一、肝细胞癌中端粒酶逆转录酶表达及其与肿瘤抑制基因p53相关性研究（论文文献综述）
边帅[1]（2021）在《GNL3L在食管鳞癌进展中的作用及机制的研究》文中研究表明背景:食管癌（Esophageal Cancer,EC）在全球癌症死亡率中排名第六,5年生存率不到20%,中位生存时间不足1年。基于流行病学和病理学研究,将食管癌分为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma,EAC）两种不同的类型。其中最常见的类型是食管鳞癌,约占发病总数的90%以上。尽管通过非侵入性筛查和内镜技术可早期发现病变并采取治疗措施,但仍有近半数食管癌患者确诊时已经发生转移或失去手术机会。食管癌对化疗敏感性差,现有分子靶向药物的应用也未能显着延长疾病晚期患者的生存时间。因此,特别有必要深入研究食管癌发生和进展的分子机制,不仅能够开发新的靶点用于药物研究,也能够为食管癌早期预警和预测患者预后提供新的标志物,从而更好地指导治疗和改善患者预后。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白样3-样蛋白（Guanine Nucleotide-Binding Protein-Like3-Like,GNL3L）是一种新的、进化上保守的结合GTP的核仁蛋白,属于GTP酶HSR1-MMR1亚家族成员。近年来,GNL3L在细胞增殖和细胞凋亡中扮演的角色逐渐受到重视。现有文献已经在人类乳腺癌、子宫颈癌、肝细胞癌、胃腺癌、结直肠癌和脑胶质瘤细胞中探究了GNL3L在肿瘤发生和进展中扮演的角色。例如,在结直肠癌中,miR-4454的过表达抑制了GNL3L的产生,并通过NF-κB途径改善了肿瘤耐药性问题。然而关于GNL3L在食管鳞癌细胞中的作用和起作用的信号途径,还未见详细研究。因此,本研究旨在探究GNL3L在食管鳞癌组织中的表达,及其在食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡中的生物学功能,初步阐明其作用机理,为食管鳞癌的靶向治疗和疾病预测提供新的策略及相应理论依据。方法:（1）GNL3L在食管鳞癌中的差异表达及临床价值1)通过GEPIA数据库（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析GNL3L在食管鳞癌组织及正常组织中表达水平和对患者预后的影响。2)通过Linked Omics进行相关性分析进一步确认GNL3L的临床价值;应用富集分析相关基因以预测可能的信号通路。（2）GNL3L在食管鳞癌进展中的生物学功能1)分别用GNL3L干扰RNA、GNL3L过表达质粒及阴性对照载体转染Eca-109和KYSE-150细胞,建立GNL3L敲低和过表达食管鳞癌细胞系。2)应用Western Blot实验确认细胞系建立成功后,分别在CCK8、克隆形成、细胞划痕、Transwell实验和流式细胞术中研究敲低和过表达GNL3L对食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。采用Western Blot实验检测敲低GNL3L对凋亡途经关键蛋白（Bcl-2,Bax和Caspase3-p17）表达水平的影响。3)采用人源性食管鳞癌裸鼠皮下肿瘤模型,分为阴性对照组（NC）、敲低组（GNL3L-KD）和过表达组（GNL3L-OE）。记录肿瘤大小和重量的变化情况。（3）探究GNL3L影响食管鳞癌进展的相关信号通路1)Western Blot检测RAS通路相关蛋白的表达变化。2)天然RAS信号通路抑制剂抗瘤酮A10处理过表达GNL3L的细胞,CCK8实验研究增殖的改变,流式细胞术研究凋亡的改变。（4）统计学方法本研究所有体外实验均独立重复3次,实验数据用Mean±SD表示,绘图及统计分析应用Graph Pad Prism 7软件,P值小于0.05被认为有统计学意义。结果:（1）GNL3L在人食管鳞癌组织中的差异表达及临床价值GNL3L在人食管鳞癌组织中高表达,较短的总生存期与GNL3L高水平表达有关,GNL3L表达水平还与肿瘤切除率和种族有关。GNL3L相关基因在肿瘤凋亡通路和RAS信号通路有丰富的表达。（2）GNL3L影响食管鳞癌的增殖、迁移、侵袭和凋亡敲低GNL3L对食管鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭有抑制作用;而过表达GNL3L具有促进作用。敲低细胞中的GNL3L促进凋亡,而过表达GNL3L抑制凋亡,这一作用是通过Bcl-2/Bax轴和Caspase级联反应实现的。在人源性食管鳞癌裸鼠皮下移植肿瘤模型中进一步证实,敲低GNL3L抑制肿瘤生长,过表达GNL3L产生促增殖作用。（3）GNL3L通过RAS通路影响食管鳞癌的生物学行为敲低和过表达GNL3L分别减少和增加RAS通路蛋白Ras和Raf的表达。用抗瘤酮A10处理过表达GNL3L的食管鳞癌细胞发现,GNL3L对细胞的促增殖作用和抗凋亡作用均被抑制。结论:本研究表明,GNL3L在食管鳞癌组织中异常高表达且与患者预后相关;GNL3L的表达水平影响食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抵抗凋亡;GNL3L的表达水平影响RAS通路蛋白的表达,天然RAS通路抑制剂抗瘤酮A10可抑制GNL3L的促增殖和抗凋亡作用,GNL3L可能通过RAS信号通路发挥生物学功能;通过人源性食管鳞癌裸鼠皮下移植肿瘤模型,进一步证实GNL3L具有促进肿瘤生长的作用。
戴小凡[2]（2020）在《长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制》文中提出研究背景:前列腺癌（prostate cancer,PCa）作为男性第二大常见癌症,具有高发病率和高死亡率的特征,占癌症相关死亡率的13%,确定的危险因素包括种族、高龄、遗传家族史和雄激素水平。在PCa的病理生理学方面,雄激素是人体内必不可少的类固醇激素,它主要通过雄激素受体（androgen receptor,AR）发挥效应,可以控制前列腺的发育、生长及分化,当撤除雄激素后,会造成前列腺细胞凋亡,在男性特征的发展和维持中起着关键作用。临床研究发现雄激素的调控失衡与PCa发病有着直接的关系,所以在PCa的治疗中经常使用AR拮抗剂和化学去势疗法控制PCa的进展,其中雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy,ADT）是临床治疗过程当中必不可少的方法。然而,在长期的治疗过程中,绝大多数原发性PCa最终获得ADT耐药性,从而进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）,这是目前临床上治疗PCa的难点与热点之一。因此,进一步探索PCa的发病机制有助于我们更深入的了解PCa发生发展的机理,有助于我们开发PCa新的诊断标记物和预后指标,有助于我们寻找治疗PCa的新靶点,最终为患者带来更好的获益。随着ENCODE项目的发起和完成以及高通量测序技术的不断发展,科学家们发现了大量长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）,并在研究的过程当中更加的意识到Lnc RNA在生理病理条件下或者在疾病的发生发展过程发挥着无可替代的作用,尤其是最近几年关于Lnc RNA在癌症中的研究最为广泛。肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1,MALAT1）在2003年首次被发现与非小细胞肺癌转移有关,随后大量的研究发现MALAT1也可以在不同系统器官的肿瘤中高表达,如消化系统肿瘤和泌尿系统肿瘤等,虽然MALAT1在PCa的研究中也有报道,但MALAT1在PCa中的作用机制仍然报道较少,并且MALAT1和AR信号通路之间的关系仍尚待阐明。目的意义:（1）通过研究MALAT1在PCa组织和细胞中的表达情况,分析MALAT1与PCa的临床相关性,明晰MALAT1在PCa中发挥的作用和功能。（2）通过体外实验研究MALAT1如何影响PCa的发生发展以及MALAT1是否参与AR信号通路的调节,进一步探索MALAT1在PCa中的作用机制。通过观察MALAT1对裸鼠体内PCa移植瘤的影响,进一步验证MALAT1在体内对PCa的作用。（3）通过研究MALAT1在PCa中的具体作用及内在机制,探讨MALAT1作为PCa新的肿瘤标记物和治疗靶点的可能性,为PCa的诊断和靶向治疗研究提供新的思路。方法:（1）运用生物信息学技术分析MALAT1在PCa组织中的表达情况以及与PCa的临床相关性,ROC曲线分析MALAT1在PCa中的诊断价值,基因富集分析预测MALAT1在PCa中可能发挥的作用。（2）划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测沉默MALAT1对PCa细胞迁移和侵袭能力的影响。（3）Western blot实验检测沉默MALAT1对PCa细胞上皮间质转化的影响。（4）CCK8检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞增殖的影响。（5）流式细胞术检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期的影响。（6）Western blot检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期相关蛋白的影响。（7）查阅文献、查询生信分析数据库预测MALAT1的候选靶基因mi RNA,然后预测mi RNA的种子序列所结合的靶标3’UTR。（8）双荧光素酶报告基因实验和挽救性实验验证MALAT1/mi R-1-3p/CORO1C,MALAT1/mi R-320b/AR信号轴在PCa细胞中的作用机制。（9）裸鼠移植瘤模型验证沉默MALAT1对体内PCa细胞成瘤的影响。结果:（1）MALAT1在PCa组织中的表达明显高于癌旁组织,MALAT1表达的高低与Gleason评分、淋巴结转移和分化程度具有明显相关性,高表达MALAT1的PCa患者的无病生存期和无进展生存期明显低于低表达的患者,ROC曲线分析MALAT1在PCa中具有一定的诊断价值,基因集富集分析方法预测了MALAT1显着富集在侵袭转移和细胞周期调控通路中。（2）MALAT1在PCa细胞系LNCa P和22Rv1中高表达,沉默MALAT1可以抑制LNCa P和22Rv1细胞的迁移侵袭和上皮间质转化的能力。有无雄激素刺激下,沉默MALAT1都可以抑制LNCa P和22Rv1细胞的增殖和细胞周期进程。（3）生信分析和双重荧光素酶报告基因实验表明,mi R-1-3p能够与MALAT1和CORO1C m RNA 3’UTR直接结合,并且MALAT1能够与CORO1C m RNA 3’UTR竞争性结合mi R-1-3p,促进CORO1C表达。挽救性实验验证了抑制mi R-1-3p或过表达CORO1C能够消除沉默MALAT1所诱导的LNCa P和22Rv1细胞的迁移侵袭和上皮间质转化的影响。（4）雄激素能够刺激LNCa P和22Rv1细胞中MALAT1和AR的表达,无论雄激素是否刺激,沉默MALAT1都能够抑制LNCa P和22Rv1细胞中AR的表达。生信分析和双重荧光素酶报告基因实验证明了MALAT1能够与mi R-320b结合,MALAT1与AR m RNA 3’UTR能够竞争mi R-320b的结合位点。挽救性实验验证了抑制mi R-320b或过表达AR能够逆转MALAT1沉默所引起的PCa细胞增殖和细胞周期进程的改变。（5）沉默MALAT1能够抑制裸鼠体内PCa移植瘤的生长,降低肿瘤组织中PSA和AR的表达。结论:（1）MALAT1在PCa组织和细胞中高表达,其可能作为促癌基因影响前列癌的发生发展,该基因的表达水平对PCa患者的诊断和预后判断具有一定的参考价值。（2）体外实验证明了MALAT1可以通过MALAT1/mi R-1-3p/CORO1C调控CORO1C表达以及通过MALAT1/mi R-320b/AR信号轴参与AR信号通路影响PCa的发生发展。（3）体内实验证实了沉默MALAT1可以抑制裸鼠体内PCa移植瘤的生长,该基因有望作为前列腺癌治疗的新靶点。
钱建新[3]（2020）在《核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究》文中研究说明根据解剖位置胆管癌分为三类:肝内（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝门部（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）以及远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）,其中肝门部胆管癌是最常见类型,占比超过60%。虽然位置不同,各类胆管癌发生的相关风险因素比较类似:原发性硬化性胆管炎（PSC）、胆道内的结石和寄生虫所导致的肝脏疾病。淋巴结浸润和边缘肿瘤细胞是否残留是决定术后预后的最重要因素。根治性手术切除的肝门部胆管癌5年生存率在10%到40%之间,然而,即使是R0切除,其复发率高达50～70%,高侵袭性和高复发性是pCCA两大病理特性。对于肝门部胆管癌发生发展分子机制的探寻以及胆管癌预后预测、治疗靶点筛选等一直是其临床研究重点。核糖体是细胞活动中极为重要的细胞器,负责将“RNA翻译成蛋白质”这一生物合成过程。此外,核糖体蛋白（ribosomal proteins,RPs）可调控细胞周期和细胞生长,促进肿瘤发生和发展。RPL34隶属于核糖体蛋白RPL34E家族成员。RPL34既往主要集中于非人类标本如昆虫和植物中进行研究。近年来,大量数据表明RPL34在不同类型恶性肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等中表达异常,其主要功能是通过调控细胞周期,促进细胞增殖。这些发现提示RPL34可能参与胆管癌发生发展。然而RPL34及功能在肝门部胆管癌中的研究少见报道。本实验拟研究RPL34在肝门部胆管癌中的表达,并分析其与临床病理参数和复发预后之间的相关性。进一步通过细胞学和动物实验探寻其在肝门部胆管癌中功能作用,最后利用高通量筛选寻找RPL34调控或者相关的靶基因。通过本课题的一系列研究,探索RPL34及其靶基因是否能够成为一种预测pCCA复发及预后的有效标志物,以及其能否成为pCCA潜在的临床治疗研究靶点。第一部分肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义目的:检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系,并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性,初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。方法:收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本,首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本,RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片（tissue microarray,TMA）技术结合免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术,从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果,并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联,探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。结果:（1）肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列,可见筛状结构,浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显,可见核仁,核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。根据肿瘤间质比（tumor-stroma ratio,TSR）=50%的最佳截断值,将患者分为“stroma-rich,间质丰富”和“stroma-poor,间质贫乏”,本研究中85例（70.2%）患者为间质贫乏,36例（29.8%）患者为间质丰富。TSR低（间质丰富）的肝门部胆管癌患者更加易于发生淋巴结转移和疾病进展迅速。TSR高（间质贫乏）的患者中位无复发生存期为1.5年,TSR低的患者中位无复发生存期为0.5年,P=0.073。TSR高的患者中位生存期为1.7年,TSR低的患者中位生存期为1.0年,P=0.028。神经侵犯（perineural invasion,PNI）是肝门部胆管细胞癌的另一个显着的病理特征。本研究中94例（77.7%）组织样本中存在神经侵犯,27例（22.3%）患者组织样本中未见明显的神经侵犯,PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。（2）RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调,提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA（P=0.0266）、RPS2（P=0.0309）、RPL34（P=0.0034）、RPL37（P=0.0584）、RPP0（P=0.0345）在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达,RPL34最为显着。（3）在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达,pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核,呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7%（94/121）。（4）pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低,RPL34表达越高;低分化组的阳性率（82%）要显着高于中、高分化组（30%）（P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6%vs 69.6%,P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P>0.05）。（5）单因素分析显示,边缘阳性（P=0.024）、区域淋巴结（P=0.015）、晚期（P=0.023）与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短（1.46年vs 3.73年,P<0.001）。在Cox模型中,RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。单因素生存分析表明肝门部胆管癌患者的不良预后与手术切缘阳性（P=0.013）、T分期（P=0.019）、淋巴结转移（P=0.001）、TSR（P=0.028）、TNM分期（P=0.003）以及组织分化程度（P=0.025）呈正相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位生存期更短（1.70年vs 3.63年,P<0.001）。在多因素模型中,RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。结论:肝门部胆管癌具有显着异常的TSR和PNI,两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达,提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达,其表达与疾病进展和淋巴结转移相关,RPL34的高表达患者更加易于复发,并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。第二部分核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响目的:为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制,观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。方法:合成RPL34-shRNA,包装慢病毒颗粒,靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34,Western blotting检测RPL34的表达,CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响,Transwell检测RPL34-sh RNA对pCCA细胞侵袭能力的改变,裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。结果:慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减,内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力,同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。结论:在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能,其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长,主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。第三部分核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制目的:应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异,初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。方法:（1）Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;（2）收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-sh RNA的肝门部胆管癌细胞,Trizol保存,送至基因检测平台;（3）利用Affymetrix?人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;（4）选择部分关键基因,进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;（5）构建了全长BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）的质粒,并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2,采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。结果:（1）RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调,提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。（2）基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显着改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2（SET domain containing 2）（Fold change=-2.20,P=0.043）、COA6（cytochrome c oxidase assembly factor 6）（Fold change=-2.05,P=0.035）、TSEN15（tRNA splicing endonuclease subunit 15）（Fold change=-1.94,P=0.011）、BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）（Fold change=-1.94,P=0.039）和HNRNPLL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like）（Fold change=-1.92,P=0.00029）。经过生物信息学分析,发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。（3）RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆,在非肿瘤上皮中呈弱表达,在肿瘤组织中呈强表达,肿瘤中的表达率为76.0%（92/121）。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比,BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短（1.69年vs3.14年,P=0.012）。（4）敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降,当过表达BCAS2后,癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能,增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降,提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。总结RPL34在肝门部胆管癌中显着高表达,具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降,提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物,靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。
郑建波[4]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中研究说明研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
李祖俐[5]（2020）在《高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析》文中认为目的:肝癌是全球第六常见的癌症,也是排名第四的癌症死亡原因。中国肝癌每年新发病例和死亡病例占全球50%以上,大多数肝癌初次诊断时已经伴随远处转移。由于肝癌异质性的存在,肝癌在化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗容易产生耐药,探究肝癌异质性显得格外重要。方法:对来自同一患者具有不同转移潜能的肝癌细胞系（MHCC97-L、MHCC97-H、HCC97LM3）进行了全外显子测序。在Oncotator中注释了测序数据,并找到非沉默类型突变基因。为了探究三株细胞进化关系,用Mega X软件构建了基于基因组单核苷酸多态性（SNP）的进化树。根据三株细胞突变位点和基因绘制维恩图并计算了异质性。在Excel中统计三株细胞的碱基改变情况、已知肝癌驱动基因和10个经典致癌信号通路上的基因突变情况。为了进一步探究三株细胞的不同,通过分析突变位点找到三株细胞的主干差异突变基因和各自特有的基因,利用STRING构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络找到hub突变基因,在c Bio Portal数据库中查询hub基因的突变与肝癌总生存期（OS）的关系。由于基因突变会影响基因表达,在ULCAN数据库探究了关键基因在肝癌中的表达及其对肝癌病人预后影响。挑选感兴趣的突变基因,根据突变位点设计引物后用PCR进行验证。结果:三株细胞的突变基因维恩图显示,三株细胞共有4691个突变基因,MHCC97-L特有突变基因243个,MHCC97-H特有突变基因315个,HCC97LM3特有突变基因289个。三株细胞的平均异质性突变率（三株细胞非共有的突变数占的百分比）为16.55%（范围15.38%～18.17%）。基于SNP的进化树显示,MHCC97-H和HCC97LM3在进化关系更近。三株细胞株在7个肝癌驱动基因（ARID1A、CDKN1A、P53、KEAP1、APOB、XPO1、HIST1H1E）和10个经典致癌信号通路基因（如ALK、RET、EGFR、ROS1、KRAS、HRAS、APC等）中存在非沉默突变。在c Bio Portal数据库中,部分从主干差异突变和特有突变中筛选的hub基因突变（SDC1、ITGB4、ITGA4、BPTF、COL4A1、MYOD1、AR、EFTUD2）与肝癌患者更短生存期相关。在ULCAN数据库中,部分关键基因（CDC27、RELA、EIF4E、POXO3、EZH2、POLR2G、WDTC1、DLG、EPRS、EFTUD2）不仅在肝癌组织中高表达,还与肝癌病人更短生存期相关。在MHCC97-H和HCC97LM3细胞中发现了肝癌驱动基因KEAP1的一个新的纯合移码缺失突变（1334del C,p.P445fs）,这导致了KEAP1蛋白的c末端（Nrf2结合区）缺失。结论:WES数据表明,来自同一患者的肿瘤活检标本的HCC细胞系通过在小鼠体内的重复选择获得了不同的转移潜能,它们在基因组水平上具有遗传关系。肝癌驱动基因中和经典致癌通路上的突变基因,以及从主干突变和特有突变中筛选出来的hub基因,在肝癌的发生发展中可能发挥着重要的作用。
段昆朋[6]（2020）在《LncRNA LINC00978通过MAPK信号通路影响肝细胞癌发生发展的研究》文中研究说明背景肝细胞癌是一种病死率极高的原发性肝癌。在我国癌症死亡率里排在第三位。在世界范围内以高发病率、高死亡率而着称。HCC形成特点是由多种因素、分多个阶段、协同作用所致。HCC的致病因素及发病机制,目前未被全部研究清楚。因此,彻底研究清楚HCC发生的具体分子机制,对于早期预防、早期诊断、精确治疗HCC意义重大。越来越多的Lnc RNAs被证实通过MAPK传导通路在肝细胞癌的形成过程中起调控作用。因此,深入探究Lnc RNAs的致癌机制对于HCC的诊断标志物及治疗新靶点的开发,具有着重要意义。方法（1）采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术,对HCC组织、癌旁组织中Lnc RNA LINC00978的表达情况进行对比检测。利用统计软件,论证Lnc RNA LINC00978的表达水平与临床数据的相关性。（2）采用q RT-PCR技术,对正常肝细胞和不同肝癌细胞系中Lnc RNA LINC00978的表达情况进行检测。并根据实验结果选取构建Lnc RNA LINC00978敲低细胞模型的HCC细胞系为Hep3B及Huh7。运用MTT实验、流式细胞术、集落形成实验等技术对细胞模型进行检测。探究敲除Lnc RNA LINC00978对Hep3B及Huh7的HCC细胞增殖、侵袭、迁移及细胞周期的影响。提取模型的总蛋白,运用Western blot技术,检测Lnc RNA LINC00978敲除后MAPK信号通路中关键分子的表达及其磷酸化水平的改变。结果（1）运用q RT-PCR检测49例收集的临床样本中Lnc RNA LINC00978的表达情况。在HCC组织中Lnc RNA LINC00978的表达水平增高;在癌旁肝组织中Lnc RNA LINC00978的表达水平相对明显降低。临床晚期HCC患者的Lnc RNA LINC00978表达明显高于早期HCC患者。Lnc RNA LINC00978高表达组5年总生存率明显低于低表达组。（2）Lnc RNA LINC00978在肝细胞癌细胞系中比正常肝细胞中的表达量明显升高。（3）sh RNA介导的Lnc RNA LINC00978敲低细胞模型显示:敲低Lnc RNA LINC00978后癌细胞的增殖、侵袭能力显着降低;敲低Lnc RNA LINC00978后癌细胞的细胞凋亡明显增加,细胞的周期阻滞。（4）蛋白质印迹显示Lnc RNA LINC00978的敲低可降低肝细胞癌模型中MAPK信号通路关键蛋白ERK,p38和JNK转化为磷酸化的P-ERK,P-p38和P-JNK的进程,影响通路活性。结论（1）Lnc RNA LINC00978是促癌基因,在HCC组织中表达增高,并促进HCC的发生、发展。Lnc RNA LINC00978的表达与病情的分期呈正相关。高表达的Lnc RNA LINC00978与HCC患者预后不良相关。（2）Lnc RNA LINC00978通过调控MAPK信号通路中关键分子ERK、p38和JNK的磷酸化进而影响HCC的发生发展。
戴月娣[7]（2020）在《KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究》文中研究说明胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显着升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。
周子龙[8]（2019）在《PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究》文中进行了进一步梳理抑制素2（Prohibitin 2,PHB2）是一种进化上高度保守的蛋白,其在真核细胞中广泛表达,通常与PHB1结合形成复合体,负责维持线粒体结构与功能,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为。目前,已有研究显示PHB2与肿瘤的发生、发展有关,但PHB2在肿瘤中的作用及分子机制还未完全阐明。横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma,RMS）是最常见的小儿软组织肿瘤之一,起源于原始间叶细胞,发病率约占小儿软组织肉瘤的50%。横纹肌肉瘤表达肌源性促分化转录因子,但却不能完成终末分化。我们的前期研究表明PHB2负调控肌肉促分化转录因子（如MyoD和MEF2）的活性,从而对成肌细胞的分化进程具有明显的抑制作用,那么PHB2是否在横纹肌肉瘤发生、发展中发挥一定的作用?鉴于此,本文对PHB2在横纹肌肉瘤细胞中的功能及作用机制进行了系统研究。此外,我们的初步研究结果表明PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中可能存在着亚细胞定位和生物学作用上的差异,为了进一步探讨这种差异,我们利用肝癌和正常肝细胞系对PHB2在正常细胞和癌变细胞中的生物学作用进行了初步的对比研究。为了研究PHB2在横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程中的作用,我们采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制内源性PHB2的表达,以分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞增殖及分化的调控作用,并探讨其中的作用机制。首先,我们采用MTT法检测干扰PHB2表达对横纹肌肉瘤细胞系的细胞活力的影响,结果发现PHB2表达下调明显降低了横纹肌肉瘤细胞的细胞活力。为了进一步明确横纹肌肉瘤细胞细胞活力的下降是否与细胞增殖受到抑制有关,我们分别采用BrdU掺入法检测了细胞的DNA合成能力,免疫荧光染色法检测了细胞增殖标志物Ki67的阳性率以及分析了细胞的平板克隆形成能力。结果表明PHB2表达下调明显降低横纹肌肉瘤细胞DNA合成能力,并导致Ki67阳性细胞数显着减少及克隆形成能力下降。以上结果提示PHB2表达下调可明显抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力。为了进一步研究PHB2表达下调是否影响横纹肌肉瘤细胞的细胞周期及诱导细胞发生凋亡,我们采用流式细胞术和免疫印迹法分别分析了肿瘤细胞的细胞周期和凋亡以及周期蛋白的表达水平,结果发现PHB2表达下调导致横纹肌肉瘤细胞系RD细胞出现G1期阻滞,同时抑制了周期蛋白E（Cyclin E）的表达,并引起少量细胞凋亡。为了进一步分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞分化的影响,我们采用免疫印迹及免疫荧光染色的方法检测了骨骼肌细胞分化标志分子成肌因子（myogenin）的表达,结果表明PHB2表达下调提高了横纹肌肉瘤细胞myogenin的表达水平及myogenin阳性细胞数,说明PHB2表达下调促进了横纹肌肉瘤细胞的分化。以上结果说明PHB2参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化状态。为了进一步探究PHB2参与调节横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程的分子机制,我们首先对之前发现的部分PHB2疑似细胞核核仁定位进行了确认。通过对横纹肌肉瘤细胞中的PHB2和核磷蛋白（nucleophosmin,NPM）进行免疫荧光共定位检测,我们发现,不同组织类型来源的多种横纹肌肉瘤细胞系中均有部分PHB2与NPM共定位于核仁,但在大鼠正常成肌细胞L6细胞中却未观察到PHB2的核仁定位。为了进一步研究PHB2核仁定位的普遍性和特异性,我们对人肝细胞癌细胞系HepG2、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人卵巢癌细胞系A2780及人正常肝细胞系L02细胞进行了PHB2免疫荧光染色分析,结果发现MDA-MB-231细胞和A2780细胞中均未出现PHB2的核仁定位,而值得关注的是,PHB2在HepG2细胞中出现了核仁定位,在L02细胞中则无核仁定位。以上结果说明PHB2至少在包括横纹肌肉瘤及肝癌等在内的部分肿瘤细胞中存在着特异的细胞核核仁定位。鉴于部分PHB2明显定位于横纹肌肉瘤细胞的核仁中,而核仁的结构与功能与肿瘤的发生、发展密切相关,其介导的rRNA合成功能的增强是肿瘤细胞增殖的重要标志,因此接下来我们探究了PHB2表达下调对横纹肌肉瘤细胞核仁结构和功能的影响。透射电子显微镜观察横纹肌肉瘤细胞超微结构的结果显示,与对照组相比,PHB2表达下调后,横纹肌肉瘤细胞表现出核仁小且致密、边界不清,海绵状核仁消失等特征。同时采用实时定量PCR检测45S核糖体RNA（45S rRNA）和18S核糖体RNA（18S rRNA）的转录水平以分析核仁的功能,结果表明PHB2表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞45S rRNA和18S rRNA的合成,说明PHB2参与调控核糖体DNA（rDNA）转录。有研究表明,转录因子Myc和肌肉特异性促分化转录因子成肌分化蛋白（Myoblast determination protein 1,MyoD）分别正或负调控rDNA的转录从而促进细胞增殖（Myc）或促进细胞分化（MyoD）。为了进一步揭示PHB2对rDNA转录的调节作用是否与这两种转录因子的活性有关,我们采用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）检测PHB2表达下调是否影响转录因子Myc和MyoD与rDNA的结合,结果表明,PHB2表达下调明显抑制Myc与rDNA的结合,同时促进MyoD与rDNA的结合,这一结果与PHB2表达下调抑制rRNA合成的结果相一致,提示PHB2通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞的rRNA合成。由于PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中存在着核仁定位的差异,为了明确这种定位上的差异是否导致PHB2在肿瘤细胞和正常细胞中发挥不同的生物学作用,我们选用人肝细胞癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02开展了对比研究。首先对比分析PHB2对正常肝细胞和肝细胞癌细胞活力的影响,MTT实验结果显示PHB2表达下调明显抑制了HepG2细胞的细胞活力,但对正常肝细胞L02则无明显影响。BrdU掺入实验亦显示PHB2表达下调降低了HepG2细胞的DNA合成能力,而对正常细胞L02无明显影响。细胞周期蛋白表达水平的免疫印迹分析显示PHB2表达下调可以抑制HepG2细胞而非L02细胞中细胞周期蛋白Cyclin E的表达,同时初步发现PHB2表达下调可以促进HepG2细胞中p27和p53的表达。这些结果说明PHB2在正常细胞和肿瘤细胞的增殖过程中可能发挥着不同的作用。进一步透射电镜分析超微结构显示PHB2表达下调导致HepG2细胞的核仁体积明显变小,而L02细胞的核仁结构则无明显改变。实时定量PCR分析rRNA水平亦显示PHB2表达下调可明显抑制HepG2细胞的rRNA合成,但对L02细胞的rRNA合成则无抑制作用,说明PHB2特异地对肝细胞癌细胞的rRNA合成至关重要。PHB2的线粒体定位普遍存在于几乎所有细胞,因此我们又对比分析了PHB2下调对正常肝细胞和肝细胞癌细胞ATP合成能力的影响,结果我们发现PHB2表达下调对HepG2细胞ATP合成的抑制作用高于L02细胞,但这仅是我们初步的研究结果,还需要进一步的研究进行确认。总之,在本研究中,我们首次确定部分PHB2特异地定位于部分肿瘤细胞的核仁,并参与维持核仁的结构,调控核仁的功能。在横纹肌肉瘤细胞中,PHB2具有促进细胞增殖,抑制细胞分化的作用,并参与维持横纹肌肉瘤细胞的核仁结构,及通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞中rRNA合成,提示PHB2对核仁结构与功能的调节作用是其参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化的分子机制之一。在肝细胞癌细胞与正常肝细胞的对比研究中,我们亦发现PHB2特异地定位于肝细胞癌细胞而非正常肝细胞的核仁中,且具有促进肿瘤细胞而非正常细胞增殖以及能量代谢的作用,参与调控肿瘤细胞而非正常细胞的核仁功能。本研究提供了PHB2参与肿瘤发生发展过程的新证据并提出其发挥作用的新机制。
何彬[9]（2019）在《HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究》文中研究表明背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发病率在我国高居恶性肿瘤的第四位,死亡率更是高居第三位。我国每年新发肝癌46.6万,每年因肝癌死亡42.2万,两者均占全世界总数的50%以上。肝细胞癌具有起病隐匿、早期诊断困难、肝切除术后容易复发转移和晚期治愈率低等特点,对我国乃至全球人民的健康造成极其严重的危害。因此,早期肿瘤标志物的寻找、个体化精准诊断和治疗的实施、预后复发转移预警标记物的确立是目前肝癌诊治中亟需解决的问题。目的1.比较HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌与相应癌旁组织中的表达差异,分析HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝癌患者临床病理特征及预后之间的相关性,从而验证HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌中作为新型分子标志物的潜在价值。2.明确JNJ-26481585对肝癌细胞体外增殖和体内成瘤的抑制作用,并利用细胞和分子生物学技术探讨JNJ-26481585抑制肝癌细胞增殖的机制,进一步探究JNJ-26481585促进肝癌细胞G0/G1期阻滞及诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。3.明确JNJ-26481585与Sorafenib联合应用可以呈协同方式,抑制肝癌细胞体外增殖和体内成瘤,进一步探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用在体内外协同抑制肝癌细胞增殖的分子机制。4.探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。方法1.使用蛋白免疫印迹、免疫组织化学实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平,评价HDAC1、HDAC2、HDAC4在这两种组织中的表达差异。根据免疫组织化学评分结果,分析111例肝细胞癌组织中IHEDAC1、HDAC2、HDAC4的表达水平与临床病理特征及预后之间的相关性。2.使用实时荧光定量PCR实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞QSG-7701中mRNA的表达水平。3.通过CCK-8细胞活力检测、平板克隆形成、EDU实验,评估JNJ-26481585对肝癌细胞增殖的抑制作用。利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,探究JNJ-26481585对肝癌细胞周期、凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的作用。4.利用流式细胞术检测AKT抑制剂MK2206 2HCL对JNJ-26481585诱导细胞周期的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞周期阻滞的分子机制。5.利用流式细胞术检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。6.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。7.利用CompuSyn软件计算JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后的联合指数（Combination Index,CI）,明确 JNJ-26481585 与 Sorafenib 联合应用呈协同方式,并且确定两药联合应用的最佳搭配浓度。8.利用流式细胞术检测细胞凋亡,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对肝癌细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞凋亡相关蛋白的作用。9.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。10.在裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型中,评估JNJ-26481585在体内抑制肝癌细胞生长以及与Sorafenib联用后抑制肝癌细胞增殖的作用。11.利用HE染色法检测裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型体内重要脏器的组织形态学变化,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。12.利用免疫组化检测裸鼠瘤体组织的磷酸化JNK、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Ki67的蛋白表达情况;通过Tunel染色检测瘤体肿瘤细胞的凋亡情况;从而在体内探索JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。结果1.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平在肝癌组织中要高于相应癌旁组织。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,即HDAC1在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,门静脉血管就越容易被肿瘤侵犯,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度;HDAC2在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,组织学分化程度就越差;HDAC4在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度。3.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者术后总体生存率存在着密切关系,即低表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显长于高表达患者。4.HDAC1、HDAC2、]HEDAC4在肝癌细胞系中的mRNA表达水平要高于正常肝细胞。5.JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而诱导肝癌细胞周期阻滞。6.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP、Bax 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Survivin的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。7.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外均能够协同抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。8.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。9.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。结论1.HDAC1、HDAC2、HDAC4 在肝癌组织显着高表达,HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,高表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显短于低表达患者。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4对患者预后具有预警价值,未来有希望作为肝细胞癌术后新型预警分子标记物。3.JNJ-26481585通过调控PIBK/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而促进肝癌细胞的周期阻滞。4.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达水平,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。5.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内体外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。6.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。
戴薇[10]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中进行了进一步梳理癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
二、肝细胞癌中端粒酶逆转录酶表达及其与肿瘤抑制基因p53相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌中端粒酶逆转录酶表达及其与肿瘤抑制基因p53相关性研究（论文提纲范文）
（1）GNL3L在食管鳞癌进展中的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食管癌概述 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 食管癌的分子靶向治疗 |
| 1.2 核仁的功能 |
| 1.2.1 核仁的结构及主要功能 |
| 1.2.2 核仁内蛋白的定位 |
| 1.2.3 核仁的其他功能 |
| 1.3 核干细胞因子家族 |
| 1.3.1 核干细胞因子家族概述 |
| 1.3.2 核干细胞因子功能概述 |
| 1.3.3 结合核干细胞因子的蛋白及相关作用机制 |
| 1.3.4 GNL3L与核干细胞因子的联系及区别 |
| 1.4 RAS信号通路与食管癌 |
| 1.4.1 RAS信号通路概述 |
| 1.4.2 RAS信号通路与肿瘤 |
| 1.4.3 RAS信号通路与食管癌 |
| 1.5 抗瘤酮与肿瘤治疗 |
| 1.5.1 抗瘤酮概述 |
| 1.5.2 抗瘤酮作用于RAS通路 |
| 1.5.3 抗瘤酮对多种肿瘤有效 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 综述 GNL3L的研究进展 |
| 2.1 GNL3L的发现及基本结构 |
| 2.2 GNL3L的空间构型与细胞内定位 |
| 2.3 GNL3L在调节细胞周期中的作用 |
| 2.4 GNL3L影响核糖体合成 |
| 2.5 GNL3L在肿瘤中的作用 |
| 2.5.1 结合雌激素相关受体γ |
| 2.5.2 结合小鼠双微体2 |
| 2.5.3 结合核因子κB |
| 2.5.4 影响肿瘤起始细胞 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞系及动物 |
| 3.1.2 抗体、siRNA及质粒 |
| 3.1.3 主要实验试剂及仪器 |
| 3.1.4 主要实验溶液配制 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞转染 |
| 3.2.3 CCK8 实验 |
| 3.2.4 Transwell迁移/侵袭实验 |
| 3.2.5 克隆形成实验 |
| 3.2.6 细胞划痕实验 |
| 3.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.2.8 Western Blot实验 |
| 3.2.9 人源性食管鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 GNL3L在食管鳞癌组织中的表达及临床价值 |
| 4.2 GNL3L敲低和过表达的食管鳞癌细胞系的建立 |
| 4.3 GNL3L影响食管鳞癌细胞的增殖 |
| 4.4 GNL3L影响食管鳞癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.5 GNL3L影响食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 4.6 GNL3L影响RAS通路相关蛋白的表达 |
| 4.7 阻断RAS信号通路抑制GNL3L的促增殖作用 |
| 4.8 阻断RAS信号通路抑制GNL3L的抗凋亡作用 |
| 4.9 GNL3L对人源性食管鳞癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 GNL3L在食管鳞癌组织中的差异表达及临床价值 |
| 5.2 GNL3L影响食管鳞癌细胞的增殖 |
| 5.3 GNL3L影响食管鳞癌细胞的迁移和侵袭 |
| 5.4 GNL3L影响食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 5.5 GNL3L通过RAS通路影响食管鳞癌的生物学行为 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 背景回顾 |
| 1.2.1 MALAT1的结构和生成 |
| 1.2.2 MALAT1的定位 |
| 1.2.3 调控MALAT1的机制 |
| 1.2.4 MALAT1的调控机制 |
| 1.2.5 MALAT1与肿瘤的关系 |
| 第2章 MALAT1在前列腺癌中的表达及功能的研究 |
| 前言 |
| 第一节 MALAT1在前列腺癌组织中的表达及作用 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 数据资料收集 |
| 1.2 数据整理和临床病理特征相关性分析 |
| 1.3 生存分析 |
| 1.4 ROC曲线分析 |
| 1.5 基因集富集分析 |
| 1.6 统计分析 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1在PCa组织中的表达情况 |
| 2.2 MALAT1在不同临床特征的PCa患者中的表达情况 |
| 2.3 MALAT1表达与预后的关系 |
| 2.4 MALAT1对PCa的诊断价值 |
| 2.5 MALAT1的功能富集分析 |
| 第二节 MALAT1在前列腺癌细胞中的表达和功能 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 试剂配置 |
| 1.4 细胞处理 |
| 1.4.1 细胞复苏 |
| 1.4.2 细胞传代 |
| 1.4.3 细胞计数 |
| 1.4.4 细胞冻存 |
| 1.4.5 细胞转染 |
| 1.4.6 单克隆细胞株的筛选和培养 |
| 1.4.7 细胞加药 |
| 1.5 质粒构建 |
| 1.5.1 引物退火 |
| 1.5.2 质粒提取 |
| 1.5.3 基因重组 |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.6.1 总RNA提取 |
| 1.6.2 RNA浓度检测 |
| 1.6.3 反转录 |
| 1.6.4 实时荧光定量分析 |
| 1.7 western blot |
| 1.7.1 蛋白质抽提 |
| 1.7.2 蛋白质定量 |
| 1.7.3 SDS-PAGE |
| 1.7.4 转印 |
| 1.7.5 封闭 |
| 1.7.6 孵育一抗 |
| 1.7.7 孵育二抗 |
| 1.7.8 ECL底物发光 |
| 1.7.9 结果分析 |
| 1.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.9 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 |
| 1.9.1 Transwell侵袭实验小室模型建立 |
| 1.9.2 Transwell小室侵袭实验 |
| 1.10 流式细胞仪检测有丝分裂 |
| 1.10.1 细胞接种培养 |
| 1.10.2 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.11 CCK8检测细胞增殖能力 |
| 1.12 统计学分析 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1在PCa细胞中的表达情况 |
| 2.2 验证sh MALAT1在LNCa P和22Rv1 细胞中的转染效力 |
| 2.3 沉默MALAT1对PCa细胞的迁移侵袭能力的影响 |
| 2.4 沉默MALAT1对PCa细胞上皮间质转化的影响 |
| 2.5 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞增殖的影响 |
| 2.6 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期的影响 |
| 2.7 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期进程中相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 第3章 MALAT1在前列腺癌中作用的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 MALAT1的沉默通过竞争性结合miR-1-3p抑制前列腺癌细胞迁移侵袭和上皮间质转化 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 细胞选择 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.4 质粒的构建 |
| 1.5 RNA提取和实时定量PCR |
| 1.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.6.1 细胞接种和培养 |
| 1.6.2 细胞转染1 |
| 1.6.3 细胞转染2 |
| 1.6.4 荧光素酶活性的检测 |
| 1.7 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.8 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 |
| 1.9 western blot检测上皮间质转化的相关蛋白 |
| 1.10 统计学方法 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴假说的建立 |
| 2.2 miR-1-3p在 PCa细胞中表达情况 |
| 2.3 沉默MALAT1 后,PCa细胞中miR-1-3p、CORO1C的表达水平 |
| 2.4 双荧光素酶报告基因验证MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴 |
| 2.5 miR-1-3p在 PCa细胞中对MALAT1和CORO1C表达的影响 |
| 2.6 挽救性实验验证MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴 |
| 2.7 沉默MALAT1的PCa细胞中抑制miR-1-3p对细胞表型的影响 |
| 2.8 沉默MALAT1的PCa细胞中过表达CORO1C对细胞表型的影响 |
| 第二节 沉默MALAT1抑制雄激素受体信号传导阻止前列腺癌细胞的增殖和细胞周期进程 |
| 1、材料和方法 |
| 1.1 实验材料和仪器 |
| 1.2 细胞的处理 |
| 1.3 质粒的构建 |
| 1.4 RNA提取和实时定量PCR |
| 1.5 双荧光素酶报告实验 |
| 1.6 CCK8实验检测细胞增殖能力 |
| 1.7 流式细胞仪检测细胞有丝分裂 |
| 1.8 western blot检测细胞周期相关蛋白 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 DHT刺激PCa细胞对MALAT1表达的影响 |
| 2.2 雄激素刺激PCa细胞对AR表达的影响 |
| 2.3 沉默MALAT1对AR表达的影响 |
| 2.4 MALAT1与AR mRNA共享的miRNA |
| 2.5 雄激素刺激或沉默MALAT1对PCa细胞中miR-320b表达的影响 |
| 2.6 miR-320b对 AR的影响 |
| 2.7 沉默MALAT1的PCa细胞中抑制miR-320b对细胞表型的影响 |
| 2.8 沉默MALAT1的PCa细胞中过表达AR对细胞表型的影响 |
| 讨论 |
| 第4章 MALAT1对裸鼠体内前列腺癌移植瘤生长的影响 |
| 前言 |
| 1、材料和方法 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 动物模型 |
| 1.4 免疫组化 |
| 1.4.1 包埋切片 |
| 1.4.2 切片脱蜡至水 |
| 1.4.3 抗原修复 |
| 1.4.4 过氧化氢孵育 |
| 1.4.5 山羊血清封闭 |
| 1.4.6 一抗孵育 |
| 1.4.7 二抗孵育 |
| 1.4.8 辣根酶标记 |
| 1.4.9 DAB显色 |
| 1.4.10 苏木素复染 |
| 1.4.11 脱水、透明、封片 |
| 1.4.12 镜检 |
| 1.5 免疫荧光 |
| 1.5.1包埋切片同1.4.1 |
| 1.5.2 免疫荧光双染 |
| 1.5.3 镜检 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 沉默MALAT1 对体内PCa细胞形成肿瘤的影响 |
| 2.2 沉默MALAT1 对肿瘤组织内的PSA及 AR的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取的的科研成果 |
| 致谢 |
（3）核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝门部胆管细胞癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义 |
| 一、肝门部胆管细胞癌的临床病理学分析 |
| 二、核糖体蛋白家族成员在肝门部胆管癌中的表达谱系 |
| 三、RPL34在肝门部胆管癌中的表达及其临床意义 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 核糖体蛋白RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肝门部胆管癌发生发展的分子生物学基础进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（5）高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 DNA提取 |
| 1.3 DNA样本评估及全外显子测序 |
| 1.4 Oncotator注释突变体 |
| 1.5 三株细胞的进化树以及突变基因分布 |
| 1.6 功能富集分析 |
| 1.7 蛋白质网络互作分析 |
| 1.8 HUB基因突变与HCC病人预后关联分析 |
| 1.9 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 1.10 三株细胞的差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 1.11 突变基因KEAP1 分析及PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 根据WES分析三株细胞的突变情况 |
| 2.2 肿瘤驱动突变基因和致癌信号通路上的突变情况 |
| 2.3 三株细胞的共有突变基因分析 |
| 2.4 三株细胞的特有突变基因分析 |
| 2.5 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 2.6 三株细胞差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 2.7 突变KEAP1 基因分析和PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌的主要驱动基因与肿瘤 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参与的课题项目 |
（6）LncRNA LINC00978通过MAPK信号通路影响肝细胞癌发生发展的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 长链非编码RNA(LncRNA)的简述 |
| 1.1.1 LncRNA的结构与分类 |
| 1.1.2 LncRNA的生物学功能 |
| 1.1.3 LncRNA LINC00978 简介 |
| 1.2 LncRNA与恶性肿瘤 |
| 1.2.1 LncRNA在恶性肿瘤形成中的促进作用 |
| 1.2.2 LncRNA在恶性肿瘤形成中的抑制作用 |
| 1.2.3 LncRNA与肝细胞癌 |
| 1.3 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)信号通路 |
| 1.3.1 MAPK信号通路的简介 |
| 1.3.2 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与LncRNA |
| 1.3.3 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与肝细胞癌 |
| 第二章 实验研究的目的、方法设计及意义 |
| 2.1 前期实验研究的结果及本次实验研究的目的 |
| 2.1.1 前期实验研究结果 |
| 2.1.2 本次实验研究的目的 |
| 2.2 实验研究的方法设计 |
| 2.3 实验研究的意义 |
| 第三章 sh-RNA干扰Lnc LINC00978 后对HCC细胞生长的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物信息学分析 |
| 3.1.2 细胞株的选择 |
| 3.1.3 引物设计与合成 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器和耗材 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 质粒的提取 |
| 3.2.3 质粒转染 |
| 3.2.4 细胞总RNA提取 |
| 3.2.5 逆转录PCR |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR |
| 3.2.7 细胞生长曲线测定 |
| 3.2.8 细胞增殖测定 |
| 3.2.10 细胞凋亡检测 |
| 3.2.11 细胞总蛋白提取 |
| 3.2.12 Western blot检测 |
| 3.2.13 实验数据收集和统计学处理 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 Lnc RNA LINC00978 促进肝细胞癌增殖及侵袭 |
| 3.3.2 LncRNA LINC00978对MAPK信号通路的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 综合讨论 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝细胞癌致病因素及机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（7）KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KLF2抑制胰腺癌的机制研究 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 衰老与恶性肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 参与的科研项目 |
| 致谢 |
（8）PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 横纹肌肉瘤 |
| 1.1.1 横纹肌肉瘤概述 |
| 1.1.2 横纹肌肉瘤组织学分型及遗传学分析 |
| 1.1.3 横纹肌肉瘤与骨骼肌分化 |
| 1.2 肝细胞癌 |
| 1.2.1 肝细胞癌概述 |
| 1.2.2 肝细胞癌发病机制研究进展 |
| 1.3 核仁在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3.1 核仁的结构 |
| 1.3.2 核仁核糖体生成与肿瘤 |
| 1.3.3 核仁非核糖体生成功能与肿瘤 |
| 1.4 PHB2 蛋白与肿瘤 |
| 1.4.1 PHB2 蛋白简介 |
| 1.4.2 PHB2 蛋白的定位与功能 |
| 1.4.3 PHB2 蛋白在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PHB2 蛋白对横纹肌肉瘤细胞生物学行为的影响及定位于核仁的确认 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞活力 |
| 2.2.2 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力 |
| 2.2.3 PHB2 表达下调诱导RD细胞凋亡 |
| 2.2.4 PHB2 表达下调促进RD细胞分化 |
| 2.2.5 部分PHB2 蛋白定位于肿瘤细胞的核仁 |
| 2.2.6 PHB2 表达下调改变横纹肌肉瘤细胞的超微结构 |
| 2.2.7 PHB2 表达下调抑制RD细胞r RNA的合成 |
| 2.2.8 PHB2 调控r RNA合成的分子机制 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PHB2 蛋白在正常肝细胞和肝细胞癌细胞中生物学作用的对比研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的细胞活力 |
| 3.2.2 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的增殖 |
| 3.2.3 PHB2 表达下调对Hep G2和L02 细胞超微结构的影响 |
| 3.2.4 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的r DNA转录 |
| 3.2.5 PHB2 表达下调抑制HepG2 细胞的ATP合成能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（9）HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HDACs在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平明显升高 |
| 2.2 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 |
| 2.3 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达差异与肝细胞癌患者术后长期生存的相关性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585抗肝癌的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞(QSG-7701)中的表达水平分析 |
| 2.2 JNJ-26481585能够抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.3 JNJ-26481585能够抑制肝癌细HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达 |
| 2.4 JNJ-26481585能够阻滞肝细胞癌细胞周期进程 |
| 2.5 JNJ-26481585能够促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.6 JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT和JNK/c-jun通路来影响细胞周期和凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 JNJ-26481585与Sorafenib联用能够协同抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.2 JNJ-26481585与Sorafenib联用通过调控JNK促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.3 JNJ-26481585与Sorafenib联用对裸鼠成瘤能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（10）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
四、肝细胞癌中端粒酶逆转录酶表达及其与肿瘤抑制基因p53相关性研究（论文参考文献）
- [1]GNL3L在食管鳞癌进展中的作用及机制的研究[D]. 边帅. 吉林大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制[D]. 戴小凡. 吉林大学, 2020(03)
- [3]核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究[D]. 钱建新. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [4]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [5]高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析[D]. 李祖俐. 重庆医科大学, 2020(02)
- [6]LncRNA LINC00978通过MAPK信号通路影响肝细胞癌发生发展的研究[D]. 段昆朋. 河北大学, 2020(08)
- [7]KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究[D]. 戴月娣. 苏州大学, 2020(06)
- [8]PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究[D]. 周子龙. 东北师范大学, 2019(04)
- [9]HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究[D]. 何彬. 浙江大学, 2019(03)
- [10]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)