一、结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较（论文文献综述）
张真[1]（2020）在《结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究》文中提出第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答,流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗在体内外均能表达。体外Western Blot检测显示,DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达,48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗激起了很好的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答;Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6 DNA疫苗强,有待进一步研究其应用价值。第二部分:卡介苗ure C基因缺失株的构建及筛选目的在MTB中ure C产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合,进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/Lox P同源重组方法对卡介苗进行遗传操作,缺失卡介苗中氮源基因ure C,打破MTB在体内原有适宜生存的微环境,促进吞噬-溶酶体成熟,筛选并获得卡介苗ure C基因缺失株,为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/Lox P同源重组的方法,将含有重组酶的p SL002质粒电转至卡介苗中,涂板,长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ure C基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒p SL001,获得目的片段,并将其电转至上述含有p SL002质粒的卡介苗,涂板后挑取单克隆,通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ure C基因的菌株,从而获得卡介苗ure C基因缺失株。结果电转至含有p SL002质粒卡介苗的目的片段,因为存在gfp蛋白,在蓝光手电筒下发绿色荧光,包括单交换与双交换两种,对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR,琼脂糖凝胶鉴定,单交换菌落在1734bp处出现条带,双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代,成功筛选出了卡介苗ure C基因缺失株,形态正确,并能够稳定传代。结论利用Cre/Lox P同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作,能够对卡介苗的基因进行无缝敲除,并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明,在此过程中采用Cre/Lox P同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间,为重组卡介苗的研究提供了便利。
薛玉芹,方强[2]（2016）在《结核病DNA疫苗研究进展》文中认为结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的以呼吸道为主的一种传染性疾病,严重危害人类健康。随着医学科学技术的发展,人类对抗TB已取得了一定的成果,包括有效的治疗药物及疫苗的研发。但同时由于Mtb耐药的严重性、人类免疫缺陷性病毒（HIV）与Mtb的双重感染及流动人口的日益增多、吸毒等,加上不少国家对TB的忽视,TB在全球范围内呈回升趋势。世界卫生组织发布的《2012年全球结核
杨爱琼,谢勇恩[3]（2015）在《结核杆菌多价核酸疫苗在小鼠体内的免疫保护效应研究》文中研究指明目的:探讨结核杆菌Ag85A/ESAT-6/CFP-10多价核酸疫苗的动物免疫保护效应。方法:将24只BALB/c小鼠随机分成4组,多价核酸疫苗免疫组每只小鼠股四头肌肌肉注射重组质粒VR1020-85A、VR1020-E6和VR1020-P10各25μg（溶于100μL灭菌生理盐水中）进行免疫接种,3周后加强免疫1次。其余3组均为对照组,分别是生理盐水注射组、空白质粒VR1020免疫组和卡介苗（mycobacterium bovis bacillus calmette-guérin,BCG）免疫组。每只小鼠于初次免疫6周后经腹腔注射结核杆菌H37Rv（菌落数为1×105）进行攻击,攻击实验28 d后取小鼠肺组织作结核杆菌培养和病理形态学检测。结果:多价核酸疫苗免疫组小鼠肺组织结核杆菌培养带菌量明显低于生理盐水注射组和空白质粒免疫组（P<0.05）,但明显高于BCG免疫组（P<0.05）。多价核酸疫苗免疫组小鼠肺组织病变明显轻于生理盐水注射组和空白质粒免疫组,但明显重于BCG免疫组。结论:结核杆菌Ag85A/ESAT-6/CFP-10多价核酸疫苗免疫小鼠后能产生一定程度的抗结核免疫保护效应,但其免疫保护效应不及BCG。
薛玉芹[4]（2013）在《结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价》文中研究表明目的：（1）构建包含密码子优化CFP10基因的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。（2）初步评价该疫苗免疫小鼠所诱导的免疫效应。方法：（1）根据小鼠和人的密码子使用偏好，使用Gene Optimizer软件对结核分枝杆菌CFP10蛋白的编码基因进行优化，但不改变其氨基酸的序列。优化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司进行全基因合成并插入真核表达载体pVAX1，构建包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o。同时，从结核分枝杆菌H37Ra株基因组中，PCR扩增天然密码子CFP10基因，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，纯化后的酶切产物CFP10基因与经同样酶切处理的真核表达载体pVAX1连接，构建包含天然密码子CFP10基因的重组质粒pVAX1/CFP10，用酶切及测序的方法鉴定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒构建是否正确。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ将质粒pVAX1/CFP10进行双酶切获得CFP10基因，亚克隆至原核表达载体pET42a（+）中，构建原核表达质粒pET42a/CFP10，转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达重组蛋白CFP10，获得的蛋白经His亲和层析柱纯化，并采用SDS-PAGE电泳和western blot对表达产物进行分析和鉴定。纯化后的蛋白再通过去细菌去内毒素试剂盒进一步纯化去除内毒素，并以鲎试验检测内毒素去除效果。（3）大量提取经鉴定正确的包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o及包含天然密码子CFP10基因的pVAX1/CFP10重组质粒，经梭华-SofastTM介导体外转染Hela细胞，并通过RT-PCR、间接免疫荧光法检测重组质粒是否能在真核细胞内表达；将pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒以肌肉注射辅以体内电穿孔的方式体内瞬时转染小鼠骨骼肌，免疫组织化学法检测其在骨骼肌细胞内的表达情况。（4）将28只SPF级BALB/c小鼠分为4组，即pVAX1/CFP10-o组，pVAX1/CFP10组，pVAX1空质粒组，NS（生理盐水）组，分别以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1质粒和NS经肌肉注射辅以体内电穿孔途径进行免疫，每2w加强免疫一次，共免疫3次。间接ELISA法检测初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中CFP10特异性抗体IgG的水平；ELISA法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠血清中IFN-γ的浓度；ELISPOT法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠脾淋巴细胞和重组蛋白CFP10共培养后产生IFN-γ的T淋巴细胞数量；流式细胞仪检测CFSE标记的末次免疫后2w（第6w）小鼠T淋巴细胞经重组蛋白CFP10刺激后的增殖动力学变化，用flowjo软件分析其增殖指数。结果：（1）构建的pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒，经酶切电泳鉴定均分别于约3000bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列均分别与设计的CFP10优化基因和结核分枝杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。（2）成功构建pET42a/CFP10质粒,经酶切电泳鉴定分别于约5900bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列与结核杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。转化有重组质粒的BL21（DE3）经过0.1mmol/L IPTG、37℃诱导6h，高效表达了占菌体蛋白总量40%的可溶性融合蛋白，经His亲和层析柱纯化后的相对分子量约为37KD的蛋白能与CFP10多克隆抗体发生特异性的结合反应，经ToxinEraserT M去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（3）质粒转染真核Hela细胞后经RT-PCR检测结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒组均得到预期的目的条带；间接免疫荧光结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒转染的Hela细胞均可见特异性绿色荧光，且pVAX1/CFP10-o组荧光强度高于pVAX1/CFP10组，空质粒pVAX1组和NS组未见特异性绿色荧光；质粒转染小鼠骨骼肌细胞后免疫组织化学结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠肌肉组织内均有棕黄色阳性颗粒，pVAX1/CFP10-o组多于pVAX1/CFP10组，pVAX1组和NS组未见明显的棕黄色阳性颗粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平检测显示随免疫次数的增多呈上升趋势，在相同的免疫时间内，pVAX1/CFP10-o组高于pVAX1/CFP10组。末次免疫后2w（第6w），两组IgG抗体水平达到最高，且pVAX1/CFP10-o组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.05），pVAX1/CFP10组高于pVAX1组及NS组（p﹤0.05），而pVAX1组和NS组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平差异无统计学意义（p﹥0.05）；pVAX1/CFP10-o组小鼠血清IFN-γ浓度明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.01），pVAX1/CFP10组小鼠血清IFN-γ浓度高于pVAX1组及NS组（p﹤0.01），而pVAX1组和NS组小鼠血清IFN-γ浓度差异无统计学意义（p﹥0.05）；ELISPOT结果显示pVAX1/CFP10-o组斑点数明显多于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.01），pVAX1/CFP10组斑点数多于pVAX1组及NS组（p﹤0.01），而pVAX1组及NS组斑点数差异无统计学意义（p﹥0.05）；各组T细胞的增殖指数检测显示pVAX1/CFP10-o组（2.89±0.39%）明显高于pVAX1/CFP10组（2.06±0.16%）（p﹤0.05），pVAX1/CFP10组明显高于pVAX1组和NS组（p﹤0.05），而pVAX1组和NS组之间差异无统计学意义（p﹥0.05）。结论：（1）成功构建了包含CFP10基因密码子优化结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密码子的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10。（2）成功高效原核表达了可溶性CFP10重组蛋白并获得了无内毒素的纯化蛋白。（3）转染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌均可有效表达CFP10蛋白，且转染pVAX1/CFP10-o质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌表达CFP10蛋白的效果更佳。（4）结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10均可诱导BALB/c小鼠产生CFP10特异性的体液免疫和细胞免疫应答，且pVAX1/CFP10-o DNA疫苗诱导产生的CFP10特异性的免疫应答水平更高。
丁珍珍[5]（2011）在《结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察》文中提出目前世界结核病的形势依然十分严峻,而耐药性结核病正处于创纪录水平.卡介苗（BCG）是目前世界上唯一可应用的抗结核疫苗,但其效果呈现一个较大范围（0%-85%）的波动,且不能预防成人型肺结核。与传统疫苗相比,基因疫苗有其独特的优点,然而单独基因疫苗所引起的效应并不比卡介苗显着。现在有很多实验应用了:一种表达免疫调节因子的质粒,另外一种表达病原体的保护性抗原的质粒,这两个质粒同时免疫给动物身上,想要通过细胞因子的佐剂作用和免疫调节作用去提高和增加动物体内的特异性免疫应答反应,产生高效的免疫保护结果。Ag85A是结核分枝杆菌及BCG分泌的蛋白成分之一,能诱导强烈的细胞免疫反应。不断发展后天获得的细胞免疫对控制结核病是十分关键的。而细胞免疫的关键细胞因子是IFN-γ,能够刺激感染的巨噬细胞诱导产生吞噬溶酶体并杀死细胞内的细菌。IL-12和IL-18是DC细胞产生的、诱导Thl型细胞增殖分化的关键细胞因子,人类和小鼠因缺乏IL-12的P40链或者受体,故对结核菌有高度易感性。表达IL-12或IL-18的质粒已经在几个感染模型中作为佐剂使用。同时给予表达IL-12或IL-18的质粒增强了Ag85B DNA疫苗的IFN-γT细胞反应,但是仅仅表达IL-12的质粒增强了保护效应。本篇实验研究使用结核分枝杆菌的保护性的抗原:Ag85A的基因真核表达质粒了,与人IL-12（PORF-hIL-12）的真核表达质粒一起去同时免疫小鼠,观察这两者在小鼠身上所诱导出来的的细胞免疫。目的:构建一种编码结核分枝杆菌的Ag85A分泌蛋白真核表达质粒,观察其与人白细胞介素12（hIL-l2）联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:1.构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增出Ag85A的编码基因,用限制性的内切酶消化后,插入到克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定、序列测定证实后,再以亚克隆法连接于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。2.动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组（联合免疫组）;②Ag85A基因疫苗组;③BCG组（阳性对照）;④空载体组（阴性对照）;⑤PBS组（空白对照）。基因疫苗、空载体和PBS经肌肉内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,一共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次,每只注射约0.3ml。等到第三次免疫小鼠后的28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,再用ELISA法检测脾细胞的培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞的杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖活性。结果:1.成功构建了结核分枝杆菌Ag85A基因的DNA疫苗。2.联合免疫组能够诱导出比较强烈的抗原特异性Thl型细胞免疫,免疫小鼠的脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2水平显着高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,而IL-4分泌减少;特异性CTL的杀伤活性明显增强了;淋巴细胞的增殖活性也明显高于了其他的组别。结论:hlL-12质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠细胞免疫应答。
陆云芝[6]（2010）在《重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究》文中提出结核病（Tuberculosis, TB）是一种古老而漫长的感染性疾病,是长期危害人类健康的严重疾病之一。目前,全球大约有三分之一的人口感染了结核杆菌,每年约有300万人死于结核病,平均每天死亡超过8000人。近年来,由于HIV和结核分枝杆菌双重感染,以及耐药结核分枝杆菌的流行,导致结核病的发病率和死亡率大幅度上升,形势更加严峻。联合国已将结核病列为21世纪重点控制的三大疾病之一。卡介苗（BCG）作为唯一的能够预防结核病的疫苗,虽然已在全球广泛使用,但近期发现其保护效果不稳定（0-80%）,对成人几乎无效,对已感染患者更是没有治疗作用,因此研制新型的抗结核疫苗刻不容缓。预防性疫苗和治疗性疫苗是新型抗结核疫苗的两个主要发展策略,其中预防性疫苗研究得较多,包括DNA疫苗、蛋自疫苗、重组BCG疫苗、营养缺陷型疫苗、病毒载体疫苗等。本实验针对重组BCG进行研究,通过将一些重要的结核杆菌抗原基因导入BCG,让BCG大量表达保护性抗原,以期诱导比BCG强大而又持久的免疫保护力。Ag85B和ESAT-6作为重要的抗结核保护性抗原已得到各国科学家公认,研究表明重组入Ag85B-EAST6的BCG （rBCG::Ag85B-EAST6）提高了抗结核保护作用。此外,重组多价抗原疫苗往往能够比单一抗原疫苗激发更强的免疫反应,因此本实验在选择了保护性抗原Ag85B-EAST6融合抗原的基础上又选择了另外两种保护性抗原,PPE蛋白Rv2608（PPE42）和Esx家族成员Rv3620c （EsxW）,分别与Ag85B-ESAT6融合抗原联合,以大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV261为载体,构建了两株重组BCG菌株rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c,均为国内外首次报道。将两株重组BCG和传统BCG疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,通过ELISA检测了抗体IgG水平IgG2b/IgG1水平和细胞因子（IFN-γ、 IL-2、IL-10等）分泌水平,用ELISPOT检测了TNF-α阳性淋巴细胞水平,并用流式细胞仪检测了CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群水平,分析比较各菌株的免疫原性。结果表明,与传统BCG相比较,两株重组BCG均可增强小鼠脾淋巴细胞在特异性抗原Ag85B和PPD刺激下细胞因子TNF-α和IL-2分泌水平,降低细胞因子IL-10分泌水平,显示出更强的细胞免疫应答。同时,与传统BCG相比较,rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c诱导小鼠脾淋巴细胞产生更多的细胞因子IFN-γ,进一步增强Thl型细胞免疫反应。流式检测结果表明,两株重组BCG均可引起小鼠脾淋巴细胞特异性抗原Ag85B和PPD刺激下CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群分化水平提高,而CD4/CD8比值减小,显示重组BCG能通过增强细胞毒作用提高机体的抗结核免疫保护作用。此外,两株重组BCG均可引起抗原Ag85B特异性的体液免疫反应,与传统BCG相比较,表现为Ag85B特异性IgG水平的升高,并测得IgG2b/IgG1水平也升高,显示Thl型免疫应答增强,与细胞免疫反应结果一致。因此,初步研究表明这两株重组BCG有望开发成为有效的新型抗结核疫苗用于结核病的预防,为进一步的动物保护实验等奠定了基础。
姚万红[7]（2009）在《蛋白转导结核DNA疫苗的实验研究》文中指出结核病（tuberculosis, TB）是一种严重危害人类健康的传染病,近年来世界范围内不少地区结核病的发病率和死亡率再度增高。BCG虽然一直被广泛应用于预防结核病,但其保护效果并不稳定,对成人肺结核的保护效应十分有限,而且BCG自身还有着一些难以克服的应用局限性。因此,发展安全、高效的新型结核疫苗已成当务之急。在众多新型抗结核疫苗的研究中,DNA疫苗以其众多的突出优点成为国内外结核疫苗研究的热点之一。自1994年Silva等人率先开展抗结核DNA疫苗的研究以来,迄今已有数十种抗结核DNA疫苗在临床前动物模型试验中表现出良好的效应。遗憾的是,虽然这些疫苗在小动物模型中表现良好,但其在大动物和高等灵长类动物中的表现却常常达不到预期水平。然而,新近四种兽用DNA疫苗的获准面世和DNA疫苗在肿瘤、艾滋病和疟疾等疾病的临床试验中的良好表现再次证明了DNA疫苗在疾病预防和免疫治疗中的应用前景。因此增强结核DNA疫苗的免疫效应成为当前该领域研究的热点。在众多强化DNA疫苗的措施中,蛋白转导（protein transduction）技术的应用是一项较为新颖和较有希望的方式之一。研究表明,来源于几种α-疱疹病毒,如单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus, HSV-1）、牛疱疹病毒Ⅰ型（bovine herpes virus, BHV-1）、马立克氏病病毒Ⅰ型（MDV-1）和伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）的间质蛋白VP22具有高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的能力,这种现象被称为“蛋白转导”。进一步的研究发现这些具有蛋白转导能力的VP22分子还能够有效地携带异源蛋白质、多肽和核酸等多种物质进入各种细胞,并介导上述物质从转染的细胞向邻近的细胞间传递,同时保留与之共转运物质的生物学活性和功能。不仅如此,许多研究证实,这些VP22分子还具有明显的免疫佐剂功能,能够显着增强常规DNA疫苗、“自主复制型”RNA疫苗、“自杀性”DNA疫苗、重组病毒载体疫苗的免疫效应以及重组DNA疫苗和重组腺病毒疫苗介导的基因治疗效果。其中,牛疱疹病毒Ⅰ型VP22（BVP22）是迄今发现的具有最强蛋白转导活性的天然分子,在疫苗和基因治疗的研究中具有很高的开发价值和应用潜力。BVP22是否也具有增强结核DNA疫苗的免疫效应的能力?这方面的研究尚未见报道,对该问题的研究不仅可以拓宽蛋白转导技术的应用范围,而且还有望为提高结核DNA疫苗的免疫效应和保护效应提供新思路。抗原85B（Ag85B）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染过程中的重要免疫保护性抗原之一,广泛应用于结核新疫苗的研究中。研究表明,无论是编码Mtb单一Ag85B的质粒或是Ag85B与Mtb其它保护性抗原多基因融合表达的质粒免疫小鼠／豚鼠,都可以诱导有效的免疫应答,并显着减少实验动物脾肺脏器中的荷菌数,延长实验动物的生存时间。不仅如此,研究发现编码MtbAg85B的DNA疫苗还具有较好的免疫治疗效应。鉴于上述研究背景,我们选择了Mtb的Ag85B基因和具有最强蛋白转导效应的牛疱疹病毒Ⅰ型的VP22（BVP22）基因作为本研究的目的基因,构建了BVP22基因与MtbAg85B基因融合表达的DNA疫苗,并观察了该疫苗在C57BL/6小鼠中所诱导的免疫效应和对结核杆菌H37Rv毒株感染的保护效应,对蛋白转导分子BVP22应用于增强结核DNA疫苗效应的可能性作出评价。本实验包括两个部分：第一部分结核杆菌Ag85B与牛疱疹病毒Ⅰ型VP22（BVP22）融合基因疫苗的构建及其免疫学特性研究目的：构建编码结核杆菌Ag85B的DNA疫苗和Ag85B基因与蛋白转导分子BVP22基因融合表达的DNA疫苗,并对两种疫苗的免疫学特性进行比较研究。方法：1、用分子生物学技术构建真核表达质粒pcAg85B, pcBVP22, pcBVP22-Ag85B和表达Ag85B的原核表达质粒pET-Ag85B。经限制性核酸内切酶酶切反应及序列测定证实构建正确后,将纯化的真核表达质粒体外转染HeLa细胞,用RT-PCR和Western blott检测重组质粒在真核细胞中的表达。2、大量制备纯化的真核表达质粒pcAg85B、pcBVP22-Ag85B、pcBVP22和空白载体pcDNA3.1（+）,肌肉注射免疫雌性C57BL/6小鼠,连续3次,每次间隔2周。设置相应阴性对照PBS对照组,空载对照组和pcBVP22对照组以及阳性对照BCG组。于末次免疫后六周剖杀小鼠,间接ELISA法检测血清中Ag85B特异性的抗体水平；MTT法检测脾脏中的淋巴细胞特异性增殖能力；ELISPOT检测脾淋巴细胞中分泌IFN-γ和IL-4的T细胞数量,以期对两种质粒的免疫效果作出比较。结果：1、经过限制性核酸内切酶酶切反应及DNA双向测序证实,pcAg85B和pcBVP22-Ag85B融合表达质粒构建成功。真核细胞转染试验证实,两种质粒都能够在HeLa细胞中转录和表达相应的mRNA及蛋白质；2、肌注免疫C57BL/6小鼠后,质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B均能在小鼠体内有效地诱导体液免疫和细胞免疫应答,均可使小鼠体内的抗原特异性抗体滴度和抗原特异性淋巴细胞增殖能力显着高于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组水平（P<0.05）；pcAg85B和pcBVP22-Ag85B二组之间的差异也具有显着性（P<0.05）,后者虽略低于BCG组水平,但经统计学分析差异无显着性（P>0.05）；ELISPOT检测结果显示,在pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠的脾脏中分泌IFN-y的淋巴细胞的数量显着多于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组（P<0.05）；pcBVP22-Ag85B免疫组IFN-y的分泌细胞的数量明显多于pcAg85B免疫组,略低于BCG组,但经统计学分析二组之间无显着性差异（P>0.05）。在两种质粒和BCG免疫的小鼠的脾脏中检测到的IL-4生成细胞的数量与PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组相比,差异无显着性（P>0.05）。结论：pcAg85B和pcBVP22-Ag85B两种质粒在C57BL/6小鼠体内均可诱导有效的细胞免疫和体液免疫应答,且融合表达的pcBVP22-Ag85B质粒所诱导的免疫效应均高于单表达结核抗原的pcAg85B。我们推测这种现象可能与BVP22分子的细胞间传递功能有关,BVP22有可能通过携带Ag85B在多种细胞内外“穿梭”,提高了抗原分子在体内进入细胞的能力和抗原呈递的作用,从而增强Ag85BDNA疫苗的免疫原性,其详细机制尚有待进一步的研究。第二部分结核杆菌Ag85B与牛疱疹病毒Ⅰ型VP22（BVP22）融合基因疫苗对结核杆菌感染的保护效应研究目的：建立小鼠结核病模型,探讨重组质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B对结核分枝杆菌感染机体的保护效应。方法：按第一部分所述方法免疫C57BL/6小鼠。基因免疫结束6周后,每组随机挑选12只小鼠在ABSL-3 （Animal Biosafety Level-3 Laboratory）实验室中经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv（感染剂量：8×106CFU/只）。攻毒后观察各实验组小鼠一般生存状态、死亡发生时间以及小鼠半数死亡时间（T5o）,于感染后35天解剖小鼠（含35天以内死亡冻存的小鼠）。取小鼠的脾及部分肺组织,用来做脏器组织中结核杆菌的荷菌量的观察；另一部分肺组织用来观察各组之间的组织病理学改变,切片做HE染色和抗酸染色检查；同时从每个实验组各取2只存活小鼠以及2只正常未感染小鼠,取脾分离淋巴细胞,经FITC和PE标记后用流式细胞仪检测脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率。通过上述指标的观察,对pcAg85B和pcBVP22-Ag85B的抗感染保护效应作出评价。结果：攻毒后头2周,各实验组小鼠在进食、饮水以及体重方面无明显差异,自攻毒后第三周始,PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠开始出现进食减少,精神萎靡,体重减轻等现象,并分别于静脉攻毒后第17天、19天和18天开始出现死亡,而质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠分别于攻毒后第24和30天开始出现死亡。至感染后第35天时,阴性对照PBS组小鼠存活2只,空载对照组存活2只,pcBVP22组存活3只,pcAg85B免疫组小鼠存活5只,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠存活9只,BCG免疫组小鼠全部存活。pcAg85B和pcBVP22-Ag85B两种质粒免疫组小鼠的半数死亡时间均超过PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组一周以上,pcBVP22-Ag85B组小鼠的半数死亡时间又超过pcAg85B免疫组一周以上。小鼠脾、肺组织中细菌计数结果显示：pcAg85B免疫组小鼠脾、肺组织中细菌计数（1og10CFU）分别为5.3328±0.1031和5.3174±0.0276,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠脾、肺组织中的细菌计数分别为5.0031±0.0774和4.9313±0.0592,显着低于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组（分别为6.0065±0.0482、5.9443±0.0345；6.0039士0.0191、5.9362±0.0192；5.9794±0.0559、5.9416±0.0312,P<0.05）。其中,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠脾、肺组织中的细菌计数虽略高于BCG免疫组小鼠的相应组织中的细菌计数（4.8669±0.1252、4.7813士0.1129）,但差异无显着性（P>0.05）。各实验组肺组织HE染色结果显示：PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠的肺组织出现广泛性充血、渗出、坏死和实变,肺泡结构消失,有明显肉芽肿结节形成,病变周围有较多炎性细胞浸润。而在质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠的肺组织中病变明显减轻,部分肺泡组织消失,可见炎性渗出及轻度肉芽肿反应,但未见明显坏死。在BCG免疫组小鼠的肺组织中肺泡结构基本完整,伴有少量炎性反应。各实验组抗酸染色结果与HE染色结果相似：在PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠的肺组织中结核杆菌数量众多,呈弥漫性簇状或片状分布；在质粒pcAg85B免疫组小鼠的肺组织中结核杆菌呈小片状散在分布,数量较阴性对照组明显减少；在pcBVP22-Ag85B和BCG免疫的小鼠的肺组织中结核杆菌呈零星散在分布,数目稀少。流式细胞术检测结果显示：与正常未感染小鼠相比,结核杆菌感染导致小鼠脾内CD4+CD25+T细胞的百分率明显升高（14.2%vs0.4%）。质粒pcAg85B, pcBVP22-Ag85B以及BCG免疫接种均降低了感染小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞的百分率,三组分别为1.2%、0.9%、0.6%,与PBS对照组相比差异显着。与质粒pcAg85B组相比,pcBVP22-Ag85B质粒组小鼠脾细胞中的CD4+CD25+T细胞的百分率进一步降低,但仍略高于BCG组。结论：与阴性对照组相比,两种质粒（pcAg85B和pcBVP22-Ag85B）免疫均可显着抑制结核杆菌在小鼠脾、肺组织中的繁殖,明显减轻小鼠肺组织中的病理反应,延长小鼠生存时间,有效保护实验小鼠抵抗结核杆菌H37Rv毒株的攻击感染。与BVP22融合表达的DNA疫苗的保护效应明显超过单表达Ag85B的DNA疫苗,其保护效应接近于BCG。此外,DNA疫苗接种和BCG接种均可减少感染小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率,融合表达的DNA疫苗比单表达Ag85B的DNA疫苗作用更明显。我们推测融合表达的DNA疫苗在小鼠中表现出较单表达结核杆菌Ag85B的DNA疫苗更好的保护力可能与融合表达的DNA疫苗免疫原性更强有关。此外,融合表达的DNA疫苗的更好表现是否还与它能进一步降低小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率有关?我们的推测尚有待进一步的研究证实。
王大南[8]（2009）在《口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道IEL亚群及其生物学活性的变化》文中研究说明目的今年年初世界卫生组织发布的《2009年全球结核病控制报告》中指出,目前全球结核菌感染人数超过20亿,其中结核病患者或可能发病者约占1/10。我国约有5.5亿人已经感染结核杆菌,现有活动性肺结核患者约450万。全世界耐多药/广泛耐药结核病例数约为50万,我国是其中总数排名前五位的高负担国家之一。目前卡介苗（BCG）作为唯一临床使用的疫苗,预防效果并不稳定。因此研制新疫苗成为当前结核病防治的首要任务。BCG作为一种减毒活疫苗,除用于预防结核病外,也作为一种强的非特异性细胞免疫刺激剂,用于肿瘤（如膀胱癌等）的治疗。研究还证明BCG与动物和人等一些肿瘤细胞间存在着共同抗原。但BCG灌注治疗膀胱癌的毒副作用也常使部分患者因不能耐受其副作用而不得不终止BCG灌注治疗。Ag85复合物是由A、B、C三种成分组成,存在于结核杆菌和BCG等分枝杆菌的细胞壁及培养滤液中。在BCG Ag85的三种成分中Ag85A所占的比例最大,而且多项研究表明Ag85A抗原是一种十分重要的免疫保护性抗原。近年来的研究表明,Ag85A可使小鼠脾CD8+CTL的细胞毒活性增强,可刺激机体Th1型细胞因子,如IL-2、IFN-γ、TNF-α等的产生水平升高;促进NK细胞、单核-巨噬细胞等对肿瘤细胞的杀伤作用。但由于结核分枝杆菌生长缓慢,并且需要较复杂生长条件,从细菌菌体中提取Ag85A蛋白易发生凝集和降解,更难于纯化。同时Ag85A作为一种异种蛋白质长期使用仍有可能发生变态反应等不良反应。1996年Huygen等首次报道用结核分支杆菌Ag85A编码基因的质粒DNA经肌肉接种途径免疫小鼠,可诱导小鼠产生很强的细胞和体液免疫应答,抵御结核分支杆菌的攻击。自90年代初首次报道应用DNA疫苗进行免疫以来,大量的研究已经显示了DNA疫苗的实际效果和广阔的应用前景。近些年来已将DNA疫苗的应用研究扩展到了抗感染、抗肿瘤、治疗变态反应性疾病和自身免疫病及降低组织器官移植排斥反应等多个领域。DNA疫苗可经多种途径（如粘膜、皮肤和肌肉等）和采用多种方式（如口服、喷雾和注射等）接种,依据所含目的基因及表达产物的不同可致机体产生免疫应答上调或下调及免疫应答的类型不同。经口服进行DNA疫苗接种是一种简便、易于被人们接受的方式。但口服DNA疫苗在黏膜局部的表达情况和诱导局部的免疫细胞,特别是IEL的变化,目前尚不清楚。为此,我们采用经口灌饲的方式给小鼠投与自制的Ag85A DNA疫苗,在观察肠道局部细胞表达的基础七,对其诱导的IEL亚群及生物学功能的变化进行了研究,目的是探讨经口服途径接种分枝杆菌Ag85A DNA疫苗有否预防和治疗效应。材料与方法1、重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的构建采用PCR技术扩增Ag85A基因片段,与真核表达pcDNA3.1/myc-hisA质粒载体连接成重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A,再转化至大肠杆菌DH5α,于-70℃保存备用。2、Ag85A DNA疫苗的制备采用V-gene无内毒素型超纯质粒DNA制备试剂盒分离纯化pcDNA3.1/mychisA-Ag85A重组质粒。采用电穿孔转化法将pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒转化到减毒伤寒沙门氏菌ST7207菌苗,经大量培养细菌制成由减毒伤寒菌苗携带的Ag85ADNA疫苗。同时将纯化的pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒用脂质LipofectamineTM 2000包裹,制成脂质体包裹的Ag85A DNA疫苗。3、动物分组与免疫检测Ag85A DNA疫苗诱导小鼠肠IEL亚群的变化:将C57BL/6小鼠随机分成3组,即重组质粒组、空质粒组和正常对照组。每只鼠免疫3次,前二次免疫间隔10天,后二次免疫间隔14天。重组质粒组前二次经口灌饲脂质体包裹Ag85ADNA疫苗,后一次经口灌饲减毒伤寒菌-Ag85ADNA疫苗。同样方法分别给后二组小鼠口灌饲减毒伤寒菌-pcDNA3.1菌和生理盐水作为对照。末次免疫后3周检测IEL亚群。检测Ag85A DNA疫苗诱导小鼠肠IEL的生物学功能变化:将C57BL/6小鼠随机分成3组,即重组质粒组、空质粒组和正常对照组。每只鼠免疫2次,间隔2周。重组质粒组经口灌饲减毒伤寒杆菌-Ag85A DNA疫苗菌液;空质粒组和正常对照组以同样方法分别经口灌饲减毒伤寒杆菌-V1Jns.tPA菌和生理盐水。末次免疫后的第1、3、6、9和12d处死小鼠进行IEL生物学功能检测。4、IEL的分离去小鼠全部小肠,翻转,截成数段,清洗干净;加消化液于37℃恒温振荡;静置片刻后,去含游离细胞的上层液通过纱布及玻璃棉柱,再用淋巴细胞分层液分离。5、IEL细胞亚群的检测采用流式细胞分析仪分析测定T细胞亚群。6、IEL的培养将IEL调成所需细胞浓度,加终浓度为5μg/ml Ag85A蛋白孵育48小时,离心收集培养上清液,用于细胞因子的测定。7、细胞因子的检测采用生物活性测定法（依赖细胞株检测法）检测IEL培养上清中的IL-2;采用双抗体夹心ELISA法检测IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β。8、FasL分子表达的检测提取IEL总RNA,采用半定量RT-PCR技术检测FasL mRNA的表达。FasLmRNA的表达水平用所测定的扩增产物FasL的电泳条带密度与β-actin电泳条带密度的比值表示。9、细胞毒活性检测采用放射核素释51Cr释放法。将IEL先用丝裂霉素处理的转染Ag85A cDNA的p815细胞刺激,然后与靶细胞(51Cr标记的P815细胞)共孵育一定时间,用γ计数仪测定培养上清中的放射活性cpm值。计算细胞毒活性。计算公式:细胞毒活性（%）=（IEL孔释放cpm值-自然释放孔cpm值/最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值）x100%10、细胞增殖活性检测采用放射性核素[3H]thymidine摄入法检测IEL的增殖活性。将IEL用终浓度为5μg/mlAg85A蛋白刺激培养,培养过程中加入[3H]thymidine,将培养的细胞收集细胞至玻璃纤维滤膜上,将玻璃纤维滤膜放入液体闪烁液内,用β液体闪烁计数仪测定cpm值。计算刺激指数公式:刺激指数=实验孔cpm值-空白对照孔cpm值/空白对照孔cpm值。11、肠组织SIgA水平测定采用SIgA放免分析试剂盒测定肠组织SIgA水平。剪取小肠中段约5cm,纵行剖开,洗净剪碎,每克肠组织加入10ml生理盐水,制成匀浆,离心取上清液。然后按说明书进行测定。结果1、转化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA减毒伤寒沙门氏菌成功。2、IEL亚群的检测结果流式细胞分析技术检测结果显示,重组质粒组的CD3+IEL数量为（5.89±1.15）x106,空质粒组为（5.55±0.97）x106,正常对照组为（5.32±1.10 x106）。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的CD3+CD4+IEL比例为39.65±5.46%,空质粒组为39.78±4.32%,正常对照组为38.92±3.46%。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的CD3+CD8αβ+IEL和CD3+CD8αα+IEL比例分别为27.25±1.98%和50.75±4.82%,较空质粒组（21.37±3.82%和41.08±3.98%）和正常对照组（19.80±0.82%和39.35±4.32%）均见明显差异（P<0.05）。重组质粒组的TCRαβ+IEL比例为42.73±2.25%,空质粒组为44.24±2.01%,正常对照组为42.38±1.34%。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的TCRγδ+IEL比例为38.21±2.82%,较空质粒组（32.08±0.98%）和正常对照组（31.35±4.32%）均见明显差异（P<0.05）。CD40L+IEL和CD45+IEL亚群的检测结果各组间未见明显差异（P>0.05）。FasL+IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显着降低,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD103+IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显着升高,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD25+IEL和Foxp3+IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显着降低,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD19+IEL亚群的检测结果各组间未见明显差异（P>0.05）。3、IEL细胞培养上清中细胞因子检测结果采用依赖细胞株生物学活性测定法检测IEL培养上清中IL-2水平的结果显示,重组质粒组小鼠于末次免疫后第6天即出现明显升高（6679±793cpm）,第9天水平最高（10,806±1,293cpm）,与空质粒组（1,075±186）和正常对照组（308±59）比较差异显着（P<0.01）。用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β水平的结果显示,重组质粒组小鼠于末次免疫后第6天IEL的IFN-γ水平（198.78±12.35 pg/ml）,与空质粒组（75.88±6.03 pg/ml）和正常对照组（53.56±4.85）比较差异显着（P<0.01）。重组质粒组第6天IL-10出现明显升高（35.76±2.78pg/ml）,与空质粒组（13.98±1.12 pg/ml）和正常对照组比较差异显着（P<0.05）。TGF-β也于第6天达高峰（116.56±2.33 pg/ml）,与空质粒组（19.54±2.05pg/ml）和正常对照组（21.66±0.88 pg/ml）比较均差异显着（P<0.01）。空质粒组和正常对照组之间IL-10和TGF-β的检测结果均未见有意义的差异（P>0.05）。IL-4水平在各组间均未见明显差异（P>0.05）。4、FasL mRNA的表达结果通过半定量RT-PCR技术检测小鼠iIEL FasL mRNA的表达结果显示,末次免疫后第8天,重组质粒组FasL mRNA平均表达水平（0.61±0.25）,与空质粒组（0.28±0.087）和正常对照组（0.19±0.13）均有升高（P<0.05）;空质粒组与正常对照组之间未见有意义的变化（P>0.05）。5、IEL特异性细胞毒活性检测结果检测末次免疫后第9天IEL特异性细胞毒活性,结果显示Ag85A重组质粒免疫组IEL细胞毒活性为67.35±5.56%,空载体组为14.89±3.73%和生理盐水组为10.26±3.3 1%。前组较后2组有显着增高（P<0.05）,而后2组组之间也无显着意义（P>0.05）。6、IEL细胞增殖检测结果应用[3H]thymidine参入法检测IEL经Ag85A特异性刺激后的增殖活性,结果显示测得的cpm值在重组质粒组所检测的时间点均有升高,末次免疫后第6天（3608±372）和第9天（3536±298）cpm值更高,与第6天测得的空载体组（598±79）和正常对照组（675±67）比较差异显着（P<0.01）,而后2组组之间也无显着意义（P>0.05）。提示IEL经Ag85A特异性刺激后的增殖活性显着升高。7、肠组织中SIgA产生水平检测结果应用放射免疫法测定小鼠肠组织中SIgA含量,结果显示重组质粒组SIgA的含量为0.38±0.05 ng/ml,空质粒组为0.24±0.04 ng/ml,正常对照组为0.2±0.09ng/ml。重组质粒组较较空质粒组和正常对照组为呈现有意义的升（P<0.05）。而空质粒组和正常对照组之间未见有意义的区别（P>0.05）。结论1、转化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA减毒伤寒沙门氏菌成功。2、经口接种Ag85A DNA疫苗诱导了CD3+CD8αβ+IEL、CD3+CD8αα+IEL、CD3+TCRγδ+IEL和CD103+IEL的比例升高,CD25+IEL和Foxp3+IEL比例降低,CD3+IEL和CD3+TCRαβ+IEL的数量未见明显变化,提示经口途径投与Ag85A DNA疫苗可能主要诱导CD8+CTL介导的细胞免疫应答,而不是诱导免疫耐受。3、经口接种Ag85A DNA疫苗可诱导IEL的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β分泌水平增加;IL-4水平无变化;特异性细胞毒活性增强;FasL表达增加;IEL特异性增殖活性增强;SIgA分泌水平增加。提示主要诱导Th1型细胞因子介导的细胞免疫应答。
梁艳[9]（2008）在《结核分枝杆菌DNA疫苗单独或联合治疗小鼠结核病模型的研究》文中研究表明目的:研究Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗和Ag85A DNA疫苗单独或联合化疗对小鼠药物敏感或耐多药结核病的治疗效果,为建立结核病尤其是耐多药结核病的免疫治疗新策略和新方案奠定基础。方法:1.采用分枝杆菌传统药物敏感试验和分子药敏试验方法筛选、鉴定结核分枝杆菌（M. tb）耐利福平（RFP）和异烟肼（INH）的临床分离株。2.结核分枝杆菌Ag85A/ESAT6嵌合DNA单独或联合化疗治疗小鼠结核病。采用菌量为2.5×106 CFU利福平和异烟肼敏感的M. tb HB240-1菌悬液经尾静脉感染80只雌性BALB/c小鼠,感染后第3天将小鼠随机分为下列8组进行治疗:（1）生理盐水组;（2）pVAX1载体组;（3）RFP组;（4）Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP组;（5）RFP和INH组;（6）Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP和INH组;（7）Ag85A/ESAT6 DNA组;（8）HSP65 DNA组。每只小鼠肌肉注射DNA 100μg/100μl,1次/10天,共注射5次。治疗结束后2周对小鼠肺、脾组织荷菌量、重量指数（WI）、大体病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合化疗治疗药物敏感结核病的免疫治疗作用。3.结核分枝杆菌Ag85A DNA、Ag85A/ESAT6 DNA单独或联合利福平治疗小鼠耐多药结核病。采用菌量为2.2×105CFU耐RFP和INH的M. tb分离株HB361菌悬液经尾静脉感染90只小鼠,感染后第3天将小鼠随机分为下列9组进行治疗:（1）生理盐水组（;2）pVAX1载体组;（3）RFP组（;4）微卡菌苗组（;5）Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP组;（6）Ag85A/ESAT6 DNA组;（7）Ag85A DNA联合RFP组;（8）Ag85A DNA组;（9）HSP65 DNA组。每只小鼠肌肉注射100μg/100μl DNA,1次/15天,共注射5次。治疗结束后4周对小鼠肺、脾组织荷菌量、WI、大体病理和组织病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合RFP治疗耐多药结核病的免疫治疗作用。4.结核分枝杆菌Ag85A DNA单独或联合RFP或吡嗪酰胺（PZA）治疗小鼠耐多药结核病。采用菌量为2.2×105CFU耐RFP和INH的M. tb分离株HB361菌悬液经尾静脉感染70只小鼠,感染后第2天将小鼠随机分为下列7组进行治疗:（1）pVAX1载体组;（2）RFP组;（3）PZA组;（4）微卡菌苗组;（5）Ag85A DNA组;（6）Ag85A DNA联合RFP组;（7）Ag85A DNA联合PZA组。每只小鼠肌肉注射100μg/100μl DNA,1次/15天,共注射5次。治疗结束后4周对小鼠肺、脾组织荷菌量、WI和组织病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合RFP或PZA治疗耐多药结核病的免疫治疗作用。结果:1.从M. tb临床分离株中筛选、鉴定了3株耐RFP和INH的分离株HB240、HB361和HB401。2.与生理盐水组比较,RFP、Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP、RFP和INH、Ag85A/ESAT6 DNA联合REP和INH组肺菌落计数分别减少了1.82、0.86、1.87和1.88 logs,脾菌落计数分别减少了1.75、1.38、1.84和1.54 logs（p<0.01）;肺、脾WI也显着降低（p<0.05）;肺脏病变范围小、病变程度轻。3.与生理盐水和RFP组比较,微卡菌苗、Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP、Ag85A/ESAT6 DNA、Ag85A DNA联合RFP、Ag85A DNA和HSP65 DNA组肺菌落计数分别减少了0.32、0.28、0.34、0.66、0.50和0.26 logs,脾脏菌落计数分别减少了0.29、0.31、0.37、0.68、0.46和0.28 logs（p<0.05,p<0.01）。肺大体病理和组织病理显示,各疫苗组肺病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰。4. pVAX1载体、RFP和微卡组小鼠死亡率均为10%,其余各组小鼠均存活。与pVAX1载体和RFP组比较,PZA、微卡菌苗、Ag85A DNA、Ag85A DNA联合RFP、Ag85A DNA联合PZA组肺脏菌落数分别减少了0.91、0.93、1.32、1.25和0.87 logs;脾脏菌落数分别减少了0.67、0.72、0.97、1.21和0.75 logs（p<0.01）。肺组织病理显示,各治疗组肺脏病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰。结论:1.分别应用菌量为2.5×106 CFU的RFP和INH敏感株HB240-1和菌量为2.2×105 CFU耐多药株HB361建立了小鼠药物敏感和耐多药结核病模型。2.结核分枝杆菌Ag85A/ESAT6嵌合DNA联合化疗治疗小鼠药物敏感结核病的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合DNA单独应用。3.结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗单独应用或联合利福平治疗小鼠耐多药结核病的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合DNA、HSP65 DNA和微卡菌苗。4.结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗单独应用或联合RFP治疗小鼠耐多药结核病的疗效优于微卡菌苗、PZA以及与PZA联合。Ag85A DNA疫苗与抗结核药物联合治疗是治疗耐多药结核病的最有前途的免疫策略。
余大海[10]（2008）在《结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究》文中研究指明结核病和布鲁氏病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患传染病。疫苗是控制结核病和布鲁氏病的有效方法。目前,BCG是预防结核病的唯一疫苗,但其免疫效力不稳定,且对成年人无保护;S19疫苗是在牛布鲁氏病中使用的疫苗,但血清学反应强,且安全性受到质疑,有感染人的可能。因此,高效的新型疫苗对于控制结核病和布鲁氏病蔓延至关重要。本论文在阐述结核病和布鲁氏病疫苗研究的基础上,着重分析了DNA疫苗的作用机制、发展现状及其改进策略。用分子生物学的方法分别构建了编码结核杆菌三种抗原（Ag85B,MPT64和MPT83）和布鲁氏杆菌三种抗原（BCSP31,SOD,和L7/L12）的原核表达载体,诱导表达并纯化后得到抗原蛋白。构建此六种抗原的真核表达载体,进行体外瞬时表达实验,用GFP偶联和RT-PCR等方法确定蛋白表达的部位和表达量。大量提取制备真核质粒作为DNA疫苗,免疫小鼠三次后8周,用高剂量的结核杆菌或布鲁氏杆菌感染小鼠或大动物牛。本文从体液免疫水平、细胞因子水平、分泌细胞因子细胞的数量、T细胞激活比例、T细胞亚型的变化、杀伤性T细胞的定量、结合动物感染后脏器载菌量等多个指标,对各个组合的疫苗的优势及所诱导免疫反应的进行综合评价,以期对DNA疫苗效力及其佐剂触发免疫反应的机制进行诠释。实验结果表明,多价DNA疫苗能够诱导更强的TH1型免疫反应,扩大保护范围,保护效力显着高于单价DNA疫苗。通过对比联合疫苗与不同矿物质佐剂、基因佐剂共同免疫后所产生的保护效果,证实佐剂基因佐剂IL-2、IL-12、IL-15、和无机佐剂DDA在诱导TH1型细胞反应,增强杀伤性T细胞的功能方面发挥重要作用。尤其是用六种抗原联合DNA疫苗与IL-12共同免疫,产生了“一针治两病”的效果,保护效率显着高于目前使用的BCG和S19传统疫苗。IL-15佐剂显着提高了分泌IFN-γ的CD8+T细胞的数量,从体内、体外实验证实了CD8+T细胞在对抗布鲁氏杆菌过程中的重要作用。多肽佐剂KLKL5KLK提高了APC细胞对抗原的摄取、加工和递呈能力,延长了免疫保护期、增强CD4+T细胞作用和细胞杀伤水平,为临床应用提供了重要证据。用包裹剂PLGA达到DNA缓释和避免核酸酶对DNA降解的效果以减少免疫剂量,结果表明PLGA在提高抗原表达量,延长表达时间上有显着作用,在免疫攻毒试验中,免疫一次PLGA包裹的多价DNA疫苗产生了与免疫三次不加PLGA的多价DNA疫苗类似的保护效力。BCG疫苗加强策略在大动物牛中的实验表明,加强策略显着提高了免疫牛中CD4+T细胞的比例,诱导了高水平的IFN-γ,且一直持续到攻毒后22周。用结核杆菌强毒株感染小鼠,构建潜伏期感染的动物模型。感染后8周,用异烟肼和吡嗪酰胺治疗3个月。治疗期间,用编码三种结核杆菌抗原的基因联合治疗,使免疫应答朝TH1型方向进行,产生更多的TH1型的细胞因子如IFN-γ,使吞噬有结核杆菌的巨噬细胞从休眠状态转变为活化型,以杀死结核杆菌,提高治疗效率,降低载菌量,使治疗时间减少一半,克服由于长期使用药物产生耐药性等问题。对开发有实际意义的治疗用核酸疫苗具有重要的启示。
二、结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分 结核分枝杆菌 Ag85B-Hsp65、ESAT6-Hsp65 融合基因DNA 疫苗株的构建及免疫效果评价 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 卡介苗 ure C 基因缺失株的构建及筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结核病与结核疫苗 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）结核病DNA疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 DNA疫苗的概念及免疫机制 |
| 1.1 DNA疫苗的概念 |
| 1.2 DNA疫苗的免疫机制 |
| 2 TB DNA疫苗的种类 |
| 2.1 TB预防性DNA疫苗 |
| 2.2 TB治疗性DNA疫苗 |
| 3 结核DNA疫苗研究的主要疫苗候选基因 |
| 3.1 DosR编码基因 |
| 3.2 HSP编码基因 |
| 3.4 MPT64编码基因 |
| 3.5 Pst S编码基因 |
| 3.6 RD1区优势抗原ESAT6、CFP10编码基因 |
| 4 提高TB DNA疫苗免疫效力的策略 |
| 4.1 DNA疫苗载体的选择及优化 |
| 4.2 免疫佐剂 |
| 4.3 免疫途径 |
| 5 结语 |
（3）结核杆菌多价核酸疫苗在小鼠体内的免疫保护效应研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1. 1实验动物 |
| 1. 2主要试剂 |
| 1. 3质粒DNA的大量制备 |
| 1. 4动物免疫接种 |
| 1. 5攻击实验 |
| 1. 6病理组织学检测 |
| 1. 7统计学分析 |
| 2结果 |
| 2. 1动物肺组织结核杆菌带菌量检测结果 |
| 2. 2病理组织学检测结果 |
| 3讨论 |
（4）结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 英中文术语与缩略词对照表 |
| 附录 B 常用试剂配制 |
| 附录 C 个人简历和发表文章 |
| 附录 D 结核 DNA 疫苗综述 |
| 参考文献 |
（5）结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 实验对象、材料和方法 |
| 2 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 第一节 结核杆菌与结核病 |
| 第二节 机体抗结核免疫机制 |
| 第三节 结核疫苗研究状况和进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608的研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）蛋白转导结核DNA疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 缩写及中英文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 结核杆菌Ag85B与牛疙疹病毒I型VP22 B(v2P2)融合基因疫苗的构建及其免疫学特性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 结核杆菌Ag85B与牛疙疹病毒I型VP22(BVP22)融合基 因疫苗抗结核感染的保护效应的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的论文 |
| 后记 |
（8）口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道IEL亚群及其生物学活性的变化（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 论文一 口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道IEL亚群的变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文二 口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道IEL生物学活性的变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）结核分枝杆菌DNA疫苗单独或联合治疗小鼠结核病模型的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 结核分枝杆菌耐多药菌株的选择 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 结核分枝杆菌A985A/ESAT6 嵌合 DNA 疫苗单独或联合化疗治疗小鼠药物敏感结核病的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结核分枝杆菌DNA 疫苗单独或联合化疗治疗小鼠耐多药结核病的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 结核分枝杆菌A985A DNA 疫苗单独或联合化疗治疗小鼠耐多药结核病的重复研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录 1 综述 |
| 附录 2 致谢 |
| 附录 3 攻读学位期间发表的学术论文题录 |
（10）结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 关于结核病和布鲁氏病 |
| 1.1.1 结核病现状分析 |
| 1.1.2 结核杆菌的致病机制 |
| 1.1.3 布鲁氏病现状分析 |
| 1.1.4 布氏杆菌致病机制 |
| 1.2 结核杆菌和布鲁氏杆菌疫苗的研究 |
| 1.2.1 卡介苗的应用、局限和改进 |
| 1.2.2 新型结核杆菌减毒活菌疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗的策略 |
| 1.2.4 重组融合蛋白 |
| 1.2.5 初免-加强免疫策略 |
| 1.2.6 布氏杆菌疫苗 |
| 1.3 DNA 疫苗 |
| 1.3.1 DNA 疫苗的免疫机理 |
| 1.3.2 结核杆菌和布氏杆菌DNA 疫苗 |
| 1.3.3 提高DNA 疫苗效率的策略 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、细胞系及试剂 |
| 2.2 分子水平操作 |
| 2.2.1 目的基因克隆 |
| 2.2.2 DNA 疫苗的制备 |
| 2.2.3 微球包裹剂型DNA 疫苗制备 |
| 2.2.4 重组抗原的表达、纯化与复性 |
| 2.2.5 定量PCR |
| 2.2.6 Western blotting |
| 2.3 细胞因子及化学因子分析 |
| 2.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 2.3.2 牛IFN?γ的测定 |
| 2.3.3 CBA（Cytokine Beads Array） |
| 2.3.4 IFN?γ及GrB ELISPOT |
| 2.3.5 NO 含量测定 |
| 2.4 细胞水平分析 |
| 2.4.1 细胞转染 |
| 2.4.2 细胞亚型分析 |
| 2.4.3 T 细胞亚群分选 |
| 2.4.4 体外细胞杀伤实验 |
| 2.4.5 牛PPD 测试与淋巴细胞增殖实验 |
| 2.5 动物实验 |
| 2.5.1 动物免疫及治疗方案 |
| 2.5.2 免疫组织化学 |
| 2.5.3 体内T 细胞封闭实验 |
| 2.5.4 攻毒实验和活菌计数 |
| 2.6 显着性统计 |
| 第三章 布氏杆菌三价DNA 疫苗的效用评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 对 C57BL/6 小鼠的保护力 |
| 3.2.2 体液免疫反应 |
| 3.2.3 细胞因子水平 |
| 3.2.4 分泌IFN-γ的细胞 |
| 3.2.5 目的抗原在体内的表达 |
| 3.2.6 淋巴细胞亚型的鉴定 |
| 3.2.7 以GrB 为标志的CD8+细胞杀伤反应 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 提高DNA 疫苗免疫效果的研究 |
| 4.1 IL-2 提高了DNA 疫苗的TH1 型反应 |
| 4.1.1 前言 |
| 4.1.2 结果 |
| 4.1.2.1 表达载体的构建及目的抗原鉴定 |
| 4.1.2.2 T 细胞亚型 |
| 4.1.2.3 细胞因子水平和保护效力 |
| 4.1.2.4 病理学分析 |
| 4.1.2.5 目的抗原表达谱 |
| 4.1.3 讨论 |
| 4.2 IL-15 增强了DNA 疫苗诱导的CTL 水平 |
| 4.2.1 前言 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.2.1 TH1 型免疫反应 |
| 4.2.2.2 分泌IFN-γ的细胞 |
| 4.2.2.3 CTL 反应 |
| 4.2.2.4 体内封闭实验 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.3 IL-12 联合六价DNA 疫苗同时对抗结核和布氏杆菌 |
| 4.3.1 引言 |
| 4.3.2 结果 |
| 4.3.2.1 抗体水平 |
| 4.3.2.2 T 细胞亚型的比例 |
| 4.3.2.3 TH1 型细胞因子水平 |
| 4.3.2.4 CTL 反应 |
| 4.3.2.5 释放GrB 的细胞和穿孔素的测定 |
| 4.3.2.6 TLR 基因的表达和一氧化氮（NO）水平 |
| 4.3.2.7 脏器载菌量 |
| 4.3.3 讨论 |
| 4.4 佐剂DDA 有利于提高DNA 疫苗效力 |
| 4.4.1 前言 |
| 4.4.2 结果 |
| 4.4.2.1 抗原特异性抗体 |
| 4.4.2.2 IFN-γ和IL-4 分析 |
| 4.4.2.3 肺部病理变化 |
| 4.4.2.4 保护效果分析 |
| 4.4.3 讨论 |
| 4.5 多肽佐剂KLKL5KLK 与DNA 疫苗的联合作用效果研究 |
| 4.5.1 引言 |
| 4.5.2 结果 |
| 4.5.2.1 特异性抗体水平 |
| 4.5.2.2 获得性免疫水平 |
| 4.5.2.3 细胞因子的检测 |
| 4.5.2.4 体外细胞杀伤活性的检测 |
| 4.5.2.5 保护效果分析 |
| 4.5.3 讨论 |
| 4.6 包裹剂PLGA 减少了DNA 疫苗的用量 |
| 4.6.1 前言 |
| 4.6.2 结果 |
| 4.6.2.1 微球的大小与形态 |
| 4.6.2.2 目的抗原的体内表达 |
| 4.6.2.3 目的基因体内表达谱 |
| 4.6.2.4 高水平的IFN-γ |
| 4.6.2.5 保护效果分析 |
| 4.6.3 讨论 |
| 4.7 DNA 初免—BCG 加强策略 |
| 4.7.1 引言 |
| 4.7.2 结果 |
| 4.7.2.1 IFN-γ水平 |
| 4.7.2.2 抗体水平 |
| 4.7.2.3 淋巴细胞增殖 |
| 4.7.2.4 CD4~+T 细胞为主的T 细胞增殖 |
| 4.7.2.5 各组攻毒前PPD 测试 |
| 4.7.2.6 保护效果分析 |
| 4.7.2.7 剖检结果 |
| 4.7.3 讨论 |
| 第五章 DNA 疫苗联合化学药物提高结核病的治疗效果 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 治疗方案 |
| 5.2.2 抗原特异性TH1 型免疫反应 |
| 5.2.3 IFN-γELISPOT |
| 5.2.4 表达CD44~(high) 的T 细胞 |
| 5.2.5 预防结核病复燃 |
| 5.2.6 病理结果 |
| 5.2.7 IL-12 和NO 水平 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步的工作 |
| 发表文章 |
| SCI 收录(11 篇) |
| EI 收录（2 篇）、核心期刊（2 篇）及会议论文（3 篇） |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究[D]. 张真. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [2]结核病DNA疫苗研究进展[J]. 薛玉芹,方强. 蚌埠医学院学报, 2016(03)
- [3]结核杆菌多价核酸疫苗在小鼠体内的免疫保护效应研究[J]. 杨爱琼,谢勇恩. 川北医学院学报, 2015(05)
- [4]结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价[D]. 薛玉芹. 蚌埠医学院, 2013(10)
- [5]结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察[D]. 丁珍珍. 重庆医科大学, 2011(11)
- [6]重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究[D]. 陆云芝. 复旦大学, 2010(07)
- [7]蛋白转导结核DNA疫苗的实验研究[D]. 姚万红. 武汉大学, 2009(01)
- [8]口服Ag85A DNA疫苗诱导肠道IEL亚群及其生物学活性的变化[D]. 王大南. 中国医科大学, 2009(10)
- [9]结核分枝杆菌DNA疫苗单独或联合治疗小鼠结核病模型的研究[D]. 梁艳. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2008(03)
- [10]结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究[D]. 余大海. 北京大学, 2008(09)