一、抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用（论文文献综述）
林婷[1]（2020）在《人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究》文中研究说明单链抗体（scFv:the single-chain variable fragment of antibody）具有分子量小、半衰期短、免疫原性低、结构稳定等特点,在治疗与诊断、实验研究中被广泛应用。然而,scFv需从构建好的抗体库中筛选得到。scFv的生产则需要外源蛋白表达系统的参与。基于此,本人从以下两方面开展研究工作:（1）构建大库容及高多样性的scFv抗体库;（2）利用毕赤酵母表达系统高水平表达scFv。为了构建大库容及高多样性的scFv抗体库,我们收集了120份人体外周血,分离淋巴细胞并提取其RNA,扩增了抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）片段的编码序列。通过多肽链（Linker）序列将重链与轻链成功拼接成scFv片段,scFv片段插入p CANTAB 5E噬菌粒载体后,电转入TG1大肠杆菌中复制,最后利用辅助噬菌体M13KO7感染TG1,形成噬菌体表面展示scFv抗体库。最终获得的人源scFv抗体库的库容为:9.10×105,噬菌体滴定后的库容为:2.15×109 pfu。对阳性TG1进行基因测序得到的结果与理论相符,序列中含有SfiⅠ与NotⅠ酶切位点、Linker（G4S）3、g3信号肽及E标签这5个元素,且阅读框正确。为了提高scFv在毕赤酵母中的蛋白表达量,探究了密码子对上下文序列对scFv表达量的影响。我们根据毕赤酵母密码子对使用情况设计开发了基于密码子对的优化软件。为了确定密码子对上下文序列在毕赤酵母中是否影响scFv的表达,本研究利用了两个蛋白（ADAM17和MT1-MMP）的scFv进行验证。通过开发的密码子对优化软件分别设计了一条得分最高与一条得分最低的序列,得分最低的ADAM17scFv序列没有检测到表达,得分最低的MT1-MMP scFv序列只检测到微弱表达,而ADAM17和MT1-MMP得分最高的scFv序列均有强烈的表达,表明在毕赤酵母中密码子对上下文序列严重影响scFv的表达。目前,在毕赤酵母中对外源蛋白表达序列的优化均基于密码子使用频率。为了比较密码子使用频率和密码子对上下文对scFv序列表达量的影响,设计合成了基于传统密码子使用频率的ADAM17和MT1-MMP scFv优化序列。表达结果显示,基于密码子对上下文进行优化的scFv序列表达水平显着高于基于传统密码子使用频率优化的序列,ADAM17 scFv表达量高出5.37倍,MT1-MMP scFv表达量高出7.37倍。结果表明,在毕赤酵母中表达scFv,密码子对上下文优化方案优越于密码子使用频率优化方案。本研究构建了不可复制的人源scFv抗体库,扩大了已有的scFv抗体库的库容,加大了获得抗新型抗原的人源性scFv的可能性,为后续开发新型人源scFv临床药物奠定了基础;密码子对优化软件的开发以及该策略的确定对于毕赤酵母表达系统具有重大的意义,提高了scFv序列在毕赤酵母中的表达产量,使scFv更容易大量获得,对该领域研究的发展和应用具有一定的推动作用。
张倩倩[2]（2013）在《全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗体制备及活性鉴定》文中指出狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患疾病，几乎遍及全世界各个国家。狂犬病一旦发病尚无有效治疗措施，死亡率几乎为100%[1]。由于狂犬病的传染源广泛存在，全球每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，并且每年至少有1650万人需要接受狂犬病病毒暴露后治疗，疾病控制难度很大。我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，仅次于印度，居全球第二位。据保守估计，我国每年超过3000人死于狂犬病，并且近几年发病率呈现逐年上升的趋势。因此研制有效的狂犬病防治药物具有重要意义[2]。世界卫生组织（WHO）建议，对狂犬病的III级暴露及免疫力低下患者的II级暴露治疗，必须立即接种狂犬病疫苗和抗狂犬病病毒免疫球蛋白（RIG）。目前，临床上使用的RIG包括马抗狂犬病病毒免疫球蛋白（ERIG）和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白（HRIG）两类。ERIG易引起过敏反应和血清病；HRIG成本高且产量少，存在潜在病毒污染的危险；血源产品质量难以控制，临床使用存在安全隐患，难以满足临床用药需求，其治疗效果也有待于提高[3,4]。因此，研发全人源基因工程抗体替代传统的血源性免疫球蛋白已迫在眉睫。本研究应用噬菌体抗体库技术，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库，从中富集、筛选具有中和活性的全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体，为研制可用于人狂犬病病毒暴露后的紧急预防药物奠定基础。研究方法1.构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库取130位经狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞，提取总RNA，逆转录制备cDNA；用人源特异性抗体引物扩增VH、VL基因，再经过重叠PCR制备scFv基因片断；将scFv片断与pComb3XSS同时经SfiI酶切、纯化并连接后电转化入宿主菌E.coli.XL1-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养后，上清经PEG8000/NaCl沉淀，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。2. E.coli.TOP10F′原核表达系统表达并纯化狂犬病病毒G蛋白（RVG）以逆转录制备的cDNA为模板，扩增RVG基因，PCR产物胶回收纯化，经酶切与重组质粒pColdⅡ连接，连接产物测序正确后进一步转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定，His-Trap HP镍亲和柱纯化狂犬病病毒G蛋白，SDS-PAGE电泳及质谱鉴定。3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选、表达及中和活性鉴定以纯化的狂犬病病毒G蛋白包被ELISA板，将构建的抗体库进行“吸附-洗脱-富集”，从筛选得到的细菌集落中随机挑选单克隆，phage-ELISA鉴定。阳性克隆经序列分析后，进行表达、纯化和结合活性的初步鉴定；ELISA、荧光抗体中和试验等对表达产物进行生物学活性鉴定。研究结果1.构建全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库：采用噬菌体展示技术，经over-lap PCR扩增得到scFv基因片段约750bp，电转化导入E.coli.XL1-Blue中，构建了库容为5.0107的全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。2.狂犬病病毒G蛋白的表达：根据GenBank收录的狂犬病病毒G蛋白基因序列，设计特异性引物，以cDNA为模板扩增出RVG基因片段，扩增片段大小为1500bp，与预期相符；将扩增产物纯化与载体质粒pColdⅡ酶切后连接测序，测序正确后，转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，诱导表达，Western Blot鉴定表明为目的蛋白，SDS-PAGE电泳显示纯化后蛋白分子量大小67KD。质谱鉴定结果证明所表达的蛋白为狂犬病病毒G蛋白（rabies virus strain CTN glycoproteinGI:11528007）。3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选及表达：以纯化的狂犬病病毒G蛋白为抗原进行了五轮富集筛选，从全人源scFv噬菌体抗体库中筛选抗狂犬病病毒抗体，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率均有增加，第五轮筛选的噬菌体抗体收获率较第一轮提高了20倍；共获得4株核酸序列不同的scFv抗体，分别为scFv28、scFv70、scFv44、scFv42，初步检测后进行表达，纯化。4.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体生物学活性鉴定：通过ELISA等方法对筛选出的抗体进行初步生物学活性分析，结果表明，4株scFv抗体均可与狂犬病病毒及G蛋白特异性结合；抗体中和试验结果证实，scFv42具有中和活性。研究结论1.成功构建了全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库，库容为5.0107，为制备抗狂犬病病毒抗体奠定了基础。2.通过原核表达体系表达并纯化了狂犬病病毒G蛋白，为筛选全人源抗狂犬病病毒G蛋白抗体提供了抗原。3.筛选获得4株抗狂犬病病毒抗体，证明其中一株抗体scFv42具有中和活性，具有替代目前血源性免疫球蛋白用于狂犬病病毒暴露后治疗的潜能。
董越华[3]（2012）在《人源性抗精氨酸加压素Fab抗体的筛选、表达及初步鉴定》文中研究指明目前小分子激素的检测相对困难,这极大地影响了对复杂内分泌现象的认识和内分泌疾病的诊断。很多年来,我们对相关内分泌疾病只能通过间接推测作出诊断。如下丘脑、垂体疾病中尿崩症的诊断仅能以尿量、尿比重、尿渗透压等间接指标反映体内精氨酸加压素的水平,因此建立体内小分子激素的快速检测方法对于临床上疾病的诊治具有重要价值。由于这些激素的分子量小,半衰期短,传统制备抗体的方法如杂交瘤技术和机体免疫的方法制备抗体得到的抗体少,且工作繁琐,缺乏稳定性不宜大规模生产,因此寻找一种快速、简单制备精氨酸加压素抗体的方法是开展进一步研究的关键环节。噬菌体抗体库技术是在基因工程技术基础上发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术。它将抗体的基因型和表现型统一于一体,使其识别抗原的能力和噬菌体的扩增能力偶联起来,具有强大的筛选能力。它不需人工免疫动物,绕过杂交瘤技术,用基因工程技术制备人源性抗体,较好地解决了人杂交瘤技术低效及人体排异反应的难题,在制备难以获得的抗体方面具有很大的潜力。近些年,噬菌体抗体库技术已广泛应用于生命科学的各个领域,但利用该技术制备小分子激素抗体的报道少见。本研究以精氨酸加压素为模型分子,探索利用噬菌体抗体库技术从构建的人源性天然噬菌体Fab抗体库中直接筛选精氨酸加压素特异性Fab抗体,并进行可溶性表达及免疫活性鉴定,建立小分子激素抗体的制备方法,为下一步的临床研究奠定了基础。方法：以纯化的精氨酸加压素为靶抗原,梯度稀释浓度包被到酶标板上,应用噬菌体抗体库技术,从库容为2.4×108的人源噬菌体抗体库中筛选抗精氨酸加压素Fab抗体。采用固相筛选法,经过5轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。Phage-ELISA鉴定精氨酸加压素特异性噬菌体抗体,挑选结合活性最强的阳性克隆,制备噬菌体上清,感染大肠杆菌HB2151,经IPTG诱导高效表达,表达的可溶性抗体经SDS-PAGE、Western Blot检测鉴定抗体的表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果：经过5轮富集筛选,最终筛选出6株具有较强特异结合活性的抗精氨酸加压素抗体。其中,阳性克隆C4展示了最强的结合活性。挑选阳性克隆C4在大肠杆菌HB2151中诱导可溶性表达,表达的抗体片段经SDS-PAGE电泳和Western Blot检测,在相对分子质量约为50kD附近有特异条带的出现,同预计的目的蛋白分子量大小一致,ELISA证实该抗体片段具有较好的抗原特异性和结合活性。结论：本研究从自建的人源性Fab噬菌体抗体库中筛选出抗精氨酸加压素抗体,并对抗体的有效性进行了初步鉴定,构建了精氨酸加压素天然抗体制备技术的平台,为将来更多小分子激素快速检测方法的建立奠定了良好的基础。
任翠平,程晓虎,童晶晶,汪洁,成晓,廖法学,雷黎,刘淼,沈际佳[4]（2010）在《人源性抗日本血吸虫肌球蛋白Fab噬菌体抗体体外杀童虫作用》文中研究表明目的观察人源性抗日本血吸虫肌球蛋白Fab噬菌体抗体体外杀伤血吸虫童虫作用。方法利用日本血吸虫肌球蛋白（Sj myosin）对人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,获得抗Sjmyosin的特异性噬菌体抗体,将该抗体和巨噬细胞或补体与日本血吸虫童虫共培养,测定体外杀伤日本血吸虫童虫作用。结果将抗Sj myosin噬菌体抗体和巨噬细胞及补体与血吸虫童虫共培养时,在培养后24h即出现杀伤作用（童虫死亡率为4.69%）,48h童虫死亡率达84.06%,96h童虫死亡率达89.38%。结论人源性抗Sj myosin Fab噬菌体抗体具有体外杀伤日本血吸虫童虫活性。
周帅锋,汪世平,何卓,李林,高冬梅[5]（2010）在《Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选》文中进行了进一步梳理目的构建和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）紫外线（UV）-照射致弱尾蚴单链抗体（single chain Fv,ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原（Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa）的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显着高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率（28.0%）;日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。
李林[6]（2008）在《Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选》文中提出业已证明,日本血吸虫31/32kDa天然分子抗原,不仅是一种优势诊断抗原,可用于免疫诊断,同时也具有较好的抗雌虫生殖免疫的效果。为了对Sj31/32kDa分子抗原进一步深入分析,我们采用蛋白质组学研究技术,我们建立了日本血吸虫成虫可溶性抗原二维电泳图谱。对Sj31/32kDa附近的蛋白质斑点进行肽指纹图谱、质谱分析,在Sj31/32kDa附近获得了3个同源性较高的蛋白质斑点（11,20,23号）,分别与日本血吸虫-3-磷酸甘油脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate）、曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（Cathepsin B endopeptidase）、曼氏血吸虫肌动蛋白-2（Actine-2）相匹配。有报道表明,血吸虫组织蛋白酶B内肽酶参与对宿主血红蛋白的降解,与血吸虫的生长发育有关,具有潜在的血吸虫病疫苗价值。目前国内外尚未见对该基因研究的相关报道。研究目的确定日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（SjCB）是否能作为抗血吸虫病天然分子基因疫苗的靶标,及其在血吸虫体内是否有期特异性,获得针对日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶的特异性单链抗体,为抗血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原诊断血吸虫病的研究奠定基础。研究方法1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸虫成虫,制备成虫可溶性蛋白,经一维电泳、固相pH梯度双向凝胶电泳分离,选取31/2kDa附近的蛋白点进行质谱分析鉴定,凝胶图像分析软件对结果进行处理。2.以血吸虫cDNA文库为模板,设计引物扩增得到目的基因,亚克隆至pcDNA3.0载体;以成虫和尾蚴真核重组质粒分别免疫小鼠,观察其免疫保护性效果。3.将目的基因亚克隆至pQE30载体,将重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达融合蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag标签柱亲和纯化融合蛋白。4.用日本血吸虫成虫可溶性抗原（AWA）免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏RNA,RT-PCR法扩增得到全套VH和VL基因,经重叠PCR法扩增得到scFv片段,将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化至感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07拯救,即获得日本血吸虫成虫可溶性抗原表面呈现单链抗体库。以纯化的目的融合蛋白为靶抗原,分别筛选成虫可溶性抗原单链抗体库和UV-致弱尾蚴单链抗体库,以获得相应的特异性单链抗体。研究结果1.二维电泳结果显示Sj31/32kDa附近有13个蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定及分析,发现3个蛋白分子分别与曼氏血吸虫Actine-2,日本血吸虫3磷酸甘油脱氢酶,曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶有高度的同源性。2.真核重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示二者基因序列具有99%的同源性;动物实验结果表明重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.99%,每雌减卵率为34.45%,每克肠道减卵率为40.18%,每克肝脏减卵率为43.24%;重组质粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.36%,每雌减卵率为41.00%,每克肠道减卵率为39.30%,每克肝脏减卵率为44.87%,与对照组比较有显着差异（P＜0.05）。而重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB组和尾蚴pcDNA3.0/SjCB组减虫率和减卵率无显着差异（P＞0.05）。3.原核重组质粒成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示融合蛋白表达正确,并得以有效纯化。分别被成虫可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清识别,而不被正常鼠血清识别。4.构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,库容为4.3×108,重组率为90%,且BstNI酶切图谱呈多样性,初步筛选出了针对成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表达的融合蛋白的特异性重组噬菌体。结论1.成功构建了成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒以及成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重组质粒,成虫及尾蚴SjCB基因序列无差异;原核重组蛋白具有很好的免疫反应性。2.动物实验结果表明,成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒免疫小鼠后,能诱导产生部分抗日本血吸虫免疫的保护力,证明了日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶是抗日本血吸虫病有效的候选分子之一。3.成功构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,为抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原用于血吸虫病诊断的研究奠定了基础。
周帅锋[7]（2008）在《高效UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及Sj SCA66-68kDa ScFv的筛选》文中认为研究目的基于致弱尾蚴疫苗及天然分子疫苗高保护力的特点,利用噬菌体抗体库技术诸多的优点,构建高效日本和血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体（ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的天然分子抗原SjSCA66-68kDA的单链抗体,为进一步获取日本血吸虫候选疫苗天然分子SjSCA66-68kDA的相关编码基因奠定基础,加快抗日本血吸虫病高效天然分子基因疫苗研制的步伐。研究方法1.利用噬菌体展示技术构建高效日本血吸虫UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面对文库进行鉴定。利用UV-照射日本血吸虫致弱尾蚴多次感染BALB/c小鼠,并将无菌UV-致弱尾蚴血清,在正常尾蚴攻击感染（尾蚴数为40±2条）前以及感染后一周,三周,共三次尾静脉注射转移至BALB/c小鼠体内,45天后处死小鼠,分别计算减虫率和减卵率,确保其致弱尾蚴血清的高效性。在成功构建致弱尾蚴小鼠模型的基础上,提取小鼠脾脏RNA,用RT-PCR法扩增得到全套VH和VL基因,经重叠PCR法扩增得到ScFv片段,将ScFv片段克隆至PCANTAB 5E载体,电转化感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得的日本血吸虫UV-弱尾蚴单链抗体库。2.利用建库时所获得的高效UV-致弱尾蚴血清与日本血吸虫不同发育阶段的抗原进行免疫反应,识别和选择免疫初筛的靶分子,并对候选抗原SCA66-68天然分子免疫生化特性和序列的初步研究:通过电泳切胶、电洗脱、超滤离心和冻干等方法分离和纯化SCA66-68KDa抗原,用含SCA66-68KDa抗原PAGE胶结合微量淋巴结注射法免疫新西兰兔制备出单特异性SCA66-68KDa免疫兔血清,用ELISA和Western blot检测和鉴定其效价和特异性;通过银染色和PAS染色确定SCA66-68KDa抗原的化学性质;用N—端测序的方法研究SCA66-68KDa抗原的蛋白质序列。3.运用分离纯化的疫苗候选分子SCA66-68kDa抗原,通过抗原直接法和双抗体夹心法联合硝酸纤维膜富集法及菌落挖集法的组合策略筛选高通量的UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,用Western blot对所获得的特异性SCA66-68kDa单链抗体进行鉴定。研究结果:1.UV-照射日本血吸虫致弱尾蚴血清被动转移BALB/c小鼠,可得到42.5%减虫率,显着高于感染血清转移组的减虫率28.0%。在成功构建UV-照射日本血吸虫致弱尾蚴小鼠模型的基础上,获得了高效日本血吸虫UV-弱尾蚴单链抗体库,其的库容量测定为1.9*108,重组率100%,多样性好。2.实验发现,建库时的高效致弱尾蚴血清可识别血吸虫不同阶段抗原的66-68kDa附近有共同的识别条带,加上本室先前的研究基础,选择尾蚴66-68kDa天然分子作为免疫初筛的靶分子抗原。成功分离纯化了电泳纯及免疫纯的SCA66-68kDa抗原,并成功制备出单特异性SCA66-68KDa免疫兔血清,抗体效价高达1:12800;硝酸银及PAS不同的染色方法来确定SCA66-68KD的化学性质为一种蛋白类组分且是一种非糖蛋白;用N—测序的方法研究SCA66-68KDa天然分子的蛋白序列,结果存在N-端肽段封闭现象,提出了SCA66-68KDa天然分子的蛋白质测序的优化策略。3.通过高效UV-照射致弱尾蚴血清识别了SCA66-68kDa抗原,运用分离纯化的日本血吸虫病疫苗候选分子SCA66-68kDa对UV-照射致弱尾蚴单链抗体库进行筛选。运用抗原直接法和双抗夹心硝酸纤维膜法分别经过多轮淘洗富集,用集落挖掘法筛选致弱尾蚴单链抗体库:双抗夹心法第一轮假阳性太高,复筛没有得到阳性克隆;抗原直接法共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,将筛选获得阳性克隆转化至Ecoli HB2151菌,诱导可溶性scFv表达。经SDS-PAGE,Western blot分析,结果显示可溶性scFv获得了正确表达,且与相应抗原SCA66-68kDa特异性结合。结果表明通过抗原直接筛选法获得了特异性抗SCA66-68kDa单链抗体。结论:1.首次成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,它的构建弥补了致弱疫苗应用的局限性,为开拓新的疫苗发展策略和新疫苗的设计提供借鉴,也为进一步筛选用于血吸虫病诊断和治疗的特异性单链抗体、进行抗原表位分析和疫苗研制提供了高通量的库源。2.以候选疫苗SjSCA66-68kDa天然分子作为初筛靶抗原,成功分离纯化SjSCA66-68kDa天然分子,并对其免疫生化特性和序列进行初步研究,为进一步筛选致弱尾蚴单链抗体库提供了理论依据,也为天然分子编码基因工程疫苗的制备奠定基础。3.成功地运用抗原直接法联合硝酸纤维膜富集法和集落挖掘法筛选获得了特异性抗SCA66-68kDa单链抗体。SCA66-68kDa特异性ScFv的获得在疫苗候选分子的筛选中体现优势,为成功构建有效的抗日本血吸虫病高效天然分子的基因工程疫苗及扩大现场应用奠定基础。另外,在利用单链抗体开展免疫诊断,免疫治疗和疾病致病分子机制研究等诸多方面,显示出广阔的应用前景。
何卓[8]（2008）在《日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及在疫苗研究中的应用》文中提出研究背景:血吸虫病是一种危害严重的人兽共患病。成熟虫卵是血吸虫病的主要致病因素和传播血吸虫病的唯一因子。因此血吸虫病疫苗的研究主要集中于抗雌虫生殖、抗卵胚发育方面。近十余年来,我们课题组的研究已经证明:未成熟虫卵可溶性抗原（SIEA）免疫可诱导产生抗虫卵胚胎发育和抗雌虫生殖产卵的效果,SIEA诱导产生的体液免疫应答,在抗血吸虫病保护性免疫中起重要作用。抗SIEA免疫血清不仅与虫卵内胚胎结合,抑制和干扰卵胚的发育过程;而且还与雌虫卵黄腺及紧邻卵黄腺的肠腔内膜组织结合,使雌虫的生殖产卵功能受到影响。进一步研究发现,SIEA26-28kDa抗原分子是诱导保护性体液免疫应答的主要效应成分之一;但是SIEA26-28kDa天然分子分离纯化与批量制备困难,一直是困扰天然分子疫苗应用的难题。因此,通过获得高度特异性SIEA26-28kDa抗体作为探针筛选、分析并鉴定天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa相关的编码基因,或许是解决问题的途径之一。近几年来,噬菌体单链抗体技术的发展,为我们快速获得具有与完整抗体相同抗原结合功能的单链抗体（scFv）提供了方便。研究目的:本研究旨在获得与日本血吸虫天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa特异性结合的单链抗体,借此特异性单链抗体为探针筛选日本血吸虫cDNA文库,以期获得天然分子候选疫苗相应的编码基因。研究方法:（1）应用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟卵单链抗体库,以SIEA免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以总RNA为模板,逆转录合成cDNA第一链。以小鼠免疫球蛋白H链和L链可变区简并引物,cDNA第一链为模板,分别扩增出H链和L链可变区基因。SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得SIEA噬菌体展示单链抗体库。测定单链抗体库的库容、重组率和多样性。（2）以分离纯化SIEA26-28kDa天然分子抗原为靶,对单链抗体库进行四轮富集,运用集落挖掘法或ELISA法筛选针对SIEA26-28kDa分子的阳性克隆。将阳性克隆感染大肠杆菌HB2151,使可溶性单链抗体表达。SDS-PAGE,Western blot分别鉴定单链抗体的表达水平、分子量以及与SIEA26-28kDa的结合活性和特异性。（3）为了提高SIEA26-28kDa单链抗体的可溶性表达量,将特异性SIEA26-28kDa scFv基因序列克隆至PET32a原核表达载体,构建PET32a/scFv原核表达质粒;另一方面,为获得EGFP标记的scFv,扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因,克隆至PET32a/scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒。然后将原核重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,在大肠杆菌中诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE,Western blot分析确定单链抗体融合蛋白Trx-scFv和Trx-EGFP-scFv的表达水平、分子量以及与SIEA26-28kDa的结合活性和特异性。Trx-EGFP-scFv融合蛋白与日本血吸虫成虫和虫卵组织切片孵育,荧光显微镜观察GFP信号以评价特异性单链抗体的靶向性。（4）以高表达的特异性SIEA26-28kDa单链抗体为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,对获得的阳性克隆测序,通过NCBI的Blastn、Blastp程序进行核苷酸和蛋白质水平的同源性分析。（5）以日本血吸虫尾蚴cDNA文库作模板,扩增SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗相关编码基因的全长编码区,构建pQE30原核重组表达质粒。将重组表达质粒导入大肠杆菌M15中,诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE,Western blot对融合蛋白表达水平,分子量及免疫反应性进行分析。（6）以日本血吸虫尾蚴cDNA文库作模板,扩增SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗相关编码基因的全长编码区,构建pcDNA3真核重组表达质粒。将昆明小鼠分为生理盐水免疫组;pcDNA3空白质粒免疫组:pcDNA3/SjRPS4重组质粒免疫组;pcDNA3/SjRPL7重组质粒免疫组。分别用空白质粒、重组质粒、生理盐水免疫小鼠,免疫完毕,日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,用减虫率,每克肝、肠减卵率及每雌子宫内减卵率,对目的基因动物免疫保护性效果进行评价。研究结果:（1）构建了日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原单链抗体库,库容为2.27×107,从随机挑选的克隆中均能扩增出大小约780bp的单链抗体片段;而且BstNI酶切图谱呈多样性。（2）通过集落挖掘法筛选SIEA单链抗体库,获得了针对SIEA26-28kDa的特异性单链抗体,该特异性单链抗体分子量约为32kDa,但可溶性表达量较低。识别SIEA于26-28kDa的位置,条带单一且明显。（3）通过双酶切、PCR和测序鉴定,证实原核重组表达质粒PET32a/scFv和PET32a/EGFP-scFv构建成功。可溶性Trx-scFv和Trx-EGFP-scFv融合蛋白在大肠杆菌中均获高效表达。而且融合蛋白分子量与理论预期值完全一致,同时还保存了与SIEA26-28kDa天然分子的结合活性及特异性。EGFP标记SIEA26-28kDa单链抗体免疫荧光定位结果显示:荧光主要集中于未成熟虫卵卵胚、雌虫生殖系统及与生殖系统邻近的肠腔组织,而在雄虫的肠壁仅见微弱荧光。（4）以SIEA26-28kDa单链抗体为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,获得两个编码SIEA26-28kDa疫苗候选分子的基因:日本血吸虫核糖体蛋白S4（SjRPS4）和日本血吸虫核糖体蛋白L7（SjRPL7）。（5）双酶切、PCR和测序鉴定表明重组质粒pQE30/SjRPS4,pQE30/SjRPL7构建成功。SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组融合蛋白分子量大小与预期完全一致,并且得到了高效表达,能被特异性SIEA26-28kDa单链抗体、日本血吸虫感染鼠血清识别。不能被正常鼠血清识别。（6）双酶切、PCR和测序鉴定表明重组质粒pcDNA3/SjRPS4,pcDNA3/SjRPL7构建成功。动物实验结果表明,与对照组比较,pcDNA3/SjRPS4,pcDNA3/SjRPL7真核重组质粒免疫组减虫率、减卵率均明显高于对照组,具统计学意义。结论:（1）高质量的SIEA单链抗体库得以成功构建,其库容量大、重组率高、多样性好,可实现对疫苗候选分子特异性单链抗体的高通量筛选。（2）应用集落挖掘法筛选SIEA单链抗体库,快速获得了针对SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗的特异性单链抗体。（3）SIEA26-28kDa单链抗体具有与完整SIEA26-28kDa抗体相同的特异性、结合力及靶向性,且易于通过基因工程实现大批量生产,可完全代替完整的SIEA26-28kDa抗体,用于下一步研究。（4）特异性SIEA26-28kDa单链抗体作为探针,筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,获得了天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa相应的两个编码基因SjRPS4和SjRPL7。（5）SjRPS4-6×His和SjRPL7-6×His原核重组表达蛋白具有很好的免疫反应性;pcDNA3/SjRPS4和pcDNA3/SjRPL7免疫小鼠,均获得明显抗血吸虫病免疫保护性效果;减卵率普遍高于减虫率,表明SjRPS4和SjRPL7两基因可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗雌虫生殖方面起重要作用。为日本血吸虫天然分子SIEA26-28kDa蛋白组分中有效的疫苗候选分子。
雷黎,赵志荣,朱绍春,刘淼,卞茂红,张林杰,沈际佳[9]（2007）在《人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定》文中研究表明目的利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法RT-PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-BLOT以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定。结果噬菌体抗体库的滴度为6.2ⅹ1011/L,库容量为1.2ⅹ107,酶切鉴定结果显示噬菌体抗体库轻重链重组率达到66.6%,测序结果表明克隆入PComb3的是人免疫球蛋白轻链和重链基因,DOT-BLOT实验证明该抗体库表达了人源性的抗体,而SDS-PAGE证实了免疫球蛋白Fab段的可溶性表达。结论成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库,为筛选人源性抗日本血吸虫的抗体、研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。
雷黎[10]（2007）在《人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库的构建、鉴定及筛选》文中提出抗体技术经历了多克隆抗血清,单克隆抗体,发展到基因工程抗体阶段,其最突出的发展是噬菌体抗体库技术的建立。传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体费时费力,噬菌体抗体库技术的出现使抗体的制备产生了突破性的进展。噬菌体抗体库是以丝状噬菌体为载体,用分子克隆的方法将外源性基因插入噬菌体衣壳蛋白（pⅢ,pⅧ等）基因中,制备有扩增能力且能在表面表达某一种抗体的融合噬菌体（fusion phage）,进而经过几轮吸附—洗脱—富集后,可获得大量目的噬菌体,最终获得具有特异结合性质的抗体,并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。由于噬菌体抗体库技术绕过细胞杂交这一步,避免了杂交瘤细胞系不稳定的缺点,较好地解决了人体杂交瘤系统低效的难题,为人类单克隆抗体的制备开辟了广阔的前景,故被认为是继杂交瘤抗体之后的第三代抗体。虽然噬菌体抗体库技术应用时间较短,但在肿瘤的诊断和治疗、抗原表位分析、药物设计等多个领域显示出了巨大的发展潜能和广阔的应用前景。本研究旨在利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库,以期获得抗日本血吸虫的人源化的抗体。首先,我们用对血吸虫感染具有一定抗性成年人的血清免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,获得阳性克隆的核苷酸进行序列测定,并根据序列测定结果,选取其中一个具有完整开放阅读框架的SPI（丝氨酸蛋白酶抑制剂）,设计引物,PCR体外扩增,并将其克隆,表达,纯化,用于噬菌体抗体库的筛选。其次,利用RT-PCR方法从上述成年人的外周血淋巴细胞提取总RNA、分别扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,转化入XLI-Blue,经辅助噬菌体M13K07超感染,构建滴度为6.2×1011/L,库容量为1.2×107的人源性Fab段噬菌体抗体库,并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-ELISA以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行鉴定,结果显示成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库。然后我们再用纯化的基因重组日本血吸虫SPI蛋白,对噬菌体抗体库进行5轮的富集筛选,经ELISA实验鉴定,结果表明筛选得到人源化特异性抗日本血吸虫SPI抗体。本实验取得的结果显示以人的外周血淋巴细胞成功构建了人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库并获得了人源性抗日本血吸虫SPI抗体,为进一步研究这些抗体的免疫学特性、生物学活性和功能奠定了基础。
二、抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用（论文提纲范文）
（1）人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SCFV的国内外研究进展 |
| 1.1.1 抗体分子 |
| 1.1.2 抗体多样性依赖于基因重排 |
| 1.1.3 抗体库的类型 |
| 1.1.4 scFv的发展 |
| 1.1.5 scFv的应用进展 |
| 1.2 SCFV的表达研究进展 |
| 1.2.1 scFv的表达系统 |
| 1.2.2 scFv在毕赤酵母中的表达情况 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达菌株 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达载体 |
| 1.4 毕赤酵母的密码子偏好性 |
| 1.5 ADAM17 SCFV及 MT1-MMP SCFV |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人源单链抗体库的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、噬菌体及血液来源 |
| 2.1.2 常用的培养基 |
| 2.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用仪器 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 人淋巴细胞的分离纯化 |
| 2.2.2 人血淋巴细胞中总RNA提取 |
| 2.2.3 c DNA的合成 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 DNA片段纯化回收 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 噬菌粒p CANTAB5E与 scFv片段的连接 |
| 2.2.8 大肠杆菌TG1 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 辅助噬菌体扩增 |
| 2.2.10 辅助噬菌体的滴定 |
| 2.2.11 大肠杆菌TG1 的电转化 |
| 2.2.12 辅助噬菌体感染TG1 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 人淋巴细胞的分离纯化及总RNA提取 |
| 2.3.2 抗体VH与VL片段的获得 |
| 2.3.3 ScFv片段的获得 |
| 2.3.4 噬菌体scFv抗体库的构建 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第三章 单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒来源 |
| 3.1.2 常用培养基 |
| 3.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 常用仪器 |
| 3.1.5 引物序列 |
| 3.1.6 重组质粒与菌株 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 PCR反应 |
| 3.2.2 酶切反应 |
| 3.2.3 GS115 感受态细胞的制备 |
| 3.2.4 毕赤酵母电转化 |
| 3.2.5 毕赤酵母外源蛋白诱导表达及收集 |
| 3.2.6 酵母基因组提取 |
| 3.2.7 Western Blot |
| 3.2.8 A17-scFv(HS)的纯化 |
| 3.2.9 A17-scFv(HS)的活性检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 毕赤酵母密码子对优化软件的开发 |
| 3.3.2 ADAM17 scFv及 MT1-MMP scFv基因序列的优化 |
| 3.3.3 密码子对偏好性影响scFv的表达 |
| 3.3.4 ScFv片段密码子对优化相比于传统密码子优化的序列在毕赤酵母中的表达量高 |
| 3.3.5 同义密码子在密码子及密码子对优化序列中的使用情况不同 |
| 3.3.6 在密码子优化序列中存在许多得分低的密码子对 |
| 3.3.7 毕赤酵母表达的A17-scFv具有生理活性 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗体制备及活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究一 全人源抗狂犬病病毒 scFv 噬菌体抗体库的构建 |
| 摘要 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 狂犬病病毒 G 蛋白表达、纯化及鉴定 |
| 摘要 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究三 抗狂犬病病毒 G 蛋白 scFv 抗体的筛选、表达及中和活性鉴定 |
| 摘要 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录一：scFv 基因序列 |
| 附录二：文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录三：缩略语 |
| 附录四：在读期间发表的论文和参与的科研工作 |
| 致谢 |
（3）人源性抗精氨酸加压素Fab抗体的筛选、表达及初步鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体、宿主菌及辅助噬菌体 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液及培养基的配制 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验技术路线 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人天然Fab噬菌体抗体库的初步鉴定 |
| 1.2.2 辅助噬菌体VCSM13的扩增和滴度测定 |
| 1.2.3 原始噬菌体抗体库的扩增及滴度测定 |
| 1.2.4 抗精氨酸加压素特异性抗体的富集筛选 |
| 1.2.5 Fab噬菌体抗体的phage-ELISA检测 |
| 1.2.6 阳性克隆的测序分析 |
| 1.2.7 Fab噬菌体抗体库的可溶性表达 |
| 1.2.8 可溶性Fab抗体的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 噬菌体抗体库的鉴定 |
| 2.2 辅助噬菌体VCSM13的滴度测定 |
| 2.3 噬菌体抗体库的滴度测定 |
| 2.4 抗精氨酸加压素抗体的特异性筛选 |
| 2.5 抗原结合活性的Phage-ELISA检测 |
| 2.6 阳性克隆测序分析 |
| 2.7 阳性克隆的表达及鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 辅助噬菌体的扩增、定量和保存 |
| 3.2 精氨酸加压素抗体筛选过程中的问题 |
| 3.3 噬菌体Fab抗体在大肠杆菌内的表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（5）Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及菌种 |
| 1.2 PCR引物 |
| 1.3 紫外照射致弱尾蚴动物模型的建立 |
| 1.4 UV-致弱尾蚴血清中Ig G的测定及其无菌血清的制备 |
| 1.5 高效保护性的鉴定——被动转移试验 |
| 1.6 抗体库的构建 |
| 1.6.1 总RNA的抽提和m RNA的分离 |
| 1.6.2 c DNA第一链的合成及全套VH和VL基因的PCR扩增 |
| 1.6.3 全套VH和VL基因的扩增及Sc Fv基因的随机拼接 |
| 1.6.4 全套单链抗体Sc Fv基因的噬菌体展示 |
| 1.7 抗体库的鉴定 |
| 1.7.1 库容量及重组率的检测 |
| 1.7.2 多样性的鉴定 |
| 1.8 抗体库的筛选 |
| 1.8.1 初筛候选靶分子的选择 |
| 1.8.2 候选靶分子SCA66-68k Da抗原的分离纯化 |
| 1.8.3 疫苗候选分子SCA66-68k Da对UV-致弱尾蚴单链抗体库的富集 |
| 1.8.4 抗疫苗候选分子SCA66-68阳性克隆的筛选 |
| 1.8.4. 1 抗原直接集落挖掘法筛选阳性克隆 |
| 1.8.4. 2 可溶性Sc Fv的表达 |
| 1.8.4. 3 可溶性SCA66-68k Da Sc Fv表达的鉴定 |
| 1.8.4. 4 SCA66-68k Da可溶性Sc Fv的特异性鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 紫外灯的照射强度测定 |
| 2.2 UV-致弱尾蚴感染血清中Ig G的变化 |
| 2.3 高效保护性的鉴定——被动转移试验 |
| 2.4 小鼠脾细胞RNA质和量的鉴定 |
| 2.5 全套VH和VL基因的扩增及Sc Fv基因的拼接 |
| 2.6 Sc Fv库库容量及重组率和多样性的鉴定 |
| 2.7 多次感染UV-致弱尾蚴血清的WESTERN分析 |
| 2.8 文库的富集和筛选 |
| 2.9 表达产物的SDS-PAGE、蛋白质印迹分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于紫外线强度的测试 |
| 3.2 关于UV-致弱尾蚴血清Ig G的变化 |
| 3.3 关于UV-致弱尾蚴血清与UV-致弱尾蚴单链抗体 |
| 3.4 关于硝酸纤维素膜的富集方法与双层膜筛选系统与菌落挖集法 |
| 3.5 关于UV-致弱尾蚴单链抗体库 |
| 3.6 抗SCA-66-68k Da特异性Sc Fv的初步应用 |
（6）Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 日本血吸虫31/32kDa抗原的质谱分析及相关编码基因的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核表达质粒的DNA疫苗免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶原核质粒的构建及初步鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶融合蛋白对SjAWA单链抗体库的初步筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 血吸虫核酸疫苗候选分子的研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间主要研究成果 |
（7）高效UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及Sj SCA66-68kDa ScFv的筛选（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 技术路线 |
| 前言 |
| 第一章 高效UV-照射致弱尾蚴单链抗体库的构建与鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 SjSCA66-68疫苗候选分子的分离纯化及免疫生化特性的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 SjSCA66-68疫苗候选分子抗原对致弱尾蚴单链抗体库的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（8）日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及在疫苗研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原单链抗体库的构建与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 抗日本血吸虫病天然分子疫苗对SIEA单链抗体库的筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 特异性scFv原核高效表达质粒的构建、表达及定位 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 特异性单链抗体对日本血吸虫尾蚴cDNA文库的筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 天然分子疫苗相关编码基因原核重组质粒的构建、表达及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 天然分子疫苗编码基因真核表达质粒的构建及DNA疫苗保护性效果 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 日本血吸虫抗病免疫及疫苗研究的进展和展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间主要研究成果 |
（10）人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库的构建、鉴定及筛选（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫童虫 cDNA 文库的筛选 |
| 2.2.2 文库筛选获得阳性克隆鉴定、插入片段 DNA 核苷酸序列测定及同源性分析 |
| 2.2.3 筛选获得的日本血吸虫 SPI 基因的扩增、克隆及表达和鉴定 |
| 2.2.4 人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建、筛选与鉴定 |
| 3 结 果 |
| 3.1 日本血吸虫童虫 cDNA 文库的免疫学筛选结果 |
| 3.2 日本血吸虫 SPI 的体外原核克隆、表达 |
| 3.3 人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 从血吸虫童虫 cDNA 文库中获得富集筛选噬菌体抗体库所需抗原的理论基础 |
| 4.2 抗体的性质对文库筛选结果的影响 |
| 4.3 噬菌体抗体库建库方法的改进 |
| 4.4 噬菌体抗体库建库材料的选择 |
| 4.5 本课题尚存在的缺陷和未来的展望 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录:本人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
四、抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用（论文参考文献）
- [1]人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究[D]. 林婷. 福建师范大学, 2020(12)
- [2]全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗体制备及活性鉴定[D]. 张倩倩. 南京医科大学, 2013(S2)
- [3]人源性抗精氨酸加压素Fab抗体的筛选、表达及初步鉴定[D]. 董越华. 天津医科大学, 2012(03)
- [4]人源性抗日本血吸虫肌球蛋白Fab噬菌体抗体体外杀童虫作用[J]. 任翠平,程晓虎,童晶晶,汪洁,成晓,廖法学,雷黎,刘淼,沈际佳. 中国人兽共患病学报, 2010(12)
- [5]Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选[J]. 周帅锋,汪世平,何卓,李林,高冬梅. 热带医学杂志, 2010(08)
- [6]Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选[D]. 李林. 中南大学, 2008(01)
- [7]高效UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及Sj SCA66-68kDa ScFv的筛选[D]. 周帅锋. 中南大学, 2008(01)
- [8]日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及在疫苗研究中的应用[D]. 何卓. 中南大学, 2008(12)
- [9]人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定[J]. 雷黎,赵志荣,朱绍春,刘淼,卞茂红,张林杰,沈际佳. 中国人兽共患病学报, 2007(04)
- [10]人源性抗日本血吸虫Fab噬菌体抗体库的构建、鉴定及筛选[D]. 雷黎. 安徽医科大学, 2007(08)