg/ml）组（p<0.0001）。6.普通肝素减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白低表达LPS（10μg/ml）组claudin-5、occludin、ZO-1表达明显低于对照组（p<0.005）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组与LPS（10μg/ml）组比较,claudin-5、occludin、ZO-1的表达均有升高（p<0.05）。7.普通肝素抑制LPS诱导的HLMVECs ERK 1/2 MAPK磷酸化LPS10μg/ml能诱导HLMVECs p-ERK1/2 MAPK表达明显升高（p<0.0001）,用肝素10U/ml预处理能降低LPS导致的p-ERK1/2 MAPK高表达（p<0.05）。8.U0126减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1低表达LPS（10μg/ml）组claudin-5、occludin、ZO-1表达明显低于对照组（p<0.05）,LPS（10μg/ml）+U0126（25μM）组claudin-5、occludin、ZO-1的表达均较LPS（10μg/ml）组升高（p<0.05）结论1.普通肝素可能通过减轻肺组织炎症反应、上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达,减轻盲肠结扎穿孔术诱导的大鼠脓毒症急性肺损伤。2.普通肝素减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接超微结构破坏,减轻HLMVECs渗漏。3.普通肝素减轻HLMVECs渗漏可能与抑制LPS诱导的ERK1/2 MAPK活化、上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达有关。
二、低分子肝素钠凝胶的抗炎作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、低分子肝素钠凝胶的抗炎作用（论文提纲范文）
（1）外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 本章引论 |
| 1.2 肝素/硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.1 肝素/硫酸乙酰肝素的发现及结构研究 |
| 1.2.2 肝素/硫酸乙酰肝素的生物学功能 |
| 1.2.3 肝素/硫酸乙酰肝素的应用 |
| 1.3 肝素/硫酸乙酰肝素降解酶 |
| 1.3.1 肝素酶Ⅰ(Hepase Ⅰ) |
| 1.3.2 肝素酶Ⅱ(Hepase Ⅱ) |
| 1.3.3 肝素酶Ⅲ(Hepase Ⅲ) |
| 1.3.4 其它Hepases |
| 1.3.5 HP/HS降解酶的应用 |
| 1.4 选题意义 |
| 第二章 PL15_2家族肝素酶的序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基及试剂配置 |
| 3.3.2 基因组提取 |
| 3.3.3 BIexoHep表达载体的构建 |
| 3.3.4 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PL15_2亚家族肝素酶的活性鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 底物HP-F_(αⅢ)制备 |
| 4.3.2 PL15_2亚家族肝素酶底物专一性分析 |
| 4.3.3 PL15_2亚家族肝素酶最适反应条件分析 |
| 4.3.4 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的底物专一性分析 |
| 4.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的最适反应条件分析 |
| 4.4.3 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 饱和HP13糖DP13制备 |
| 5.3.2 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP |
| 5.3.3 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP DP13 |
| 5.3.4 PL15_2亚家族肝素酶降解2-AB标记的HP DP13 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式分析 |
| 5.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的降解方向分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 外切型肝素酶的底物结构选择性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 HP UDP4制备 |
| 6.3.2 HP UDP4分离纯化 |
| 6.3.3 HP UDP4各组分序列测定 |
| 6.3.4 BIexoHep降解HP UDP4各组分 |
| 6.3.5 BIexoHep时间梯度降解HP UDP4 |
| 6.3.6 exoHepase降解磺达肝癸钠 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 HP UDP4制备及分离纯化 |
| 6.4.2 HP UDP4各组分序列鉴定 |
| 6.4.3 BIexoHep底物结构选择性分析 |
| 6.4.4 exoHepase降解磺达肝癸钠分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 BIexoHep的三维结构研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与试剂 |
| 7.2.1 菌株及质粒 |
| 7.2.2 试剂 |
| 7.2.3 仪器 |
| 7.2.4 缓冲液及培养基配置 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.2 SeMet-BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.3 蛋白结晶及条件优化 |
| 7.3.4 晶体数据采集及结构解析 |
| 7.3.5 BIexoHep分子中金属离子的检测 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 BIexoHep晶体与结构解析 |
| 7.4.2 BIexoHep蛋白结构整体分析 |
| 7.4.3 BIexoHep结构与已知结构的比较 |
| 7.4.4 BIexoHep蛋白结构中金属离子的确定 |
| 7.4.5 BIexoHep的“L”型反应通道 |
| 7.4.6 底物结合位点 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 BIexoHep的催化机制研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与试剂 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶与数据采集 |
| 8.3.2 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶结构解析 |
| 8.3.3 突变体的构建 |
| 8.3.4 突变体活性检测 |
| 8.4 结果与分析 |
| 8.4.1 BIexoHep突变体与HP UDP4底物的复合结构 |
| 8.4.2 底物结合位点 |
| 8.4.3 BIexoHep分子改造 |
| 8.4.4 BIexoHep中Ca~(2+)作用 |
| 8.4.5 BIexoHep的外切机制 |
| 8.4.6 BIexoHep的催化机制 |
| 8.5 本章小结 |
| 第九章 BIexoHep的初步应用 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 材料与试剂 |
| 9.2.1 试剂 |
| 9.2.2 仪器 |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.3.2 HP UDP8各组分不完全降解制备非还原端UDP6和UDP4 |
| 9.3.3 HP UDP8各组分及非还原端UDP6和UDP4二糖组成 |
| 9.3.4 HP UDP8各组分非还原端UDP4的还原端二糖组成 |
| 9.3.5 HP UDP8各组分MS及MS/MS鉴定 |
| 9.4 结果与分析 |
| 9.4.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.4.2 HP UDP8各组分序列鉴定 |
| 9.4.3 HP UDP8各组分的MS及MS/MS验证 |
| 9.5 本章小结 |
| 第十章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参与项目 |
| 发表论文及发明专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）消栓饮对创伤性肢体深静脉血栓兔股静脉血管TMmRNA、mEPCRmRNA表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一部分 材料及方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及实验中心 |
| 1.2 实验主要用药 |
| 1.3 主要实验试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物造模 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 实验给药 |
| 2.4 处理方法 |
| 2.5 标本采集 |
| 3 指标观察与检测 |
| 3.1 大体观察 |
| 3.2 荧光定量PCR(real-time PCR)检测TMm RNA、m EPCRm RNA的表达 |
| 3.2.1 RNA 提取 |
| 3.2.2 RNA反转录 |
| 3.2.3 RT-q PCR检测 |
| 3.3 兔股静脉血管病理切片检测 |
| 4 统计学方法 |
| 第二部分 结果 |
| 1 兔的一般情况比较 |
| 2 DVT模型建立 |
| 2.1 肉眼观察各组兔子左侧股静脉形态、颜色 |
| 2.2 兔股静脉病理学切片结果 |
| 3 一般资料比较 |
| 4 各组兔股静脉血管内皮细胞上TMm RNA的表达 |
| 5 各组兔股静脉血管内皮细胞上m EPCRm RNA的表达 |
| 第三部分 讨论及分析 |
| 1 现代医学对DVT的研究与认识 |
| 1.1 深静脉血栓形成与炎症的关系 |
| 1.2 深静脉血栓形成与内皮细胞的关系 |
| 1.3 对内皮细胞蛋白C抗凝系统的认识 |
| 1.4 关于指标TMm RNA、m EPCRm RNA |
| 1.5 现代医学对DVT的治疗 |
| 1.6 低分子肝素的抗炎作用 |
| 2 祖国医学对创伤性肢体深静脉血栓的认识与研究 |
| 3 消栓饮组方及药理学研究分析 |
| 4 消栓饮对内皮细胞TMm RNA、m EPCRm RNA的表达的影响 |
| 5 缺陷与展望 |
| 第四部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 综述 人工关节置换术后深静脉血栓形成防治的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 实验相关图片 |
（3）南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 海洋生物源肝素概述 |
| 1.1.1 海洋生物源肝素的提取 |
| 1.1.2 海洋生物源肝素的分离纯化 |
| 1.1.3 海洋生物源肝素分析测定方法 |
| 1.1.4 海洋生物源肝素的生物活性 |
| 1.2 海洋贝类资源概述 |
| 1.3 抗血栓概述 |
| 1.3.1 血栓形成因素 |
| 1.3.2 抗血栓作用途径 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 研究技术路线 |
| 2 南海8种贝类肝素粗品的提取及抗凝血活性比较 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 贝类肝素粗品的提取 |
| 2.2.2 贝类肝素粗品理化性质分析 |
| 2.2.3 贝类肝素粗品紫外光谱分析 |
| 2.2.4 贝类肝素粗品红外光谱分析 |
| 2.2.5 贝类肝素粗品单糖组成分析 |
| 2.2.6 贝类肝素粗品抗凝血活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 贝类肝素粗品的理化性质分析 |
| 2.3.2 贝类肝素粗品紫外光谱扫描 |
| 2.3.3 贝类肝素粗品红外光谱分析 |
| 2.3.4 贝类肝素粗品单糖组成分析 |
| 2.3.5 贝类肝素粗品抗凝血活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 海蚌、文蛤肝素的分离纯化及理化性质分析 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 海蚌、文蛤肝素的提取与分离 |
| 3.2.2 海蚌、文蛤肝素的理化性质分析 |
| 3.2.3 海蚌、文蛤肝素的紫外光谱扫描 |
| 3.2.4 海蚌、文蛤肝素的醋酸纤维电泳 |
| 3.2.5 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 海蚌、文蛤肝素分离纯化 |
| 3.3.2 海蚌、文蛤肝素理化性质分析 |
| 3.3.3 海蚌、文蛤肝素紫外光谱扫描 |
| 3.3.4 海蚌、文蛤肝素醋酸纤维电泳 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 海蚌、文蛤肝素的结构表征 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 海蚌、文蛤肝素的分子量测定 |
| 4.2.2 海蚌、文蛤肝素的三股螺旋构象分析 |
| 4.2.3 海蚌、文蛤肝素的热稳定性分析 |
| 4.2.4 海蚌、文蛤肝素的官能团分析 |
| 4.2.5 海蚌、文蛤肝素的单糖组成分析 |
| 4.2.6 海蚌、文蛤肝素的二糖组成分析 |
| 4.2.7 海蚌、文蛤肝素的核磁光谱分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 海蚌、文蛤肝素的分子量测定 |
| 4.3.2 海蚌、文蛤肝素的刚果红实验分析 |
| 4.3.3 海蚌、文蛤肝素的热稳定性分析 |
| 4.3.4 海蚌、文蛤肝素的官能团分析 |
| 4.3.5 海蚌、文蛤肝素的单糖组成分析 |
| 4.3.6 海蚌、文蛤肝素的二糖组成分析 |
| 4.3.7 海蚌、文蛤肝素的核磁共振分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 海蚌、文蛤肝素的抗血栓活性分析 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 海蚌、文蛤肝素出血效应分析 |
| 5.2.2 海蚌、文蛤肝素血凝块溶解实验 |
| 5.2.3 海蚌、文蛤肝素抗凝血活性分析 |
| 5.2.4 海蚌、文蛤肝素体外纤溶活性分析 |
| 5.2.5 海蚌、文蛤肝素体内纤溶活性分析 |
| 5.2.6 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 海蚌、文蛤肝素出血效应分析 |
| 5.3.2 海蚌、文蛤肝素血凝块溶解能力分析 |
| 5.3.3. 海蚌、文蛤肝素抗凝血活性分析 |
| 5.3.4 海蚌、文蛤肝素体外纤溶活性分析 |
| 5.3.5 海蚌、文蛤肝素体内纤溶活性分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（4）加减胶艾汤促进胎盘DAF表达抑制aPL诱导补体异常激活介导的胚胎损伤（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.祖国医学对aPL阳性流产的研究 |
| 1.1 传统中医对aPL阳性流产的研究 |
| 1.2 现代中医对aPL阳性流产的研究 |
| 2.现代医学对aPL阳性流产的研究 |
| 2.1 aPL阳性流产之现代病理机制 |
| 2.2 aPL阳性流产之检测及诊断标准 |
| 2.3 aPL阳性流产之西医治疗概况 |
| 3.立题依据 |
| 3.1 拟研究病理机制 |
| 3.2 肾虚血瘀为aPL阳性流产的重要病因病机 |
| 3.3 补肾活血方可有效治疗aPL阳性流产 |
| 3.4 加减胶艾汤可明显改善aPL阳性患者妊娠结局 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1.实验目的 |
| 2.实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验饲料 |
| 2.3 实验用药 |
| 2.4 实验试剂 |
| 2.5 实验主要仪器 |
| 2.6 动物模型建造 |
| 2.7 动物受孕标志 |
| 2.8 实验分组及给药 |
| 2.9 实验检测指标及方法 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 加减胶艾汤对aPL模型小鼠胚胎吸收率的影响 |
| 3.2 加减胶艾汤对胎盘组织炎性损伤、胎盘梗死及中性粒细胞浸润的影响 |
| 3.3 加减胶艾汤对C3在母胎界面沉积的影响 |
| 3.4 加减胶艾汤对母胎界面ILβ-1、IL-8、TNF-α及C3含量的影响 |
| 3.5 加减胶艾汤对母胎界面DAF表达的影响 |
| 3.6 总结 |
| 4.结论 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:综述 |
| 参考文献 |
| 附录2:实验技术路线图 |
| 附录3:硕士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）低分子肝素的制备技术及临床应用进展（论文提纲范文）
| 1 LMWHs制备技术的研究进展 |
| 1.1 物理分离法 |
| 1.2 化学裂解法 |
| 1.2.1 亚硝酸控制降解法 |
| 1.2.2 过氧化氢降解法 |
| 1.2.3 化学β-消除降解法 |
| 1.2.4 臭氧解聚法及光化学解聚法 |
| 1.2.5 其他制备LMWHs的化学降解法 |
| 1.3 合成法 |
| 2 LMWHs在临床上的应用 |
| 2.1 预防和治疗血栓性疾病 |
| 2.2 防治心脑血管疾病 |
| 2.3 LMWHs的抗炎作用 |
| 2.4 在肾脏病中的应用 |
| 2.5 其他应用 |
| 3 展望 |
（6）鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鱼鳔功效因子研究与开发利用进展 |
| 1.1.1 鱼鳔化学成分 |
| 1.1.2 鱼鳔功效因子 |
| 1.1.3 鱼鳔开发利用现状 |
| 1.2 类肝素概况 |
| 1.2.1 类肝素结构与功能 |
| 1.2.2 类肝素提取 |
| 1.2.3 类肝素分离纯化 |
| 1.2.4 类肝素一级结构鉴定方法 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 2 鱼鳔类肝素的提取及工艺优化 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鱼鳔类肝素提取 |
| 2.2.2 蛋白酶的选择 |
| 2.2.3 基本成分测定 |
| 2.2.4 单因素试验设计 |
| 2.2.5 响应曲面设计 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鱼鳔种类的筛选 |
| 2.3.2 蛋白酶的选择 |
| 2.3.3 单因素试验结果 |
| 2.3.4 响应曲面试验结果 |
| 2.4 小结 |
| 3 鱼鳔类肝素的分离纯化 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.0 树脂预处理 |
| 3.2.1 树脂的筛选 |
| 3.2.2 树脂静态吸附鱼鳔类肝素的单因素试验 |
| 3.2.3 树脂静态吸附工艺优化 |
| 3.2.4 树脂动态吸附与洗脱 |
| 3.2.5 理化性质分析 |
| 3.2.6 醋酸纤维薄膜电泳 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 树脂筛选结果 |
| 3.3.2 树脂静态吸附单因素试验结果 |
| 3.3.3 树脂静态吸附工艺优化 |
| 3.3.4 鱼鳔类肝素分离结果 |
| 3.3.5 理化性质分析 |
| 3.3.6 醋酸纤维素薄膜电泳结果 |
| 3.4 小结 |
| 4 鱼鳔类肝素一级结构鉴定 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 紫外光谱分析 |
| 4.2.2 高效凝胶色谱分析 |
| 4.2.3 单糖组成分析 |
| 4.2.4 傅里叶红外光谱分析 |
| 4.2.5 二糖组成分析 |
| 4.2.6 核磁共振分析 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 F4 纯度及分子量 |
| 4.3.2 单糖组成 |
| 4.3.3 红外光谱扫描结果 |
| 4.3.4 二糖组成 |
| 4.3.5 核磁共振鉴定结果 |
| 4.4 小结 |
| 5 鱼鳔类肝素的降解及体外抗凝血和抗炎活性评价 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 酶法降解鱼鳔类肝素单因素试验 |
| 5.2.2 低分子量鱼鳔类肝素的制备 |
| 5.2.3 分子量测定 |
| 5.2.4 硫酸基含量测定 |
| 5.2.5 红外光谱分析 |
| 5.2.6 体外抗凝血活性测定 |
| 5.2.7 鱼鳔类肝素的体外抗炎活性测定 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酶法降解鱼鳔类肝素单因素试验结果 |
| 5.3.2 红外光谱分析结果 |
| 5.3.3 鱼鳔类肝素的体外抗凝血活性 |
| 5.3.4 鱼鳔类肝素的体外抗炎活性 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（7）低分子肝素对肾病综合征大鼠蛋白尿的影响及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 实验技术路线图 |
| 2.2.3 实验动物取材 |
| 2.3 样品检测 |
| 2.3.1 血浆总胆固醇检测 |
| 2.3.2 血浆白蛋白及尿蛋白检测 |
| 2.3.3 ELISA法检测血浆Syndecan-1、HS、TNF-α、IL-6 含量 |
| 2.3.4 组织蛋白提取 |
| 2.3.5 BCA法蛋白定量 |
| 2.3.6 蛋白印迹法(WB)检测Glypican-1、Syndecan-1 含量 |
| 2.3.7 切片制备及HE染色 |
| 2.3.8 透射电镜检测肾小球内皮GCX厚度 |
| 2.3.9 测量糖萼厚度 |
| 2.4 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 LMWH对 NS大鼠蛋白尿的影响 |
| 3.2 LMWH对 NS大鼠血浆总胆固醇及血浆蛋白含量的影响 |
| 3.3 肾组织HE染色 |
| 3.4 透射电镜观察肾小球内皮细胞表面糖萼结果 |
| 3.5 LMWH对 NS大鼠血浆GCX的影响 |
| 3.6 LMWH对 NS大鼠肾皮质GCX核心蛋白Syndecan-1和Glypican-1 含量的影响 |
| 3.7 LMWH对 NS大鼠血浆TNF-α和 IL-6 的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）还原响应型支化聚β-氨基脂siRNA递送载体及其用于急性肺损伤的抗炎治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 炎症 |
| 1.2 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征 |
| 1.3 RNA干扰介导的基因治疗 |
| 1.4 纳米级载RNA系统 |
| 1.5 论文选题依据与研究内容 |
| 第二章 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α的制备及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 原料、试剂与耗材 |
| 2.2.2 实验仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(SSDA)的合成与表征 |
| 2.3.2 各聚合物的合成与表征 |
| 2.3.3 羧基功能化甘露聚糖（Man-COOH)的合成 |
| 2.3.4 各纳米复合物的制备与表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(SSDA)的合成与表征 |
| 2.4.2 各聚合物的合成与表征 |
| 2.4.3 纳米复合物的制备与表征 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α的细胞学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 原料、试剂与耗材 |
| 3.2.2 实验仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 纳米复合物的细胞内动力学研究 |
| 3.3.2 纳米复合物的细胞毒性 |
| 3.3.3 纳米复合物的体外基因沉默效率 |
| 3.4 实验数据统计分析 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 纳米复合物的胞内动力学研究 |
| 3.5.2 纳米复合物的细胞毒性 |
| 3.5.3 纳米复合物的体外基因沉默效率 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 小鼠急性肺损伤模型的制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 原料、试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要实验溶液及配置方法 |
| 4.2.3 小鼠 |
| 4.2.4 实验仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 LPS诱导小鼠急性肺损伤模型的建立 |
| 4.3.2 标本采集 |
| 4.3.3 小鼠肺组织的病理学评估 |
| 4.3.4 小鼠肺组织中TNF-α的表达水平 |
| 4.4 实验数据统计分析 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 小鼠肺组织的病理学评估 |
| 4.5.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)测定肺组织中TNF-α的表达水平 |
| 4.5.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)测定肺组织中 TNF-α mRNA的表达水平 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与机制的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 原料、试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要实验溶液及配置方法 |
| 5.2.3 小鼠 |
| 5.2.4 实验仪器和设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 LPS诱导小鼠急性肺损伤模型的建立 |
| 5.3.2 标本采集 |
| 5.3.3 纳米复合物的体内抗炎效率 |
| 5.3.4 纳米复合物的生物安全性检测 |
| 5.4 实验数据统计分析 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.5.1 纳米复合物的体内抗炎效率 |
| 5.5.2 纳米复合物的生物安全性检测 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征基础及临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 RNA干扰与肺部疾病之间的关系以及纳米材料介导的RNA干扰的研究进展 |
| 参考文献 |
| 主要的中英文缩略词对照 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（9）蚂蟥水提物调控Sirtuin 1抑制炎症干预深静脉血栓形成（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、DVT的病理机制 |
| 二、DVT的防治措施 |
| 三、蚂蟥 |
| 四、小结 |
| 第二章 AEW对DVT形成的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论与小结 |
| 第三章 从凝血系统、纤溶系统绕、血细胞数量、血小板活性及全血粘度探讨AEW干预DVT形成的作用机制 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四章 AEW调控SIRT1抑制炎症防治DVT的分子机制 |
| 第一节 SIRT1下调促进炎症反应进而诱导DVT形成 |
| Ⅰ. SIRT1及炎症对DVT形成的影响 |
| Ⅱ. SIRT1激动剂白藜芦醇对DVT形成的影响 |
| Ⅲ. SIRT1抑制剂EX527对DVT形成的影响 |
| 第二节 AEW调控SIRT1抑制炎症防治DVT的分子机制 |
| Ⅰ. AEW对SIRT1/NF-κB通路相关蛋白的影响 |
| Ⅱ. 联用SIRT1抑制剂明确AEW调控SIRT1干预DVT形成 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 结语 |
| 一、总结 |
| 二、创新点 |
| 三、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 在校期间发表论文和参与科研情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）普通肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤及紧密连接的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:脓毒症大鼠急性肺损伤和紧密连接破坏及普通肝素的治疗作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 实验模型的建立及标本留取 |
| 2.2.3 肺组织HE染色及肺损伤评分 |
| 2.2.4 支气管肺泡灌洗液IL-6含量测定 |
| 2.2.5 肺组织湿干重比测定 |
| 2.2.6 肺组织伊文氏蓝(evan blue dye,EBD)含量测定 |
| 2.2.7 透射电镜观察肺组织超微结构 |
| 2.2.8 Western blot检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1表达 |
| 2.2.9 免疫组织化学检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物模型观察 |
| 3.2 肺组织的病理学表现 |
| 3.3 大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6含量 |
| 3.4 肺湿干重比 |
| 3.5 伊文氏蓝在大鼠肺血管的渗漏 |
| 3.6 肺组织气血屏障超微结构 |
| 3.7 Western blot检测大鼠肺组织claudin-5、occludin、ZO-1表达 |
| 3.8 免疫组织化学染色检测大鼠肺组织claudin-5、occludin、ZO-1的表达 |
| 3.8.1 claudin-5在大鼠肺组织的免疫组织化学染色 |
| 3.8.2 occludin在大鼠肺组织的免疫组织化学染色 |
| 3.8.3 ZO-1在大鼠肺组织的免疫组织化学染色 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:普通肝素通过抑制ERK1/2 MAPK活化减轻脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞渗漏和紧密连接损伤 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养方法 |
| 2.2.2 细胞分组处理方法 |
| 2.2.3 测定HLMVECs的跨内皮细胞电阻TEER |
| 2.2.4 测定HLMVECs单层细胞对FITC-dextran的通透性 |
| 2.2.5 透射电镜观察HLMVECs紧密连接超微结构 |
| 2.2.6 HLMVECs上清IL-6含量测定 |
| 2.2.7 Western blot检测HLMVECs claudin-5、occludin、ZO-1、p-ERK1/2、ERK1/2的表达 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HLMVECs跨内皮细胞电阻TEER的测定 |
| 3.2 LPS诱导HLMVECs跨内皮细胞电阻TEER降低 |
| 3.3 HLMVECs单层细胞对FITC-dextran的通透系数Pd值 |
| 3.4 HLMVECs紧密连接的超微结构 |
| 3.5 HLMVECs上清中IL-6的含量 |
| 3.6 Western blot检测HLMVECs claudin-5,occludin,ZO-1,Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2),p44/42 MAPK (ERK1/2)的表达 |
| 3.6.1 不同浓度LPS对HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1表达的影响 |
| 3.6.2 普通肝素减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1低表达 |
| 3.6.3 普通肝素抑制LPS诱导的HLMVECs ERK 1/2 MAPK磷酸化 |
| 3.6.4 U0126减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1低表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、低分子肝素钠凝胶的抗炎作用（论文参考文献）
- [1]外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用[D]. 张庆冬. 山东大学, 2021(11)
- [2]消栓饮对创伤性肢体深静脉血栓兔股静脉血管TMmRNA、mEPCRmRNA表达的影响[D]. 宋良琛. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [3]南海几种常见贝类肝素的提取分离、结构表征及抗血栓活性研究[D]. 杜振兴. 广东海洋大学, 2020
- [4]加减胶艾汤促进胎盘DAF表达抑制aPL诱导补体异常激活介导的胚胎损伤[D]. 陈玥婷. 湖北中医药大学, 2020(12)
- [5]低分子肝素的制备技术及临床应用进展[J]. 侯德坤,李书胜,巩腾飞. 山东化工, 2020(10)
- [6]鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价[D]. 周斯仪. 广东海洋大学, 2019(01)
- [7]低分子肝素对肾病综合征大鼠蛋白尿的影响及机制探讨[D]. 舒丽霞. 青海大学, 2019(04)
- [8]还原响应型支化聚β-氨基脂siRNA递送载体及其用于急性肺损伤的抗炎治疗研究[D]. 茅怡铭. 苏州大学, 2019(04)
- [9]蚂蟥水提物调控Sirtuin 1抑制炎症干预深静脉血栓形成[D]. 姚小兰. 广州中医药大学, 2019(04)
- [10]普通肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤及紧密连接的保护作用及机制研究[D]. 刘一娜. 中国医科大学, 2019(01)