一、c-ski原癌基因及其生物学活性（论文文献综述）
王峰[1]（2020）在《微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究》文中认为目的:观察微小RNA（micro RNA,miR）-122-5p和155-5p在转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1诱导心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）增殖和分化中的作用,同时观察芹菜素对其的影响,并在小鼠心肌纤维化模型上进一步加以证实,以阐明miR-122-5p和155-5p与TGF-β1/Smads之间的关系,以及芹菜素影响CFs活化和改善心肌纤维化的作用机制,为芹菜素应用于防治心肌纤维化提供充分的药理学依据。方法:（1）在体外,采用TGF-β1刺激的CFs,观察不同浓度的芹菜素对CFs表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、collagenⅠ、collagenⅢ、缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）-1α、细胞内凯特-斯隆基因（cellular Sloan-Kettering Institute,c-Ski）、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3的影响;同时也观察芹菜素对细胞中miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-133-5p、miR-27b-5p、miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响,以选择合适的芹菜素浓度和确定受其影响的miR。（2）将转染miR-122-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-122-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-122-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的影响。另将miR-122-5p mimic与LV-HIF-1α共转染CFs,观察miR-122-5p对HIF-1α、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7表达的影响,采用生物信息学方法预测miR-122-5p与HIF-1α之间的相互作用关系,并用荧光素酶实验确定它们的靶向结合。（3）将转染miR-155-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、c-Ski、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-155-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的作用。采用生物信息学的方法来预测miR-155-5p的作用靶基因,并进一步采用荧光素酶实验确定miR-155-5p与其靶基因的结合。（4）在体内实验中,将ICR雄性小鼠随机分为对照组、模型组、芹菜素75、150和300 mg/kg组、卡托普利25 mg/kg组。给药组于上午按0.2 m L/10 g体重灌胃给药,3 d后与模型组一起,于下午皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg 1次,次日将剂量调整为2.5 mg/kg/d,连续30 d,之后药物处理组再继续给药7 d。实验结束时,小鼠禁食12 h后取眼眶血和心脏,心脏称重后计算心重系数,部分心肌用冷生理盐水制成10%组织匀浆,用比色法测定血清和心肌组织中的丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量,部分心肌固定切片后进行Masson染色,观察胶原纤维沉积的程度,部分心肌置-80°C冰箱,用于检测miR-122-5p、miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、TGF-β1、核因子κB（nuclear factorκB,NF-κB）、HIF-1α、c-Ski、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3 m RNA或蛋白表达。结果:（1）在TGF-β1刺激的CFs中,加入芹菜素6-24μM后,可剂量依赖性降低α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达（p<0.05或p<0.01）,增加c-Ski和Smad7的m RNA和蛋白表达（p<0.05或p<0.01）。芹菜素6-24μM也可剂量依赖性逆转TGF-β1对CFs中miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响。（2）CFs转染miR-122-5p mimic后,细胞中miR-122-5p和Smad7 m RNA或蛋白表达显着增加（p<0.01）,而α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3m RNA或蛋白表达显着降低（p<0.05或p<0.01）。CFs转染miR-122-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-122-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应降低（p<0.05或p<0.01）。MiR-122-5p mimic联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强（p<0.01）。用TGF-β1刺激miR-122-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则进一步增强（p<0.05或p<0.01）。芹菜素可拮抗miR-122-5p inhibitor增强TGF-β1活化CFs的效应（p<0.01）。在HIF-1α过表达的CFs中,HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达显着增加（p<0.01）,Smad7表达显着降低（p<0.01）。HIF-1α介导的这些效应能够被miR-122-5p mimic逆转（p<0.05或p<0.01）。荧光素酶实验结果显示,miR-122-5p mimic和HIF-1α3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显着降低（p<0.01）,显示HIF-1α是miR-122-5p作用的靶基因。（3）CFs转染miR-155-5p mimic后,细胞中miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达显着增加（p<0.01）,而c-Ski的m RNA和蛋白表达显着降低（p<0.01）。CFs转染miR-155-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-155-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应进一步增强（p<0.05或p<0.01）。芹菜素可拮抗miR-155-5p mimic增强TGF-β1活化CFs的效应（p<0.01）。用TGF-β1刺激miR-155-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则被抑制（p<0.05或p<0.01）。MiR-155-5p inhibitor联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强（p<0.05或p<0.01）。荧光素酶实验结果显示,miR-155-5p mimic和c-Ski 3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显着降低（p<0.01）,显示c-Ski是miR-155-5p作用的靶基因。（4）在动物实验中,芹菜素组的心重系数、心肌组织中的羟脯氨酸和MDA含量显着降低（p<0.05或p<0.01）,心肌组织中的SOD和GSH-PX活力则显着增加（p<0.05或p<0.01）。心肌组织的Masson染色结果显示,芹菜素组的胶原染色面积显着减少（p<0.01）。Real-time PCR和Western blot结果显示,芹菜素可显着增加miR-122-5p、c-Ski和Smad7的表达（p<0.01）,抑制miR-155-5p、NF-κB p65、HIF-1α、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的表达（p<0.01）。结论:MiR-122-5p和155-5p参与了TGF-β1/Smads信号通路介导的CFs活化,它们的作用靶基因分别为HIF-1α和c-Ski。芹菜素可通过增加miR-122-5p和降低miR-155-5p的表达调节各自的靶基因HIF-1α和c-Ski表达,从而逆转TGF-β1介导的Smad2/3上调和Smad7下调;芹菜素也可通过增加机体的抗氧化能力削弱NF-κB/TGF-β1途径的激活,抑制CFs的活化而发挥抗心肌纤维化作用。
寇江力[2]（2019）在《沉默Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞生物学行为的影响》文中提出背景 骨肉瘤起源于间叶组织,是骨关节系统最常见的恶性肿瘤,其治愈率较低,对青少年健康的危害较高,在早期易发生肺部转移,死亡率较高。近年来,随着外科手术的发展和新辅助联合化疗的广泛应用,患者5年生存率得到显着提高,但发生转移的患者5年生存率仍较低。因此,深入探讨骨肉瘤发生转移机制,寻找新的治疗靶点进而延长已发生转移者的生存期是目前亟需解决的问题。Ski基因在不同物种中广泛参与并调节多种细胞的增殖及分化等过程,在生物进化过程中高度保守,参与多种信号通路,且与肿瘤的发生发展、增殖、分化等密切相关。已有研究表明,Ski基因在多种肿瘤组织中呈高表达状态,Ski基因的激活或异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。而有关Ski对骨肉瘤细胞增殖和迁移影响的研究在国内外尚无相关报道。目的 探讨沉默Ski基因骨肉瘤U-2OS细胞是否会出现生物学活性的改变。继而研究骨肉瘤病致病机制并对其早期预防、诊断、治疗提供理论依据。方法 实验分为3组:空白对照组（未转染的骨肉瘤细胞）、阴性对照组（转染阴性对照序列）和沉默组（转染Ski-siRNA）。采用脂质体法将特异性针对Ski基因的siRNA和阴性对照siRNA转入骨肉瘤U-2OS细胞,构建Ski基因沉默表达的骨肉瘤U-2OS细胞系,随后采用蛋白质印迹法验证Ski-siRNA干扰后能否有效降低细胞中Ski蛋白的表达水平;CCK-8法检测沉默Ski表达后骨肉瘤细胞的增殖活力;采用流式细胞术分析细胞周期;采用细胞划痕实验检测Ski-siRNA转染后骨肉瘤U-2OS细胞迁移能力的变化。采用蛋白质免疫印迹法检测沉默Ski基因后对PCNA、CyclinD1和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达水平的影响。结果 成功构建Ski基因沉默表达的骨肉瘤U-2OS细胞系。Western blot结果显示,Ski-siRNA转染后骨肉瘤U-2OS细胞Ski蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。CCK-8结果表明,Ski-siRNA基因组在12h,24h,48h细胞增殖活力明显降低（P<0.05）。与对照组相比,Ski-siRNA组细胞周期G1期细胞比例明显增高,而S期和G2期细胞比例均显着降低（p<0.05）。细胞划痕实验显示,Ski-siRNA处理组细胞在12、24、48小时的划痕愈合率均低于siRNA对照组,均具有统计学意义（P<0.05）,此外,Ski-siRNA处理组中PCNA、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显着降低（P<0.05）。结论 沉默Ski基因能显着抑制骨肉瘤U-2OS细胞的增殖、迁移能力,提示Ski有望成为骨肉瘤治疗的新靶点。
寇江力,赵鑫,王兴文,汪静,王拴科,张海鸿[3]（2018）在《敲低Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞增殖和迁移的影响》文中研究说明该文研究了敲低Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞增殖和迁移的影响。该研究成功构建了Ski基因敲低表达的骨肉瘤U-2OS细胞系。Western blot结果显示,Ski-siRNA转染后骨肉瘤U-2OS细胞Ski蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。CCK-8结果表明,敲低Ski基因组在12、24、48 h细胞增殖活力明显降低（P<0.05）。与对照组相比,Ski-siRNA组细胞周期G1期细胞比例明显增高,而S期和G2期细胞比例均显着降低（P<0.05）。细胞划痕实验显示,Ski-siRNA处理组细胞在12、24、48 h的划痕愈合率均低于siRNA对照组,且均具有统计学意义（P<0.05）。此外,Ski-siRNA处理组中PCNA、cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白质水平均显着降低（P<0.05）。上述结果表明,敲低Ski基因能显着抑制骨肉瘤U-2OS细胞的增殖和迁移能力,提示Ski基因有望成为骨肉瘤治疗的新靶点。
周志强[4]（2016）在《Mstn基因敲除大鼠模型的建立及表型的初步分析Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响》文中研究表明[目的]肌肉生长抑制素（Mstn）是一种骨骼肌生长的负性调控因子,不仅调控骨骼肌的数量和大小,同时它也在脂肪发生和物质代谢调节中发挥重要作用。虽然目前已有Mstn基因敲除小鼠和哺乳类大动物,但哺乳类大动物存在繁殖周期长的缺陷,小鼠很多生理特性又与人类相距较远,而大鼠模型可以弥补二者的缺陷,因此有必要构建Mstn基因敲除大鼠,利用其深入研究Mstn基因在代谢中的机制。[方法]本文采用锌指核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）技术靶向剪切位于Mstn基因外显子1上的位点,造成了1个碱基的缺失和2个碱基的突变,导致移码突变提前产生终止密码子,最终成功构建了只表达N端109个氨基酸、不表达具有生物活性C端片段的Mstn基因敲除大鼠。[结果]通过对该大鼠进行表型分析,与同窝对照大鼠相比,Mstn基因敲除大鼠体重明显增加、体型增大；其体内肌肉含量增高,但抓力测试并无区别,提示Mstn基因缺失导致的肌肉含量增加并不增强肌纤维的强度；通过对脂肪含量的分析,Mstn KO大鼠体内脂肪含量减少。[结论]以上结果说明已成功构建Mstn基因敲除大鼠,将为下一步深入研究Mstn基因在代谢中的机制、治疗相关疾病以及畜牧业发展提供重要的动物模型。[目的]通过对Fkbp51基因敲除（KO）与野生型（WT）小鼠肝脏的表达谱分析,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。[方法]利用二代测序技术对Fkbp51KO与WT小鼠的肝脏进行mRNA表达谱测序,利用TopHat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出WT与KO小鼠肝组织中差异的内含子保留和外显子跳跃造成的mRNA可变剪接。利用在线工具DAVID对差异mRNA可变剪接体进行基因功能（Gene ontology, GO）和KEGG代谢通路富集分析,同时利用NCBI基因数据库对这些差异基因进行注释。[结果]（1）Fkbp51的缺失可导致小鼠肝脏中新的mRNA可变剪接的发生；（2）Fkbp51基因敲除同时造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化；（3）通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生特异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌、和PPAR等信号通路相关。（4）发生差异内含子保留可变剪切的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控和氨基酸及其衍生物代谢相关。[结论]Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而可能会影响小鼠肝脏的代谢功能。肌肉生长抑制素（Mstn）是转化生长因子TGF-β超家族的一员,主要表达于骨骼肌。Mstn前体蛋白可通过多种形式的加工和活性调节方式,最终生成具有生物活性的二聚体形式发挥生物学功能。Mstn不仅对骨骼肌的生长发育具有负调控的作用,并且参与调节脂肪的增殖分化,因此在医学和畜牧业中具有广阔的应用前景。近年来已经发现Mstn在肥胖、肌肉萎缩和心衰等疾病中具有重要的作用。本文从Mstn基因和蛋白结构入手,系统概括了其蛋白水解加工和活性调节过程,及其受体后信号通路,以期为今后针对Mstn的研究提供靶点和思路。
郭晓光,王琼,朱治键[5]（2014）在《c-ski在食管鳞状细胞癌中的表达及意义》文中研究表明目的:研究c-ski在食管鳞癌组织中的表达以及与临床病理特征之间的关系,探讨食管鳞癌的发病机制并为其早期诊断及治疗寻找新的因子。方法:采用原位杂交法及免疫组化SP法检测22例正常食管组织,24例上皮内瘤变组织及84例食管鳞癌组织中c-ski mRNA及c-ski蛋白的表达情况。结果:c-ski mRNA在食管上皮组织,上皮内瘤变组织和食管鳞癌组织中的阳性表达率分别是13.6%（3/22）,62.5%（15/24）,92.9%（78/84）,3组差异具有高度统计学意义（P<0.01）;c-ski蛋白在食管上皮组织,上皮内瘤变组织和食管鳞癌组织中表达阳性率分别是6.67%（6/22）,45.8%（11/24）,70.2%（59/84）,3组差异具有高度统计学意义（P<0.01）。c-ski蛋白在食管鳞癌中的表达与TNM分期有相关性（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移等均关系不大。结论:c-ski可能是一个潜在的癌基因,在食管鳞癌的发生发展中起作用。
王虎军[6]（2013）在《维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕影响的实验研究》文中研究表明瘢痕（Scar）是机体创伤愈合的必然产物。病理性瘢痕由于瘢痕增生过度,从而引起外形和（或）功能异常。增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是临床最常见的病理性瘢痕之一,造成患者外观畸形和功能异常,给患者身体及心理带来了较大的影响。由于其具体机制尚不十分清楚,且治疗后易复发等特点,当前尚无较好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多环节、多阶段的一个复杂过程,包括凝血、早期炎症、晚期炎症、成纤维细胞的迁移与胶原的合成、血管化、上皮化、重塑阶段等。传统治疗方法包括局部加压、激素注射、硅凝胶类以及放化疗等虽然取得了一定效果,但在治疗HS的同时,会出现副作用或不良反应,临床应用受到一定限制。在传统中医理论中,HS认为是由于气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结或三者联合所致,且基于活血化瘀、攻毒散结、通络止痛、酸涩收敛和消结散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定进展。虽然目前报道的中医治疗瘢痕的方法很多,但多数存在用药途径比较单一、剂型有限、多集中在单味药物或是提取物研究等缺陷,且疗效不确切,容易复发等缺点。维医理论认为体液是人类生命及生理活动过程的基本物质体内各种营养物质在肝中产生的各种液体总称为体液,分为胆液质、血液质、粘液质和黑胆质四种。它们贯穿于整个人生,在体内自然形成,对健康和疾病起很大的作用。它们在体内不断地消耗,又不断地产生,保持着一定的平衡状态。四体液脱离自然的正常状态,在数量和质量上发生改变,成为对人体无益或有损的体液,称为异常体液。在体内外各种因素的作用下,人体内胆质体液的量增加,功能改变,在机体基础“热”的作用下“燃烧”最终形成异常黑胆质,是许多疾病维吾尔医学病理生理上所共有的特性。治疗上主要采用异常黑胆质成熟剂（Abnormal Savda Munziq, ASMq）进行调整。ASMq在防治部分肿瘤、糖尿病、高血压等方面均取得了一定效果。体外研究显示ASMq具有抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡等作用。研究表明皮肤增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,又被称为“皮肤成纤维细胞良性肿瘤”。本研究在传统维医理论指导下提出科学假设：皮肤增生性瘢痕是异常黑胆质体液在皮肤的局部沉积所致,是全身异常黑胆质体液的局部表现。本研究拟通过兔耳增生性瘢痕动物模型以及体外人增生性瘢痕成纤维细胞培养实验,通过采用不同浓度ASMq干预研究,来检验假设,并进一步探讨其细胞与分子机制。研究表明,增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,其中TGF-p是导致增生性瘢痕形成的重要细胞因子,它主要通过TGF-β/Smad信号通路参与调节成纤维细胞的增殖,凋亡,迁移和胶原代谢。TGF-β能同时触发两个可以对抗Smad蛋白介导的正反馈调节机制,其中就是快速激活Smad7启动子,诱导Smad7基因表达,通过Smad7竞争性的占据TGF-βI型受体,抑制受体的蛋白激酶R-TGF-p的磷酸化而阻断信号传导,最后诱发它能促进细胞外基质在伤口沉积,并能促进纤维化,促使形成增生性瘢痕。由于增生性瘢痕是成纤维细胞过度增殖和细胞外胶原机制过度沉积而引起,因此抑制成纤维细胞增殖、抑制其胶原表达是防治增生性瘢痕的基础。在细胞水平上,通过抑制细胞活性从而抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡可以减少瘢痕内成纤维细胞数量,可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在细胞超微结构中,改变细胞内内质网、核糖体、线粒体等与胶原表达关系密切的亚细胞器活性可以在一定程度上具有减少瘢痕胶原的沉积的作用;在蛋白分子水平上,由于TGF-β/Smad信号通路是胶原产生的主要通路之一,且TGF-β1是促进细胞增殖的重要因子之一,因此通过减少TGF-β1的表达、增加Smad7的表达可以防治增生性瘢痕的发生和发展。目的：通过体内体外实验初步探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制,为临床采用维医维药理论防治增生性瘢痕提供实验和理论依据。方法：本研究采用兔耳瘢痕动物模型、体外增生性瘢痕成纤维细胞培养等途径,分别从组织学、细胞学以及分子生物学水平,探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制。第一部分,体内实验部分,灌胃给予维药ASMq对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究。20只新西兰大耳白兔采用随机数字表法随机分为4组,即空白对照组（生理盐水）三个实验组分别为：（ASMq400mg/kg）,（ASMq800mg/kg）、（ASMq1200mg/kg）,每组5只。在创面形成后第45天（预实验表明此时瘢痕增生达到峰值）,分别取材后进行各项指标测定,备好切片后进行四项实验实施。（1）通过计算瘢痕增生指数（Hypertrophic Indes, HI）,与空白对照组相比,从而明确各实验组ASMq对兔耳增生性瘢痕有无影响。（2）通过对各组创面范围内组织切片行HE染色,观察各组兔耳瘢痕胶原排列以及成纤维细胞密度等情况,进一步明确ASMq对兔耳增生性瘢痕胶原增生以及成纤维细胞增殖的影响。（3）通过对各组创面范围内组织行Masson染色,观察各组胶原排列以及胶原密度,通过采用单因素方差分析分析多组间胶原面密度,通过两两比较q检验,明确各组间胶原面密度有无差异。（4）通过对兔耳创面范围内组织标本通过透射电镜观察组织超微结构（包括原胶原纤维、线粒体、内质网等细胞亚结构）,通过与空白对照组相比较分析,初步在超微结构层面进一步观察不同浓度维药ASMq对兔耳增生性瘢痕的影响机制。第二部分,体外实验,通过体外分离培养人增生性瘢痕来源成纤维细胞,分四组（1个空白对照组,3个实验组）：空白对照组,低浓度ASMq组（0.1mg/m1）,中浓度ASMq组（0.4mg/m1）,高浓度ASMq组（0.7mg/m1）。对各组在相应时间点收集标本进行检测：（1）通过CCK-8方法,采用酶标仪检测ASMq对成纤维细胞体外增殖有无影响。（2）采用细胞凋亡分析试剂盒通过流式细胞分析仪行细胞凋亡检测,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞凋亡的影响。（3）采用细胞周期检测试剂盒,通过流式细胞术分析ASMq对成纤维细胞细胞周期的影响,拟明确ASMq阻断细胞增殖周期的具体时间点。（4）通过细胞划痕迁移实验观察成纤维细胞迁移能力,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞迁移能力有无影响。（5）通过透射电镜观察成纤维细胞合成原胶原能力以及内质网、核糖体、细胞核、线粒体等细胞亚结构情况,拟明进一步分析明确不同浓度ASMq对成纤维细胞表达胶原以及细胞凋亡、增殖的机制。第三部分,采用RT-PCR方法和免疫印迹等方法基于TGF-β/Smad通路分析ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达影响的分子机制。拟明确不同浓度ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达的分子机制。结果：第一部分,体内兔耳增生性瘢痕动物模型实验结果表明,灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性。（1）大体观察结果,增生性瘢痕的厚度随着ASMq的浓度逐渐增大,其厚度逐渐减小,硬度逐渐软化,体积逐渐减小趋于平复,颜色逐渐变淡。（2）计算瘢痕增生指数结果,与空白组（3.87±0.22）对比,实验各组分别为（3.38±0.34）、（2.63±0.15）、（1.72±0.12）增生性指数（HI）随着ASMq的浓度逐渐增加而降低（p<0.05）。（3）通过HE染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的成纤维细胞密度观察结果,与空白组（4022.5±±189.3）相比,实验组（3541.44±206.6）的显示瘢痕增生不明显,成纤维细胞数量及密度减少（p<0.05）。（4）通过Masson染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的胶原纤维情况观察结果,与空白组（42.25±2.58）相比,实验组（23.55±1.28）的增生性瘢痕胶原纤维面密度明显减少（p<0.05）。（5）通过透射电镜观察不同浓度的ASMq对增生性瘢痕成纤维细胞的超微结构观察结果;与空白组对比,随着实验组浓度的递增成纤维细胞密度和胶原纤维面密度逐渐减少。第二部分,体外增生性瘢痕来源成纤维细胞干预实验结果表明,在一定浓度范围内ASMq具有抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构（如内质网、核糖体、线粒体等）活性,促进细胞凋亡等作用。生物学特性的影响。（1）体外细胞培养原代和传代及细胞冻存和复苏情况结果,成纤维细胞界限清楚,胞体较大,呈棱形或不规则三角形,细胞质向外伸出两三个长短不同的突起,胞浆丰富、胞膜边界清晰、核仁多以成双出现大小均等。（2）用CCK-8法检测各组HSFs增殖活性结果,与空白对照组相比,不同浓度ASMq组以及阳性对照组5-Fu组的HSFs增值活性明显降低,其差异具有统计学意义（p<0.05）。（3）用流式细胞技术检测各组HSFs细胞凋亡结果,与空白对照组凋亡率为2.2%±0.59%,不同浓度ASMq实验组凋亡率分别为14.1%±3.87%,23.5%±3.22%,38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq组凋亡率明显高于对照组,且凋亡率随ASMq浓度增加呈递增趋势。（4）ASMq对HSFs细胞周期的影响结果,与空白对照组比较,不同浓度ASMq组HSFs在G2/M期细胞比例呈不同程度升高,具有浓度依赖性,即在0.1-1.0mg/ml浓度间,随着ASMq浓度增加,GR/M期细胞比例从13.1%增加到29.5%,差异具有统计学意义（p<0.05）。（5）ASMq干预增生性瘢痕来源的成纤维细胞迁移实验结果。与空白组相比,实验组分别在0h、24h、48h后,增生性瘢痕的成纤维细胞迁移能力随着时间的延长而逐渐减弱（p<0.05）。（6）ASMq对HSFs超微结构的影响结果,从低倍和高倍镜观察到：0.4mg/ml组的成纤维细胞的细胞核消失；0.7mg/ml组成纤维细胞膜出现收缩;1mg/ml组成纤维细胞出现凋亡小体相对空白组。第三部分,通过体外对不同浓度ASMq干预后的增生性瘢痕来源成纤维细胞基于TGF-β/Smad通路分析,结果显示ASMq可以抑制TGF-β1的表达,促进抑制型Smad7的表达。在分子生物水平方面,通过RT-PCR的检测方法和western-blot检测方法。（1）ASMq对成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响结果,与空白组对比,AMSq随着药物浓度的增加,TGF-β1mRNA表达量减少（P<0.05）。（2）ASMq对成纤维细胞Smad7mRNA表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7mRNA表达量增加（P<0.05）。（3）ASMq对成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加,TGF-β1蛋白表达量减少（P<0.05）。（4）ASMq对成纤维细胞Smad7蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7蛋白表达量增加（P<0.05）。结论：灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性,其通过抑制胶原合成和成纤维细胞增殖途径发挥作用。在一定浓度范围内,ASMq具有抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构（如内质网、核糖体、线粒体等）活性,促进细胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞TGF-p1的表达,促进抑制型Smad7的表达。综上表明ASMq可以基于TGF-β/Smad通路抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制胶原表达,从而抑制增生性瘢痕的发生发展,为增生性瘢痕的防治提供了新的思路。
李慧萍[7]（2012）在《旋毛虫抗肿瘤蛋白基因的克隆、表达及其诱导H7402细胞凋亡研究》文中指出世界卫生组织公布数据显示，世界每年新增肝癌患者超过100万人，死亡人数达61万人。中国每年新增肝癌人数34万人，肝癌死亡人数11万，是全球肝癌发病率和死亡率最高的国家。目前手术切除对早期肝癌患者的治疗效果显着，但由于肝癌多数被诊断时就已进入中晚期，并常伴有肝硬化等肝功能异常，所以手术切除受到很大限制。此外放疗、化疗对癌细胞的增殖有一定抑制作用，但不容忽视的是，放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也有损伤，其后期疗效往往不能令人满意。随着科技的进步，抗癌药物的研发不仅仅局限于化学药物，靶向的生物治疗药物也逐步引起了人们的广泛关注，例如索拉菲尼，它是一种以肿瘤细胞信号传导为靶向的生物抗肝癌药物，已通过了美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration of US，USFDA）的认证并成功上市。因此，以干预肝癌细胞信号传导、诱导肝癌细胞凋亡的生物治疗药物的研发将极大改善抗肝癌药物严重缺乏的现状。本研究室在前期工作中通过旋毛虫cDNA噬菌体展示文库，利用人肝癌细胞系H7402和人白血病细胞系K562进行细胞淘选，获得了来自旋毛虫的抗肿瘤基因A200711，将该基因转染于人肝癌细胞H7402可以明显抑制细胞增殖，促进凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9的表达。基于旋毛虫A200711基因真核表达产物可诱导肿瘤细胞凋亡，为进一步验证其抗肿瘤特性，本研究对该基因进行原核表达纯化，验证该蛋白在体内及体外的抗肿瘤作用，为进一步研制基于旋毛虫的抗肿瘤生物制剂奠定基础。本实验以旋毛虫cDNA文库为模版，针对旋毛虫A200711基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-A200711转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经Ni亲和层析柱纯化并柱上复性后得到重组蛋白，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。Western blotting结果显示重组蛋白在21kDa处出现，并可被猪感染旋毛虫26天的猪血清所识别，表明旋毛虫A200711蛋白在重组菌中成功得到表达。我们将纯化、复性后的旋毛虫A200711蛋白透析及浓缩，喹啉酸（Bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度后，进行旋毛虫A200711对H7402人肝癌细胞系的体内、体外实验，验证旋毛虫A200711的抗肿瘤作用。不同浓度旋毛虫A200711蛋白分别作用人肝癌细胞系H7402和人正常肝细胞系H7702，CCK-8检测结果显示，旋毛虫A200711蛋白有效抑制了人肝癌细胞系H7402的增殖，并存在“量效-时效”关系，对人正常肝细胞系H7702的增殖不存在具有统计学意义的影响。Annexin V-FITC法检测旋毛虫A200711蛋白对H7402细胞凋亡的影响，流式细胞仪检测结果显示增加蛋白剂量会增强其促凋亡的作用，且具有线性关系。细胞周期检测发现旋毛虫A200711蛋白作用H7402肝癌细胞后会使细胞周期发生改变，细胞周期被阻滞于S期，蛋白浓度较高时出现明显的sub-G1凋亡峰。我们通过建立人肝癌细胞系H7402裸鼠皮下种植瘤模型，在体内检测了旋毛虫A200711蛋白对H7402肝癌细胞生长情况的影响。以PBS为阴性对照，抗肿瘤常用药物顺铂（DDP）为阳性对照，我们对实验动物进行为期21天的瘤内注射蛋白的治疗。结果表明旋毛虫A200711蛋白可以抑制肝癌细胞系H7402裸鼠皮下种植瘤的生长，和DDP相比，蛋白作用组对裸鼠的生理状况影响较小。本研究表明旋毛虫A200711蛋白在体内、体外均可抑制H7402细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，且对人正常肝细胞系H7702的生长无影响；与抗肿瘤常用药物顺铂相比，旋毛虫A200711蛋白具有副作用小、药效温和的特点，这为旋毛虫A200711蛋白成为抗肿瘤候选药物提供了一定的研究基础。
郭晓光[8]（2012）在《C-ski、Smad7和TGF-β1在食管鳞状细胞癌中的表达和意义》文中指出目的：通过研究C-ski，Smad7和TGF-β1在食管鳞状细胞癌组织中的表达以及与各临床病理指标之间的关系，探讨食管鳞状细胞癌的发病机制并为其早期诊断，判断预后及治疗寻找新的因子。方法：采用原位杂交法检测22例正常食管粘膜，24例上皮内瘤变组织，84例食管鳞状细胞癌组织中C-skimRNA的表达情况；采用免疫组化SP法检测22例正常食管粘膜，24例上皮内瘤变组织，84例食管鳞状细胞癌组织中C-ski蛋白，Smad7蛋白和TGF-β1蛋白的表达情况。结果：1．C-skimRNA在正常食管粘膜，上皮内瘤变组织和食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别是13.6% （3/22），62.5% （15/24），92.9% （78/84），三组差异具有显着统计学意义（P＜0. 01）。2．C-ski蛋白在正常食管粘膜，上皮内瘤变组织和食管鳞状细胞癌组织中表达阳性率分别是6.67% （6/22），45.8%（11/24），70.2%（59/84），三组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）；Smad7蛋白阳性表达率分别为76.2%（72/84）、70.8%（17/24）和45.5%（10/22），三组之间比较差异有显着统计学意义（P<0.001）。TGF-β1蛋白阳性表达率分别为78.6%（66/84）、66.7%（16/24）和31.8%（7/22），三组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3．食管鳞状细胞癌组织中C-ski蛋白的表达与Smad7蛋白，TGF-β1蛋白的表达情况分别呈正相关关系（r=0.38, p<0.01；r=0.36,p<0.01）；而Smad7蛋白与TGF-β1蛋白的表达无明显相关关系（r=0.498, P>0.05）。4．食管鳞状细胞癌组织中C-ski蛋白，Smad7蛋白和TGF-β1蛋白的表达均与TNM分期有相关性（P<0.05），而与患者的性别，年龄，肿瘤的分化程度以及五年生存率等均无相关性（P>0.05）。结论：C-ski可能是一个潜在的癌基因，过度的转录和翻译促进了食管鳞状细胞癌的发生发展；C-ski可能是通过降低或阻断TGF-β1/Smad7通路对食管上皮细胞增殖的抑制作用，从而协同TGF-β1和Smad7两个因子促进了食管鳞状细胞癌的发生发展。
卢芳[9]（2012）在《RNF111基因启动子区甲基化与非小细胞肺癌转移关系的研究》文中研究表明背景与目的：肺癌是现今社会人类常见的恶性肿瘤之一，它在全世界各类癌症中死亡率是最高的。肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）两种类群，其中非小细胞肺癌大约占肺癌的85％，小细胞肺癌约占15％。由于有效的早期诊断技术和治疗措施的缺乏，非小细胞肺癌通常在晚期才被诊断，预后较差。因此，为了预防和治疗肺癌而对NSCLC致病机制进行深入的研究是非常重要的。TGF-β信号通路在肿瘤的发生发展进程中发挥重要的作用。RNF111基因编码的蛋白Arkadia可以通过降解TGF-β信号通路中的负调控因子Smad7, SnoN和Ski来增强TGF-β信号通路。DNA的甲基化被认为是最典型导致基因表达或者沉默的表观机制，并且与肺癌的发生发展密切相关。本研究中，我们研究RNF111基因在非小细胞肺癌和人支气管上皮细胞株中mRNA表达水平，并研究不同细胞株中mRNA表达水平的差异是基因突变还是基因启动子区甲基化导致的，为NSCLC的早期诊断和治疗提供新颖的理论依据。方法：利用实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）检测3株细胞株（HBE、95C和95D）中RNF111基因mRNA表达水平；并用SSCP （Single StrandConformation Polymorphism）的方法检测RNF111基因启动子区和编码蛋白功能区的基因突变情况；同时利用BSP和克隆测序的方法分析95C和95D细胞株中RNF111基因启动子区CpG位点的甲基化状态，并对两株细胞株中甲基化状态有显着差异的CpG位点的甲基化频率进行计算，统计这些CpG位点甲基化频率的差异是否与其mRNA表达水平的差异相关；另外，利用EMSA（electrophoretic mobilityshift assay）实验技术，验证甲基化频率有差异的CpG位点是否是通过与特定转录因子的结合来影响RNF111基因的mRNA表达水平。结果：实时定量PCR的结果显示在三株细胞株中RNF111基因的mRNA表达水平在95C和95D之间的差异最为显着并具有统计学意义（P<0.01），暗示该基因可能与肿瘤的恶性转移程度相关。SSCP结果显示，在非小细胞肺癌组织和相应的癌旁组织以及三株细胞株中RNF111基因的启动子区和功能区均无突变发生，说明该基因mRNA表达水平的差异不是由基因突变引起的；BSP和克隆测序的结果显示，在基因启动子区的-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化频率在95C和95D两株细胞株中有显着差异。-309位置的CpG位点甲基化的频率在95C和95D细胞株中分别是0%和40%；-109位置的CpG位点甲基化的频率分别是45%和0%；+3位置的CpG位点甲基化的频率分别是35%和5%，差异显着并且具有统计学意义（P<0.01）。说明RNF111基因启动子区的-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化状态可能调控该基因的转录水平，导致两株细胞株之间mRNA表达水平的差异。EMSA结果显示，针对-309、-109和+3位置的CpG位点设计的探针均可以与核蛋白结合，且只有针对-309位置CpG位点设计的未甲基化和甲基化的探针结合蛋白的量存在差异，暗示该位点可能是影响基因转录的重要原因。结论：我们的研究发现RNF111基因的mRNA在95D细胞株中表达量最高且与95C存在显着差异，说明该基因可能与肺癌恶性转移有关。SSCP结果显示该表达量的变化不是由基因突变引起的。BSP和克隆测序结果表明该基因启动子区-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化状态在两株细胞中有显着差异。EMSA实验也验证这些位点均可以与核蛋白结合，并且-309位置的CpG位点未甲基化与甲基化时结合的蛋白量存在差异，说明该位点甲基化状态可能是影响基因转录的重要原因。该位点的结合蛋白可能是负向调控转录因子，由于95D细胞株该位点的甲基化而降低负向调控转录因子的结合，导致mRNA表达量升高。至于该结合蛋白是否是转录因子，接下来还需要通过打质谱来证明。RNF111基因启动子区-309位点的甲基化状态与mRNA水平密切相关，这为NSCLC的早期诊断和抗肿瘤药物的研发提供新的靶点。
吴江乾[10]（2012）在《c-Ski、Smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义》文中认为目的：大肠腺瘤是一种具有癌变潜能的良性病变，80%以上大肠癌由大肠腺瘤癌变发展而来，管状腺瘤是大肠腺瘤最常见的病理组织学类型,其癌变是由多因素、多基因综合作用的结果,癌变机制尚不明确。目前,TGF-β/SMAD信号通路在肿瘤发生发展中作用的研究成为医学界关注热点，TGF-β/SMAD信号通路参与细胞增殖、分化等生理过程，生物信号经TGF-β/SMAD族配体与细胞膜表面的受体结合，由Smads蛋白传递给目的基因,通路中某些因子异常,可促进肿瘤发生发展。c-Ski基因属原癌基因，主要通过与TGF-β/SMAD信号通路下游转录因子Smad3结合形成复合物，阻止Smads蛋白磷酸化，抑制TGF-β/SMAD信号通路。研究发现c-Ski与人类多种肿瘤发生发展密切相关，有许多肿瘤细胞系如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺、胰腺癌等，具有转录活性和参与核转位的功能。Smads复合物可与目的基因结合调节下游相关因子转录，例如c-myc等。研究发现，在某些肿瘤中出现Smad3高表达，如绒癌和胶质母细胞瘤；在某些肿瘤中如肝癌、胃癌、和皮肤鳞癌中Smad3表达量下降，而在结肠癌细胞系SNU-769A和SNU-769B中出现Smad3基因突变。p15是一种抑癌基因，是TGF-β/SMAD信号通路下游的靶点，参与TGF-β/SMAD信号通路对细胞生长及增殖程序的调节，是细胞周期抑制因子。研究发现许多肿瘤出现p15基因发生缺失和突变，表达量降低，如膀胱移行细胞癌、食管癌、肝癌和胃癌等。目前有关TGF-β/SMAD信号通路相关因子c-Ski、Smad3和p15在散发性大肠腺瘤癌变中的意义研究国内外少见报道。本实验采用病理形态学观察结合免疫组织化学、Western blot、Real time-PCR以及细胞培养方法检测正常大肠粘膜、伴有不同程度异型增生的散发性大肠管状腺瘤和大肠腺瘤癌变组织中c-Ski、Smad3和p15蛋白及mRNA的表达情况及与临床病理特征关系，并进一步分析三者相关性，探讨三者在散发性大肠肠管状腺瘤癌变过程中的意义，为大肠腺瘤癌变预防和临床治疗提供理论依据。方法：1免疫组织化学方法采用免疫组织化学ElivisionTMplus两步法，研究20例正常大肠粘膜、81例散发性大肠管状腺瘤伴上皮异型增生病例、32例大肠管状腺瘤癌变病例中c-Ski、Smad3和p15蛋白表达情况。2蛋白免疫印记（Western blot）用Western blot方法检测18对新鲜大肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜以及HIEC和HT-29中c-Ski、Smad3及p15的表达情况。匀浆方法提取组织总蛋白；预冷的细胞裂解液加入细胞中，提取细胞总蛋白；经12%SDS-PAGE电泳，电转移到PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭1.5小时。一抗（c-Ski1:800；Smad31:5000；p151:500；）4℃过夜，二抗（1:8000）于37℃孵育1.5h，ECL显色。Odyssey仪器进行显色分析,Bio-LD图像分析系统进行定量分析。3Real time-PCR应用Real time-PCR检测了18对新鲜大肠腺瘤癌变组织和相应正常大肠粘膜组织以及HIEC和HT-29中c-Ski和Smad3mRNA的表达情况,采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct （ΔΔCt）方法计算,计算目的基因的相对表达量。4细胞培养体外培养人类正常结肠粘膜上皮细胞株（HIEC），用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素和0.625%胰岛素的RPMI-1640培养基培养；人类结肠癌细胞株（HT-29），用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基培养。细胞呈贴壁生长，取对数生长期的培养细胞，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，进行细胞传代以及细胞的收集，进行相关研究。5统计学分析应用SPSS Statistics17.0软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，数据分析采用t检验、χ2检验、wilcoxon符号秩和检验及spearman相关分析,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果：1c-Ski在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况1.1c-Ski蛋白的表达情况1.1.1免疫组织化学结果c-Ski在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴不同程度异型增生组及管状腺瘤癌变组中的阳性表达率逐渐升高，分别是10.00%（2/20）、55.56%（45/81）、81.25%（26/32）其中管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组中c-Ski的阳性表达率明显高于正常大肠粘膜，差异有统计学意义（P<0.05）。大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中c-Ski的阳性表达率逐渐升高,分别为28.13%（9/32）、60.00%（15/25）、87.50%（21/24）中、重度异型增生组c-Ski蛋白阳性表达率明显高于轻度异型增生组（P<0.05）。1.1.2c-Ski蛋白的表达与临床病理特征关系c-Ski蛋白阳性表达率与大肠管状腺瘤大小有关，腺瘤直径≥2cm组c-Ski蛋白阳性表达率高于腺瘤直径＜2cm组，分别为73.91%（34/46）和55.22%（37/67）（P<0.05）；而与患者性别、年龄和腺瘤发生部位无关（P>0.05）。1.1.3蛋白免疫印记（Western blot）结果在18对新鲜大肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜中,以β-actin（43KD）为内参,散发性大肠管状腺瘤癌变组织内c-Ski（85KD）蛋白表达显着高于正常粘膜组织，差异有统计学意义（P<0.05）。1.2c-Ski mRNA在散发性大肠管状腺瘤癌变组织与相应正常大肠粘膜中的表达情况Real-time PCR检测结果表明，44.44%（8/18）病例中c-Ski mRNA在肿瘤组织中的表达显着高于其匹配的正常肠粘膜组织。进一步分析发现，c-Ski mRNA在肿瘤组织的平均表达量较正常肠粘膜组织增加，有统计学意义（P<0.05）。2Smad3在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况2.1Smad3蛋白的表达情况2.1.1免疫组织化学结果Smad3在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴不同程度异型增生组及管状腺瘤癌变组中的阳性表达率分别是60.00%（12/20）、54.32%（44/81）、84.38%（27/32）管状腺瘤癌变组中Smad3蛋白的阳性表达率高于管状腺瘤异型增生组和正常大肠粘膜，有统计学意义（P<0.05）；管状腺瘤异型增生组中Smad3的阳性表达率稍低于正常大肠粘膜，无统计学意义（P>0.05）。大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中Smad3的阳性表达率分别为50.00%（16/32）、44.00%（11/25）、70.83%（17/24）Smad3蛋白的阳性表达率在不同程度异型增生组之间无明显差别（P>0.05）。2.1.2Smad3蛋白的表达与临床病理特征关系Smad3蛋白阳性表达率与患者性别、年龄、腺瘤发生部位和腺瘤大小无关（P>0.05）。2.1.3蛋白免疫印记（Western blot）结果在18对新鲜大肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜中，以β-actin（43KD）为内参，散发性大肠管状腺瘤癌变组织内Smad3（58KD）蛋白表达显着高于正常大肠粘膜组织，有统计学意义（P<0.05）。2.2Smad3mRNA在散发性大肠管状腺瘤癌变组织与相应正常大肠粘膜中的表达情况Real-time PCR检测结果表明，50.00%（9/18）病例中Smad3mRNA在肿瘤组织中的表达显着高于其匹配的正常肠粘膜组织。进一步分析发现，Smad3mRNA在肿瘤组织的平均表达量较正常肠粘膜组织增加，有统计学意义（P<0.05）。3p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中蛋白的表达情况3.1免疫组织化学结果p15在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴不同程度异型增生及管状腺瘤癌变组织中的阳性表达率逐渐降低，分别是85.00%（17/20）、56.80%（46/81）、31.25%（10/32）管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组中p15的阳性表达率明显低于正常大肠粘膜，有统计学意义（P<0.05）。大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中p15的阳性表达率分别为81.25%（26/32）、52.00%（13/25）、29.17%（7/24）中、重度异型增生组中p15的阳性表达率低于轻度异型增生组，有统计学意义（P<0.05）,重度异型增生组p15的阳性表达率低于中度异型增生组,无统计学意义（P>0.05）。3.2p15蛋白的表达与临床病理指标的特征关系p15蛋白阳性表达率与大肠管状腺瘤大小有关，腺瘤直径≥2cm组p15蛋白阳性表达率明显低于腺瘤直径＜2cm组，分别为32.61%（15/46）和61.19%（41/67）（P<0.05）；而与患者性别、年龄和腺瘤发生部位无关（P>0.05）。3.3蛋白免疫印记（Western blot）结果以β-actin（43KD）为内参，散发性大肠管状腺瘤癌变组织内p15（15KD）蛋白表达显着低于正常大肠粘膜组织，有统计学意义（P<0.05）。4c-Ski、Smad3和p15蛋白表达在散发性大肠管状腺瘤癌变中的相关性分析相关分析结果显示在散发性大肠管状腺瘤组织中c-Ski和Smad3之间呈正性相关（r=0.242,P<0.05）,c-Ski和p15蛋白表达呈负相关（r=-0.190,P<0.05）,Smad3和p15之间无明显相关性（r=-0.117,P>0.05）。5结肠癌细胞株HT-29中c-Ski、Smad3和p15的表达情况HT-29中c-Ski蛋白及mRNA表达显着高于HIEC，有统计学意义（P<0.05）；Smad3蛋白及mRNA表达显着高于HIEC，有统计学意义（P<0.05）；p15蛋白表达显着低于HIEC，有统计学意义（P<0.05）。结论：1在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中，c-Ski蛋白阳性表达率逐渐升高，p15蛋白阳性表达逐渐降低，Smad3蛋白阳性表达率在大肠腺瘤癌变组高于正常大肠黏膜和大肠腺瘤组。提示TGF-β/SMAD信号通路相关因子c-Ski、Smad3和p15在散发性大肠腺瘤癌变过程中可能发挥一定作用。2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中c-Ski与Smad3与间存在正相关关系,提示在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中，两者可能存在协同作用；c-Ski和p15间存在负相关关系, Smad3与p15间无明显相关性。3HT-29中c-Ski和Smad3蛋白及mRNA的表达高于HIEC, p15蛋白表达低于HIEC，提示三者在大肠癌的发生可能发挥一定作用。
二、c-ski原癌基因及其生物学活性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、c-ski原癌基因及其生物学活性（论文提纲范文）
（1）微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 芹菜素对TGF-β1刺激小鼠心肌成纤维细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 MiR-122-5p在芹菜素抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞分化和胶原合成中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 MiR-155-5p在芹菜素抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞分化和胶原合成中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第四部分 芹菜素抑制异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:微小RNA在心肌纤维化中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）沉默Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Ski免疫荧光检测 |
| 2.2.3 siRNA转染 |
| 2.2.4 CCK-8 法检测细胞增殖活力 |
| 2.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 |
| 2.2.6 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 2.2.7 蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 Ski在骨肉瘤U-2OS细胞中的表达 |
| 3.2 转染后细胞形态的观察 |
| 3.3 沉默Ski基因后对U-2OS细胞增殖活力的影响 |
| 3.4 沉默Ski基因后对U-2OS细胞周期的影响 |
| 3.5 沉默Ski基因后对细胞迁移能力的影响 |
| 3.6 Ski-siRNA组表达的Ski蛋白水平明显降低 |
| 3.7 沉默Ski基因对细胞中MMP-2和MMP-9 表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 中英文索引 |
（3）敲低Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞增殖和迁移的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 免疫荧光检测 |
| 1.2.3 si RNA转染 |
| 1.2.4 Western blot检测相关蛋白质水平 |
| 1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖活力 |
| 1.2.6 流式细胞术分析细胞周期 |
| 1.2.7 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ski在骨肉瘤U-2OS细胞中的表达 |
| 2.2 转染后细胞形态的观察 |
| 2.3 Ski-si RNA组的Ski蛋白质水平明显降低 |
| 2.4 敲低Ski基因后对U-2OS细胞增殖活力的影响 |
| 2.5 敲低Ski基因后对U-2OS细胞周期的影响 |
| 2.6 敲低Ski基因后对细胞迁移能力的影响 |
| 2.7 敲低Ski基因对细胞中相关蛋白质水平的影响 |
| 3 讨论 |
（4）Mstn基因敲除大鼠模型的建立及表型的初步分析Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响（论文提纲范文）
| 第一部分 Mstn基因敲除大鼠模型的建立及表型的初步分析 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. Mstn蛋白结构与水解酶切加工 |
| 2. Mstn的信号转导途径及调控 |
| 3. Mstn与疾病的关系 |
| 4. 构建Mstn基因敲除大鼠的必要性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. Mstn基因敲除大鼠的构建及鉴定 |
| 2. Mstn基因敲除对大鼠体重和体型的影响 |
| 3. Mstn基因敲除对肌肉发育的影响 |
| 4. Mstn基因敲除对大鼠体内脂肪含量和体外成纤维细胞脂肪诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. Fkbp51基因的功能 |
| 2. 肝脏的功能 |
| 3. 高通量测序技术类型及应用 |
| 4. 可变剪接 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验动物及测序 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1. 小鼠基因组可变剪接事件鉴定 |
| 2. 差异可变剪接的识别 |
| 3. GenBank数据库对可变剪接的验证 |
| 4. KO和WT共有,特异的差异可变剪接 |
| 5. 差异外显子跳跃基因GO功能及KEGG代谢通路分析 |
| 6. 差异内含子保留基因GO功能及KEGG代谢通路分析 |
| 7. 基因通过可变剪接的调控参与生物学过程和代谢通路 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Mstn基因对肌肉和脂肪的影响及在医学中的应用 |
| 摘要 |
| 1. Mstn的发现 |
| 2. Mstn时空表达的特异性 |
| 3. Mstn蛋白的结构特征 |
| 4. Mstn的蛋白水解加工和和活性调节 |
| 5. Mstn受体及受体后信号通路 |
| 6. Mstn基因缺失表型 |
| 7. Mstn在医学中的应用 |
| 7.1. Mstn与肥胖的关系 |
| 7.2. Mstn与肌肉萎缩和心衰的关系 |
| 7.3. Mstn与骨质疏松的关系 |
| 7.4. Mstn在整形美容中的潜在应用 |
| 8. Mstn在畜牧中的潜在应用 |
| 9. 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人基本情况 |
| 硕士期间发表论文情况及学术表现 |
（5）c-ski在食管鳞状细胞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果判断 |
| 1.4 随访 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 c-ski蛋白和c-ski mRNA在正常食管、食管上皮内瘤变、食管鳞癌组织中的表达情况 |
| 2.2 c-ski蛋白的表达与临床病理特征之间的关系 |
| 2.3 c-ski蛋白在食管鳞癌组织中的表达与患者五年生存率的关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 c-ski在食管鳞癌中的表达情况及与临床病理特征的关系 |
| 3.2 c-ski蛋白表达情况与食管癌患者预后的关系 |
（6）维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：维药ASMq对兔耳增生性瘢痕的体内动物实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分：维药ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞的体外实验研究 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ：维药ASMq基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕分子机制 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）旋毛虫抗肿瘤蛋白基因的克隆、表达及其诱导H7402细胞凋亡研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肝细胞癌与细胞凋亡研究进展 |
| 1.1 肝细胞癌的流行及发病机制 |
| 1.2 肝细胞癌治疗现状 |
| 1.3 疾病过程中的细胞凋亡 |
| 第2章 寄生虫及旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 2.1 寄生虫抗肿瘤研究现状 |
| 2.2 旋毛虫抗肿瘤现状及机制 |
| 2.3 旋毛虫抗肿瘤研究意义及展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 A200711 基因原核表达及蛋白纯化、复性 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 体内、体外实验检测 A200711 蛋白对 H7402 细胞增殖的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）C-ski、Smad7和TGF-β1在食管鳞状细胞癌中的表达和意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：TGF-β1 在 TGF_Smads 信号传导通路中的结构功能及与食管癌关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）RNF111基因启动子区甲基化与非小细胞肺癌转移关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、肺癌现状介绍 |
| 二、TGF-Β信号通路与肿瘤 |
| 三、RNF111 基因与肿瘤 |
| 四、表观遗传学 |
| 五、DNA 甲基化与肿瘤发生发展关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 英文简写对照表 |
| 致谢 |
（10）c-Ski、Smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 c-Ski基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、c-ski原癌基因及其生物学活性（论文参考文献）
- [1]微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究[D]. 王峰. 苏州大学, 2020(06)
- [2]沉默Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞生物学行为的影响[D]. 寇江力. 兰州大学, 2019(02)
- [3]敲低Ski基因对骨肉瘤U-2OS细胞增殖和迁移的影响[J]. 寇江力,赵鑫,王兴文,汪静,王拴科,张海鸿. 中国细胞生物学学报, 2018(01)
- [4]Mstn基因敲除大鼠模型的建立及表型的初步分析Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响[D]. 周志强. 北京协和医学院, 2016(02)
- [5]c-ski在食管鳞状细胞癌中的表达及意义[J]. 郭晓光,王琼,朱治键. 川北医学院学报, 2014(03)
- [6]维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕影响的实验研究[D]. 王虎军. 新疆医科大学, 2013(02)
- [7]旋毛虫抗肿瘤蛋白基因的克隆、表达及其诱导H7402细胞凋亡研究[D]. 李慧萍. 吉林大学, 2012(10)
- [8]C-ski、Smad7和TGF-β1在食管鳞状细胞癌中的表达和意义[D]. 郭晓光. 川北医学院, 2012(08)
- [9]RNF111基因启动子区甲基化与非小细胞肺癌转移关系的研究[D]. 卢芳. 苏州大学, 2012(10)
- [10]c-Ski、Smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义[D]. 吴江乾. 河北医科大学, 2012(12)