一、超声辐照对血管损伤模型内膜增生的影响（论文文献综述）
陈芳芳[1]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。
胡继盛[2]（2021）在《WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究》文中进行了进一步梳理背景血管的损伤后重构在临床上是常见的血管病理生理学过程,然而该过程往往导致预后不良,比如动脉管腔狭窄,动脉移植后增生,介入手术后血管内膜增生等。血管损伤重构过程不能及时处理,这将间接性的导致心血管疾病以及心血管相关的他并发症的发生。常见的并发症有动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑梗塞等。大量的低密度脂蛋白（low-density lipoproteins,LDL）逐渐积累到受损的血管内皮下空间中,被血管壁中的巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）摄取,摄取了脂质的巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞并逐渐演变成动脉粥样硬化。由脂质介导的炎症诱导了平滑肌细胞的大量增殖并且迁移到血管内膜。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的主要细胞组成部分,在血管受到外力、炎症等刺激后,位于血管中层的平滑肌细胞快速的发生表型转换、增殖,然后向血管内膜迁移,导致内膜增生,这就是新生内膜的形成过程,但是该过程的分子机制仍不清楚。前人的研究表明,VSMCs的增殖和迁移在血管内膜形成过程中有着至关重要的作用。肌动蛋白细胞骨架作为细胞的支撑基础,参与了众多的细胞生物学过程,比如细胞运动,表型转换,细胞的增殖和迁移等。细胞骨架的重构决定着细胞的运动,增殖等一系列的生物学过程。由于聚合的肌动蛋白相对稳定,因此需要特定的肌动蛋白调节蛋白来辅助,并促进肌动蛋白丝的分解。肌动蛋白丝解聚的生理意义不仅在于能够去除旧的肌动蛋白丝,而且解聚后形成肌动蛋白单体还可以补充用于新一轮肌动蛋白组装的肌动蛋白单体库。因此,肌动蛋白组装和解聚的平衡对于细胞骨架尤为重要。肌动蛋白解聚因子（Actin depolymerizing factor,ADF/Cofilin）通过切断肌动蛋白丝并从肌丝上解离肌动蛋白单体来促进肌动蛋白解聚。尽管ADF/Cofilin通常积聚在肌动蛋白细胞骨架动态的亚细胞区域,但是仅ADF/Cofilin单独作用,特别是高浓度时,对驱动肌动蛋白丝的快速解聚并不是十分有效。因此,当需要肌动蛋白单体快速周转时,其他的解聚因子需要与ADF/Cofilin配合来达到肌动蛋白快速解聚的效果。肌动蛋白相互作用蛋白1（Actin interacting protein 1,AIP1）,也称为WD重复结构域1（WD repeat domain 1,WDR1）,即使ADF/Cofilin被肌动蛋白丝饱和,也能强烈增强肌动蛋白丝的分解。作为ADF/Cofilin的主要辅助因子,WDR1介导的肌动蛋白动力学不仅对细胞极性的形成有着重要的调节作用,而且在细胞的增殖和迁移过程有着不可或缺的作用。前人的研究表明,VSMCs的迁移和增殖在血管形成过程中扮演着至关重要的作用,但是WDR1作为细胞骨架解聚因子的辅助因子,其在VSMCs中介导血管重构的作用机制仍不清楚。信号转导和转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）是Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路的重要因子之一,涉及到炎症以及其他各种细胞生物学过程,例如细胞分裂和细胞增殖等。前人的研究表明在血管损伤后的第七天内,磷酸化形式STAT3的水平显着升高,这表明STAT3对于血管新生内膜的形成至关重要。血管损伤后,STAT3的活化与WDR1的表达呈正相关,但是在VSMCs中,STAT3是否参与WDR1的表达调控还未可知。STAT3的激活和核转运是其发挥转录作用的前提,有研究表明STAT3的核转运是Ran和Importinβ依赖性的。细胞骨架响应于细胞微环境的改变和机械性刺激对众多的细胞生物学过程均有影响。WDR1是细胞骨架重构的重要因子之一,有报道称,在乳腺癌细胞中,Wdr1的缺失影响Importinβ的表达。综合以上几点,STAT3可能会通过促进WDR1的转录进而促进血管内膜的形成,反过来WDR1介导的肌动蛋白动力学也会影响STAT3的核贩运,WDR1-STAT3形成反馈环共同调节血管损伤后重构。目的本研究从分子、细胞、动物水平探究WDR1在血管损伤后重构中的作用机制,并阐释STAT3与WDR1之间的相互作用对血管损伤后重构过程的影响,进一步完善血管损伤后重构的分子调控网络,为临床治疗外周血管疾病提供线索。方法第二章:本研究通过颈总动脉结扎的方式构建小鼠血管损伤模型,在损伤不同天数通过颈椎脱臼法处死小鼠并按照不同实验目的取材。通过免疫组化、RT-PCR、Western blot等生物学方法检测血管损伤不同天数的血管中Wdr1的表达。同时,通过Western blot和明胶酶谱实验分别检测了增殖标志物PCNA的表达和基质金属蛋白酶9的活性。第三章:通过Cre-Loxp系统构建Wdr1条件敲除小鼠,设计引物,通过PCR鉴定小鼠基因型。腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg/天）诱导敲除Wdr1,利用Western blot和RT-PCR分别从蛋白质和RNA水平检测Wdr1的表达。然后通过手术损伤颈总动脉,通过HE染色检测血管内膜增厚情况。在敲降Wdr1后,利用TUNEL检测细胞的凋亡情况,同时通过免疫荧光检测p-H3和SMA的表达。通过明胶酶谱实验检测Wdr1敲除后MMP9的活性。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,体外加入4-OH他莫昔芬诱导原代细胞中Wdr1的敲除。检测细胞敲除效率以及凋亡后,再通过CCK8和划痕实验证实WDR1对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。第四章:过表达WDR1,通过Transwell和CCK8实验进一步证实WDR1对平滑肌细胞迁移和增殖的影响。在损伤不同天数的血管中,通过Western blot检测STAT3的激活,证实STAT3与血管损伤修复间的联系。体外通过AngⅡ和IL-6处理平滑肌细胞模拟血管损伤过程,利用划痕实验和CCK8检测AngⅡ和IL-6处理后的增殖和迁移能力。通过Western bloting和RT-PCR检测不同细胞因子处理后的Wdr1的表达。在平滑肌细胞中敲降STAT3,用AG490处理平滑肌细胞,检测WDR1的表达情况,在敲降STAT3的基础上过表达WDR1,检测细胞的增殖和迁移能力。在敲降Wdr1的基础上过表达Cofilin,免疫荧光实验、CCK8、Western blot和划痕实验证实WDR1介导的肌动蛋白动力学与平滑肌细胞增殖与迁移之间的关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀证实STAT3直接靶向Wdr1的启动子。第五章:敲降和过表达Wdr1后检测STAT3的表达与活化情况,探究WDR1能否对STAT3的表达和活化有影响。通过核质分离证实WDR1对STAT3的核转移的影响,Western blot、核质分离实验探究与STAT3核转移相关因子Ntf2、importinβ、Importinα、Ran的表达和核质分布情况。通过Transwell和CCK8实验验证Ntf2、Importinβ过表达对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果第二章:HE结果证实颈总动脉结扎可以有效诱导血管内膜增厚,并且免疫组化实验、Western blot和RT-PCR结果显示在损伤不同天数,Wdr1的表达呈现时间依赖性升高,在损伤第14天达到峰值、并且增殖标志物PCNA的表达也是呈时间依赖性升高。明胶酶谱实验结果提示在动脉损伤后MMP9的活性显着性提高。第三章:基因型鉴定结果显示Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠成功构建。Western blot和RT-PCR结果显示,他莫西芬注射后能够成功诱导小鼠动脉细胞中Wdr1的敲除。进一步的研究结果表明,Wdr1的敲除有效抑制血管损伤后血管新生内膜的形成。免疫荧光和明胶酶谱实验表明,在Wdr1敲除后,动脉中的细胞增殖和迁移能力被显着抑制了。TUNEL实验结果表明Wdr1的敲除不影响细胞的凋亡。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,Western blot和RT-PCR结果显示4-OH他莫西芬诱导后Wdr1成功敲除。划痕和CCK8实验结果显示Wdr1的敲除抑制了原代平滑肌细胞的增殖和迁移。第四章:Transwell实验和CCK8实验表明,过表达Wdr1增强了HAVSMCs细胞的增殖和迁移能力。在诱导增殖的HAVSMCs和损伤的血管中,Western blot结果显示STAT3的磷酸化水平显着升高。HAVSMCs中敲降STAT3可显着性抑制其增殖和迁移,并且通过JAK2的特异性抑制剂处理HAVSMCs也能得到相同结果。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀结果提示STAT3通过靶向Wdr1来促进其转录的。Western blot和免疫荧光实验结果提示,肌动蛋白动力学是WDR1介导的平滑肌细胞增殖和迁移所必需的。第五章:Western blot结果提示WDR1的缺失并不影响STAT3的表达和激活。核质分离的结果显示,WDR1缺失抑制了活化的STAT3的核转移。进一步的Western blot和核质分离结果显示WDR1的缺失抑制了Importinβ的表达和Ran的核质分布,从而抑制活化的STAT3的核转移。结论血管损伤修复是一个复杂的生物学过程,受到多种因素的影响。各种转录因子,炎症因子等共同构成一个调控网络,参与血管新生内膜的形成。本研究本研究揭示了WDR1调控血管内膜形成的分子机制,主要是STAT3调控Wdr1的表达以及WDR1缺失对STAT3核转运影响的分子机制。STAT3在血流动力学改变和炎症因子刺激的作用下大量激活并转运入核参与血管内膜形成的分子调节过程。高表达Wdr1能够显着促进VSMCs的增殖和迁移,以此来促进血管新生内膜的形成。当抑制STAT3的激活时,Wdr1的表达显着下调,同时平滑肌细胞的增殖和迁移能力显着下降、血管内膜形成也被显着抑制了。随后的荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验结果表明STAT3与Wdr1基因的启动子相结合并促进Wdr1的转录。反过来,WDR1的缺失抑制了核转运因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）和Importinβ的表达,进而影响阻碍STAT3的核转运;同时,在敲降Wdr1的平滑肌细胞中,Ran的核质比显着下降,进一步说明WDR1对于STAT3的核转运至关重要。本研究以细胞骨架解聚因子WDR1为切入点,重点阐明了WDR1影响血管新生内膜形成的分子机制,为研究血管内膜增生发生发展的机制提供了新的见解,为临床上治疗术后血管内膜增生提供了线索。
赵小林[3]（2021）在《负载MCC950的粘附型双网络水凝胶用于动脉损伤的止血修复》文中指出创伤性出血是严重外伤后死亡的主要原因。全身血容量不足会引发机体一系列的应激反应,严重影响患者的愈后,甚至危及生命。所以及时止住出血是急救的第一要务。生物粘合剂是一种生物医学材料,可以广泛的用于止血、组织缝合、术中防止组织粘连和气体液体泄漏等方面。因为其良好的粘附性和生物相容性在组织工程器官修复领域展现出广阔的应用前景。水凝胶是类似于天然软组织和细胞外基质的亲水性的交联聚合网络,由于具有安全性高、透气性好、可降解等多种优势,成为理想的生物粘合剂的材料选择。但在持续血流的情况下,一般的水凝胶对湿润和可移动的组织表面粘附能力弱,机械强度不够,不能有效的粘附在伤口的表面控制出血。为了解决这一问题,我们利用共价网络和氢键的协同作用,设计出一种具有双层结构的双网络水凝胶。一方面,共价键赋予水凝胶基质层整体较高的力学强度,氢键则可以通过能量耗散改善基质层韧性;另一方面,在界面粘附处,氢键促进水凝胶与生物组织的快速贴合,共价作用则进一步提高水凝胶的粘附强度。以上两方面共同促进水凝胶对生物组织的强粘合以及自身的力学强度的提高,实现对伤口的快速粘附止血。水凝胶同样为药物输送应用提供了可扩展和可调控的平台。分子层面的自组装利用吸引力和排斥力的相互作用,使药物和其他活性分子可通过介导结合或共价整合而掺入材料,特别是双网络的水凝胶可以同时具备自组装和共价网络的有益特性,在药物的靶向递送方面有着广阔的发展前景。止血后伤口的愈合和受损的组织器官功能恢复同样重要。特别是当血管损伤时,早期过度的炎症反应会严重影响破损处的修复,修复不良时,血管内膜会出现增生,进而导致破口处的血管出现狭窄,影响血管的长期通畅。炎症反应的关键是NLRP3炎症小体的激活,早期抑制激活的过程可以控制炎症的发展,避免过度增生造成的血管堵塞。MCC950是一种高效的NLRP3炎症小体抑制剂,我们将其修饰在构建的双网络水凝胶基质层,将水凝胶作为载体在伤口处靶向释放小分子MCC950,从而达到控制早期炎症的发生发展,保证血管在止血粘附后的修复和保持长期通畅。方法:1、双网络水凝胶的制备和性能测试首先,我们以N-羟乙基丙烯酰胺（HEAA）、多聚-L-赖氨酸（PLL）、壳聚糖（CS）等为原料,制备出具有双网络结构的双层水凝胶贴片,扫描电镜（SEM）、红外光谱、热重分析（TGA）等技术对其进行表征,用力学拉伸仪测试其力学强度和与其他各种生物组织的粘附性能,CCK-8实验检测水凝胶对细胞的毒性,并在大鼠皮下植入,数周后取材进行HE染色,检测水凝胶贴片的生物相容性,为下一步的动物实验提供依据。2、大动物实验验证双网络水凝胶的粘附止血效果我们将制备好的双网络水凝胶贴片用于大动物器官损伤模型上来验证其粘附止血的效果。我们首先用手术刀分别划破比格犬和小香猪的肝脏,将水凝胶贴片贴在其正在出血的伤口部位,观察其是否可以瞬时粘附在器官进行止血。同时我们选择了具有强大血流冲击的动脉血管损伤模型,手术刀划破家犬和小香猪的股动脉,然后将凝胶贴片缠绕在破损处观察其对正在出血的动脉表面的粘附止血效果。3、负载MCC950的双网络水凝胶对股动脉损伤的止血修复效果止血后为了让伤口更好的得到修复,我们将小分子抑制剂MCC950加入到合成的水凝胶基质层以达到药物的靶向释放,从而抑制伤口早期过度的炎症反应。首先进行体外实验,先用CCK-8细胞活性实验测试了小分子药物MCC950的毒性,并做了药物标准浓度曲线和水凝胶药物释放曲线来确定药物释放量,然后同样利用小香猪的股动脉损伤模型,对伤口进行粘附止血。在2周后用多普勒超声检测血管通畅程度,并取材进行HE、Masson染色,与未加药物组进行对比,评价MCC950对血管损伤的修复效果。结果:1、我们成功的制备了具有双层结构的双网络水凝胶。SEM结果显示其内部存在均匀的共价网络结构,红外光谱和TGA结果证明了氢键的存在与共价键的合成,这为粘附时实现共价键和氢键的共同作用提供可能。力学拉伸实验和粘附实验证明我们构建的水凝胶网络可以提供足够的力学支撑,与生物组织的粘附性强,CCK-8细胞活性检测测试了水凝胶的毒性,大鼠皮下植入实验的HE切片染色显示水凝胶与生物组织的相容性较好,无明显的排斥反应发生。2、通过大量的大动物实验来验证构建的双网络水凝胶贴片是否可以成功用于组织器官的止血,在动脉损伤模型中,在有涂层的水凝胶贴片缠绕伤口稍加按压后,动脉出血停止,贴片粘附紧密未发生脱落;在肝脏损伤模型中,水凝胶同样可以粘附在出血的伤口表面并起到了止血的效果。3、体外CCK-8实验结果显示,一定浓度下的MCC950不具有细胞毒性,选择了合适的浓度将药物加入合成的双网络水凝胶基质层后测定其可以进行药物释放。动物实验与未加MCC950的水凝胶组进行对比,HE、Masson染色显示药物组的血管修复情况较好,炎症细胞浸润明显减少,多普勒超声显示药物组的血管通畅度好于未加药组。结论:负载MCC950的具有双层结构的双网络水凝胶贴片,在紧密粘附组织器官的创伤性出血伤口的同时,可以靶向的释放出抑制炎症反应的小分子MCC950,在达到急救止血的目的的同时,也有利于伤口的愈合和组织器官的功能恢复。
白丛霞[4]（2021）在《OVGP1升高血压的机制研究及高血压脑出血circRNA标志物研究》文中进行了进一步梳理目的:高血压是一种由环境和遗传因素共同决定的复杂疾病。近年来有证据表明表观遗传参与高血压病理过程,但其机制尚未阐明。DNA甲基化是表观遗传学调控的方式之一,本课题组前期发现高血压人群中输卵管糖蛋白1（Oviductalglycoprotein 1,OVGP1）启动子区cg20823859位点甲基化程度降低,在高血压人群血浆和大鼠球囊损伤血管重塑模型中OVGP1表达上调。然而,OVGP1参与血压调节和血管重塑的具体机制尚不清楚。本研究主要通过构建转基因和敲除小鼠模型,观察过表达和敲除OVGP1后血压和血管重塑的变化及分子机制,旨在探讨OVGP1参与血压调节和血管重塑的具体分子机制,为高血压新药的开发及血管重塑性疾病的治疗提供理论依据。方法与结果:通过构建全身性Ovgp1转基因小鼠（Transgenic,TG）,TG和同窝对照小鼠（Wild type,WT）采用尾套法和电子监测血压发现TG小鼠的收缩压和舒张压均高于WT同窝小鼠;血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）（490ng/kg/min）诱导后,与WT小鼠相比,TG组小鼠的血压显着升高。采用CRISPR/CAS9的技术构建了 Ovgp1全身性敲除小鼠（Knockout,KO）。通过尾套法和电子监测血压发现,与对照组（WT）相比,KO组小鼠的血压在基础水平和AngⅡ诱导后在均低于其同窝WT小鼠。为了探讨OVGP1引起血压升高的可能机制,本研究采用免疫组织化学染色和免疫荧光染色的方法检测了小鼠不同组织中OVGP1的表达,结果显示OVGP1在全身组织广泛性表达,在血管组织中表达较高,主要在血管中膜平滑肌层表达。在重塑血管中表达升高,且主要在新生的内膜中表达,主要是增生的平滑肌细胞。小鼠血尿生化指标检测发现过表达OVGP1对小鼠肾功能无显着影响。通过小动物超声观察到过表达OVGP1后可增加主动脉直径,但对心脏结构和射血功能均无明显影响,因此推测OVGP1可能通过影响血管重塑发挥作用。采用AngⅡ诱导的血管重塑模型,经超声、HE、Masson染色显示TG小鼠主动脉壁增厚,胶原沉积增加;实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）显示TG组小鼠炎症因子IL-6、MCP-1表达升高,纤维化因子CollagenⅠ表达升高,α-Smooth Muscle Actin（α-SMA）表达降低;免疫荧光染色表明TG组CollagenⅠ表达升高,α-SMA表达降低;DHE染色发现与WT相比,TG组血管活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生增加,RT-PCR检测发现TG组NADPH、NOX2表达水平上调。进一步病理染色结果显示敲除OVGP1减轻了AngⅡ诱导的血管壁增厚,胶原沉积和氧化应激;RT-PCR检测发现敲除OVGP1减轻了AngⅡ诱导的炎症因子IL-6、MCP-1表达升高。进一步构建了小鼠股动脉损伤模型,分别在第14天和第28天取材进行HE染色和新生内膜厚度、内膜与中膜比（I/M）统计。结果发现,过表达OVGP1促进血管损伤后内膜增生,敲除OVGP1抑制血管损伤后内膜增生。免疫荧光染色发现过表达OVGP1促进新生内膜中PCNA和MMP9表达升高。血管张力实验发现,与WT相比,TG组小鼠苯肾上腺素（Phenylephrine,PHE）诱导的肠系膜上动脉血管收缩张力增加,内皮依赖性舒张剂乙酰胆碱（Acetylcholine,ACH）和非内皮依赖性舒张剂硝普纳（Sodium Nitroprusside,SNP）诱导的肠系膜上动脉血管舒张功能降低。在AngⅡ诱导后,进一步加重了上述的血管功能障碍。KO小鼠血管张力实验发现,与WT相比,敲除OVGP1减轻了AngⅡ诱导的肠系膜上动脉血管功能障碍。为探讨OVGP1在平滑肌细胞中的功能机制,本研究在人主动脉平滑肌细胞中过表达OVGP1后采用转录组测序,共检测到781个差异基因,与敲低OVGP1的表达谱芯片结果取交集,共得到155个共同差异表达的基因。GO和KEGG分析发现,差异基因主要参与胞外基质重塑,调控细胞增殖,磷酸化信号转导,参与细胞迁移,炎症反应等过程,参与Wnt信号通路、PI3K-AKT等信号通路。这些通路与血管重塑密切相关,选取在多条通路中均有参与的基因进行RT-PCR和Western blot验证,发现WNT2和IGFBP5在过表达OVGP1后显着上调,可能是OVGP1的靶基因之一。采用CCK8和Transwell小室迁移实验,发现过表达OVGP1引起平滑肌增殖、迁移和ROS产生,在PDGF-BB诱导后加重了这一反应,敲低OVGP1后抑制了PDGF-BB引起的增殖和迁移。PI3K-AKT信号通路在上述结果中被显着富集,且在心血管疾病中具有重要的作用。检测过表达和敲低OVGP1后AKT通路变化,结果显示,过表达OVGP1后AKT的磷酸化水平升高,PDGF-BB诱导后进一步升高;敲低OVGP1抑制了AKT磷酸化水平,表明AKT是OVGP1的下游通路。为进一步明确OVGP1的作用机制,本研究采用质谱检测的方法筛选OVGP1相互作用蛋白并采用ColP进行验证,结果发现OVGP1与MYH9在平滑肌细胞中相互作用,并在平滑肌细胞和主动脉血管中存在共定位。敲低MYH9抑制了过表达OVGP1引起的平滑肌细胞氧化应激和肥大,抑制了OVGP1下游通路AKT的磷酸化水平。在动物水平上给予MYH9抑制剂布雷他汀（Blebbistatin,BLEB）后,观察TG小鼠血压水平和血管重塑情况,结果显示,与对照组（Saline）相比,MYH9抑制剂BLEB显着改善了过表达OVGP1引起的血管重塑和血压升高;改善了过表达OVGP1引起的血管功能障碍。结论:OVGP1通过与MYH9相互作用,激活下游AKT信号通路,ROS产生增加,引起血管氧化应激、炎症和胶原沉积,导致血管重塑及功能障碍,引起血压升高。目的:环状RNA（circRNA）由于在外周血中较为稳定,可作为疾病诊断较有潜力的生物标志物,circRNA参与缺血性脑卒中的病理生理过程,然而在出血性脑卒中的表达特征和功能机制尚不清楚。本研究旨在探讨高血压脑出血（ICH）后circRNA的表达特征和潜在的诊断价值。方法与结果:本研究采用转录组测序（RNA-seq）的方法在发现人群（44例ICH患者,42例高血压（HTN）对照和43例脑梗死（CI）患者）和独立的验证人群（20例ICH患者,18例HTN对照和16例CI患者）中检测circRNA的表达谱。通过在两个人群中进行ICH vs HTN和CI vs HTN比较,发现15个circRNA包括5个上调和10个下调circRNA仅在ICH中一致性表达。进一步采用实时定量聚合酶链反应在所有样本中对候选circRNA进行验证,结果发现,与HTN和CI相比,ICH中的 hsacirc0001240 和 hsacirc0001947 表达上调,hsacirc0001386 表达下调。采用逻辑回归分析发现,与HTN相比,3个circRNA组合诊断ICH的曲线面积为0.92,敏感性为86%,特异性为88%。结合ICH危险因素,3个circRNA组合诊断ICH的曲线面积为 0.97。Spearman 相关性分析表明,hsacirc0001240,hsacirc0001947和hsacirc0001386的表达水平与ICH危险因素相关。circRNA-miRNA-mRNA网络分析表明,circRNA的靶标miRNA和mRNA的功能与ICH的病理过程相关,包括赖氨酸降解,脂肪酸代谢与生物合成,整联蛋白细胞表面相互作用和免疫系统功能。结论:这是首次报道ICH外周血中circRNA的表达谱,并提出三种circRNA可作为ICH的潜在生物标志物。
刘淼[5]（2020）在《右上肢缺血预处理对经右侧桡动脉途径冠状动脉介入术后患者桡动脉闭塞的影响及其机制》文中认为研究背景:冠状动脉造影技术一直被认为是诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的金标准。自1989年Campeau介绍经桡动脉途径冠状动脉造影技术和1993年Kiemeneij介绍了经桡动脉途径冠状动脉介入治疗技术以来,桡动脉途径逐渐被认为是心脏导管技术的主要入路点。大量的临床研究表明经桡动脉途径冠状动脉造影明显优于经股动脉途径冠状动脉造影,主要表现在:第一、有更少的术后并发症;第二、患者具有更好的手术耐受性;第三、患者住院时间相对更短,患者住院费用相对要少。因此经桡动脉途径经皮冠状动脉造影技术更受广大心内科介入手术医师及患者的欢迎。然而经桡动脉途径仍然具有不利于患者的术后并发症,其中最主要的是桡动脉闭塞症。桡动脉闭塞多数是无症状不易被发现的,因为手掌部接受双重供血。然而桡动脉一旦闭塞,将会限制将来再次进行经桡动脉途径冠状动脉造影术,限制冠状动脉旁路移植术和血液透析患者导管瘘等操作的执行。因此辨别并避免桡动脉闭塞的危险因素、增加有益因素和预防及抑制桡动脉闭塞事件的发生非常重要。经桡动脉途径冠状动脉造影术后桡动脉闭塞有两个主要的发病机制:血栓形成和血管内膜增生。经桡动脉途径冠状动脉造影技术可导致血管内膜损伤,桡动脉血管内皮平滑肌细胞功能紊乱,使血流介导的血管舒张功能降低。桡动脉CT扫描和血管内超声等检查以及组织功能研究表明桡动脉插管后桡动脉结构和功能发生重要改变。如果桡动脉鞘管直径超过桡动脉内径,桡动脉内皮层可能会受到严重破坏。这种内皮损伤是血流介导的血管舒张功能的降低的重要原因,同时也是内皮增生和桡动脉闭塞的关键因素。目前关于缺血预处理的研究是一个热点问题,主要是缺血预处理对靶器官及组织的保护效应。目前研究的范围较广,由最早的远端缺血预处理对心脏的保护效应到肝脏、肺脏、脑、肾等组织器官的保护效应均有研究。关于缺血预处理保护组织器官的作用机制的研究也越来越多,主要是神经内分泌的激活,引起机体释放一些体液保护因子,从而对机体产生抗炎、抗血小板聚集、保护血管内皮功能等作用。因此,我们设想缺血预处理可能对距离处理位点最近的动脉血管有一定的保护作用,我们以观察经桡动脉途径经皮冠状动脉造影术后桡动脉闭塞为出发点,研究缺血预处理对桡动脉闭塞的影响,以及桡动脉闭塞的危险因素。研究目的:1.缺血预处理对桡动脉闭塞的影响;2.识别桡动脉闭塞的危险及保护因素;3.观察缺血预处理对桡动脉闭塞的远期影响。研究方法:1.选取2017年9月至2018年4月我院首次行选择性冠状动脉造影且诊断为急性冠状动脉综合征的患者。我们根据预实验结果估算本研究单组所需最低样本量为290例,我们连续入选了 755例行选择性冠状动脉造影和介入治疗的患者;最终,322例患者在冠状动脉造影前接受缺血预处理并入组,318例患者入未行缺血预处理组。有115例患者因不符合入组标准,符合排除标准而被排除。入选患者根据其住院号的奇数或偶数被随机分为缺血预处理组（IC）和非缺血预处理组（non-IC）,2.签订同意行经桡动脉途径冠状动脉造影术知情同意书和同意进行该临床研究的知情同意书;3.所有患者术前均进行桡动脉直径测量。根据手术顺序,给予缺血预处理组患者行缺血预处理,用水银血压计将袖带绑在右上臂,给予加压至200mmHg,持续约5min,然后释放,持续约5min,共4个循环。4.经桡动脉途径冠状动脉造影术:给予双重抗血小板药物治疗,阿司匹林300mg,氯吡格雷600mg或者替格瑞洛180mg.根据患者手术顺序,患者依次送入导管室行冠状动脉造影介入治疗。常规选取右侧桡动脉作为冠状动脉造影首选入径血管,桡动脉穿刺点选取距离桡骨茎突2-3cm,搏动最强点,用2%利多卡因局麻,以20G穿刺针采用Seldinger技术进行桡动脉血管穿刺,穿刺成功见回血后沿穿刺针送入导丝,沿导丝置入动脉鞘管,经鞘管侧孔给予普通肝素至少3000U,如有需要术者根据患者情况及公斤体重酌情增加剂量（普通肝素100IU/kg）。冠状动脉血管成形术应用6F指引导管,术后立即拔除桡动脉鞘管。5.术后均用标准的旋压式动脉压迫止血带进行压迫止血,以刚能触到桡动脉搏动为标准,每1.5-2小时左右给予压迫止血带减压1圈直至完全减压。6.术后第二天行桡动脉B超,查看患者桡动脉通畅情况;7.记录桡动脉缺血结束至行经桡动脉途径冠状动脉造影时间,术前桡动脉直径,围手术期间患者用药,研究患者年龄,性别以及病史,检验指标等因素。8.随访9.所有数据采用SPSS 23.0统计软件进行处理。连续变量正态分布计量资料均采用均数±标准差来表示,分类记数资料用百分率表示。连续变量资料使用独立样本T检验进行比较。计数资料比较使用卡方检验。对影响桡动脉闭塞的因素建立Logistic回归模型,来分析识别桡动脉闭塞的各项危险因素及其对桡动脉闭塞的影响;P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.缺血预处理组与非缺血预处理组临床资料的比较缺血预处理组共322例患者,术后24小时有3位发生桡动脉闭塞,闭塞率为0.93%;非缺血预处理组共318例患者,术后24小时有14例患者出现桡动脉闭塞,闭塞率为4.4%;两组比较,缺血预处理组桡动脉闭塞率明显降低,P=0.006.2.早期桡动脉闭塞危险因素分析桡动脉闭塞组β受体阻滞剂应用率明显低于非桡动脉闭塞组（41%&69%,P=0.014）;桡动脉闭塞组曲美他嗪应用率明显低于非桡动脉闭塞组（17.6%&49.1%,p=0.01）;桡动脉闭塞组桡动脉内径明显小于非桡动脉闭塞组（2.31 ±0.53&2.59±0.47,P=0.015）;桡动脉闭塞组缺血预处理率明显低于非桡动脉闭塞组（17.6%%51.2%,p=0.006）.3.早期桡动脉闭塞的独立危险因素将桡动脉内径,缺血预处理,β受体阻滞剂,曲美他嗪等放入多元Logistic回归模型,结果显示桡动脉内径小为冠状动脉造影术后早期桡动脉闭塞的独立危险因素。缺血预处理及β受体阻滞剂是桡动脉闭塞的保护因素。4.随访术后约第650天左右随访时发现,缺血处理组与非缺血处理组两组桡动脉内径较术前均明显减小。缺血处理组随访前后桡动脉内径比P=0.024;非缺血预处理组随访前后桡动脉内径比之P=0.047。约术后890天左右再次随访上次现场随访患者,两次随访桡动脉内径未见明显差异。研究结论:缺血预处理可能有益于降低经桡动脉途径冠状动脉介入治疗术后24小时内桡动脉闭塞率。桡动脉内径小,是冠状动脉造影术后24小时桡动脉闭塞的独立危险因素。缺血预处理以及β受体阻滞剂的应用可能是桡动脉闭塞的保护因素。经皮冠脉介入治疗可能会导致术后桡动脉内径一定程度的减小。背景经桡动脉途径冠脉介入治疗因其更少的术后并发症、减少患者住院时间、降低患者住院费用、增加患者术后舒适度等优势被广大术者及患者所接受,但经桡动脉途径冠脉介入治疗方法可导致桡动脉血管损伤,主要涉及以下4个方面:1.桡动脉内径与鞘管大小之间的关系在桡动脉急性损伤中起重要作用;2.桡动脉穿刺引起桡动脉内膜撕裂;3.鞘管的拉伸效应和鞘管本身的通过;4.导管在插入和撤出桡动脉的过程中桡动脉痉挛。手术过程中对桡动脉的损伤可引起相应的并发症,如穿刺部位的出血、缺血、血肿、假性动脉瘤、动静脉瘘等,其中最重要是桡动脉闭塞。桡动脉闭塞的原因主要是桡动脉损伤后诱发桡动脉内原位血栓形成及桡动脉内中膜增生。肢体缺血预处理即多数文献提及的远端缺血预处理,其实施过程是通过对血压袖带进行充气,压力达到阻断肢体动脉血流得目的并持续几分钟,然后将血压袖带放气使得肢体血流再通并持续几分钟,如此反复几个循环。其作用过程使得神经内分泌激活,促使机体释放保护性因子,最终起到改善血管内皮功能、抗炎、抗血小板聚集、抗氧化应激、甚至抗细胞凋亡等效果,进而发挥其保护缺血再灌注组织器官的作用。我们的临床观察研究发现肢体缺血预处理可能有助于降低桡动脉闭塞率,但其机制不明。目的本研究旨在探讨肢体缺血预处理降低经桡动脉途径冠脉介入治疗术后桡动脉闭塞的可能机制。通过动物模型模拟经桡动脉途径冠脉介入治疗过程对桡动脉的损伤过程,研究缺血预处理对兔股动脉经机械损伤后机体反应的影响。方法将24只新西兰大白兔分为4组,分别为正常对照组（Control）:不进行缺血预处理,不进行股动脉穿刺,第一天采血5ml,第二天采血5ml后解剖兔右侧股动脉。缺血预处理组（IC）:对兔右侧下肢进行缺血预处理,不对股动脉穿刺。缺血预处理后第二天解剖兔右侧股动脉,缺血处理前及解剖前分别采血5ml;单纯股动脉穿刺组（P）:对兔右侧股动脉单纯进行股动脉穿刺留鞘。第二天解剖右侧穿刺留鞘股动脉,股动脉穿刺前及解剖前分别采血5ml;缺血预处理+股动脉穿刺组（ICP）:对兔右下肢进行缺血预处理,1.5小时后进行股动脉穿刺留鞘,第二天行穿刺股动脉解剖,缺血预处理前及股动脉解剖前分别采血5ml。对血液标本离心并分装,检测兔穿刺留鞘前后血浆中血管性血友病因子（vWF）、E选择素、P选择素、组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、纤溶酶原激活剂抑制物（PAI-1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）等。留取损伤血管组织,并观察损伤血管的病理变化及血管内皮PI3K/AKT/eNOS通路蛋白的表达。结果1.各组兔右侧股动脉内径及基础血浆指标的比较:术前四组兔右侧股动脉内径组间比较采用单因素方差分析,显示四组间无显着差异（p>0.05）。各组干预前兔血清vWF、P选择素、E选择素、tPA、PAI-1、NO、ET、TNF-a、IL-6、IL-10 水平无显着差异。2.各组处理前后血浆指标的比较。正常对照组与单纯缺血预处理组比较,血浆vWF、P选择素、ET-1、tPA、PAI-1、IL-6、IL-10、TNF-a 水平两组间无显着差异,但血浆NO水平在缺血预处理组明显升高。血浆vWF、P选择素、E选择素、PAI-1、IL-10、ET-1水平在单纯股动脉穿刺留鞘组和缺血预处理+股动脉穿刺留鞘组均明显升高。vWF、PAI-1两组间升高幅度无显着差异。缺血预处理组+股动脉穿刺留鞘组术后血浆P选择素、ET-1术后水平升高幅度显着低于单纯股动脉穿刺留鞘组。血浆IL-6、TNF-a水平在单纯股动脉穿刺留鞘组术后较术前明显升高,两者血浆水平在缺血预处理+股动脉穿刺留鞘组术后较术前未见显着差异,且两指标在缺血预处理+股动脉穿刺留鞘组术后升高值显着低于单纯股动脉穿刺留鞘组。血浆tPA水平在单纯股动脉穿刺留鞘组和缺血预处理组+股动脉穿刺留鞘组均显着降低,两组间血浆tPA水平术后较术前降低幅度无显着差异。血浆NO水平在单纯股动脉穿刺留鞘组术后较术前显着降低,其在缺血预处理+股动脉穿刺留鞘组术后较术前无显着差异,且血浆NO水平在缺血预处理组+股动脉穿刺留鞘组降低幅度显着低于单纯股动脉穿刺留鞘组。3.病理结果:1)HE染色对照组及缺血预处理组HE染色显示兔股动脉内膜完整,弹力膜连续,内皮细胞清晰可见;股动脉穿刺组和缺血预处理组+股动脉穿刺组兔股动脉,内皮细胞部分脱失,内膜连续性中断,弹力膜断裂明显,且部分存在中膜变性。2)免疫组化检测四组血管内皮PI3K、AKT、eNOS的表达情况。单纯缺血预处理组与正常对照组相比,发现缺血预处理组血管内皮P13K、AKT、eNOS表达明显增强;缺血预处理组+股动脉穿刺留鞘组与单纯股动脉穿刺留鞘组相比血管内皮P13K、AKT、eNOS表达明显增强。结论抗炎、改善内皮功能、调节黏附分子的释放可能是缺血预处理抑制血栓形成,进而影响桡动脉闭塞率的作用机制。缺血预处理通过PI3K/AKT/eNOS蛋白通路调节血管内皮释放NO进而发挥其作用。
付大鹏[6]（2020）在《新型载药纳米体系的构建及其促进血栓溶解作用的研究》文中研究说明目的:血栓是临床上最常见的一类心脑血管疾病,之前的研究表明含铁纳米粒子具有很好的磁热效应,可用于深部血栓热疗。因此,在本项研究中,通过化学方法合成了Fe3S4纳米颗粒,对其特性进行了鉴定,并通过对氧化损伤下血管内皮细胞的保护作用,并结合目前科学研究领域较为先进的二代测序技术对其潜在机理进行了初步的探讨,探索建立负载尿激酶型纤溶酶原激活剂的纳米载药体系,探讨及其在体内外药物释放情况及体内外对血栓作用效果。方法:1)Fe3S4纳米颗粒的合成采用化学方法,Fe3S4纳米颗粒的形态和大小通过透射电镜（TEM）进行鉴定;Fe3S4纳米颗粒的晶相通过X射线衍射（XRD）进行测;Fe3S4纳米颗粒的氧化状态分析采用X射线光电子能谱技术进行分析;Fe3S4纳米颗粒中释放的铁离子浓度采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）进行测定。Fe3S4纳米粒子的磁热转换性能采用外交变磁场（AMF）处理进行评价。Fe3S4纳米颗粒的光热性能,采用808nm激光处理进行评价。收集模型小鼠的各种内脏组织,制成石蜡切片后用进行HE染色,用显微镜观察组织特征。此外,还同时收集了对照组及Fe3S4处理组实验动物的外周血并检测了其丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶活性;2)用过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及肺血管内皮细胞（PVECs）,并用808nm（0.33Wcm-2）激光和AMF（4.2×109amm-1s-1）对细胞进行处理,通过MTT,流式细胞术,ELISA及蛋白免疫法等探究Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF刺激下对HUVEC及PVECs细胞增殖、凋亡以及氧化损伤的影响;3)取对数生长期的HUVEC,采用过氧化氢处理,并用808nm（0.33Wcm-2）激光和AMF（4.2×109amm-1s-1）对细胞进行处理,收集过氧化氢处理组及Fe3S4+NIR+AMF处理组细胞,通过二代测序的方法比较Fe3S4纳米颗粒处理及未处理的血管内皮细胞基因表达差异。根据测序结果,筛选HSP70为目标基因。体外培养HUVEC,并将细胞随机分成空白对照培养组,H2O2处理组,H2O2处理组+Fe3S4纳米颗处理组（H2O2+NIR+AMF）,并通过荧光定量PCR实验及WB实验,比较了各处理组中HUVEC细胞内,热休克蛋白70在m RNA以及蛋白层面的表达水平;随后,在HUVEC中转染HSP70的sh RNA,并分为以下几组:control,sh RNA NC组及sh RNA组,并通过MTT,流式细胞术,ELISA及蛋白免疫法等探究Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF刺激下,经过不同方式的处理,不同组别中HUVEC的活力、凋亡率以及细胞各种氧化应激指标的变化情况;4)采用化学方法合成尿激酶型纤溶酶原激活剂（u PA）-Fe3S4纳米颗粒复合物（u PA-Fe3S4）,u PA-Fe3S4纳米颗粒的直径大小的测量以及其形态特点的鉴定,采用通过透射电子显微镜（TEM）,u PA-Fe3S4纳米颗粒的光热性能,采用808nm激光处理进行评价。用紫外-可见-近红外分光光度计在体外检测u PA的释放量,建立动物血栓模型,收集血栓块,用808nm激光处理,进行体外血栓热疗实验;在静脉注射u PA-Fe3S4纳米颗粒（100μL,12mg/kg）并进行了AMF刺激后,使用同磁共振扫描仪扫描血栓模型小鼠以明确u PA-Fe3S4纳米颗粒分散体在动物体内的溶栓作用。收集动物组织,通过HE染色验证u PA-Fe3S4纳米颗粒在NIR刺激下的溶栓效果。结果:1)Fe3S4纳米颗粒其大小约为17.7nm,晶面间距为0.298nm,符合Fe3S4的参数。X射线衍射图谱及X射线光电子能谱、分析结果显示该样品为Fe3S4。Fe价态分析结果显示,Fe3S4纳米粒子中存在Fe2+和Fe3+的混合氧化态,表明Fe3S4纳米颗粒中存在缺陷。Fe3S4纳米颗粒具有良好的磁热转换性能及光热转化性能。Fe3S4纳米颗粒具有良好的组织相容性,对组织产生的毒副作用小,其在体内主要于肝脏和脾脏降解;2)Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下,可显着提升氧化氢处理后HUVEC及PVECs细胞活力并抑制细胞的凋亡。Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下,可显着增加氧化氢处理后HUVEC及PVECs细胞中NO,SOD含量的并减少LDH,MDA含量。与单一NIR或AMF处理组相比,NIR和AMF联合作用于细胞后,其氧化损伤的减少程度更高。Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下对两种内皮细胞的保护作用,可能经由影响Bcl-2,Caspase-3、Bax等凋亡相关因子,及氧化应激相关因子,例如SOD、e NOS等在蛋白水平的表达;3)测序结果显示过氧化氢组与处理组相比,表达量显着上调的基因有28个,而表达量显着下调的基因有47个。在28个显着上调的基因中,热休克蛋白70（HSP70）的表达量为最显着上调的基因之一。过氧化氢处理会导致HUVEC细胞中HSP70表达水平下降,而加入Fe3S4纳米颗粒并进行NIR和AMF处理后,细胞中HSP70表达水平显着上升。HSP70 sh RNA可逆转Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下对过氧化氢处理后,HUVEC细胞活力的提升及细胞凋亡的抑制。HSP70 sh RNA可逆转Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下对过氧化氢处理后HUVEC细胞中NO,SOD含量的增加及LDH,MDA含量的减少。HSP70 sh RNA可逆转Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下对过氧化氢处理后HUVEC细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、SOD以及e NOS在蛋白层面的水平。与Fe3S4纳米颗粒类似的是,u PA-Fe3S4同样具有较为良好的光热转化;4)u PA-Fe3S4纳米颗粒,在NIR的光热作用后,能够有效的释放负载的u PA药物。u PA-Fe3S4纳米颗粒在NIR刺激下体具有良好的溶栓效果,体内外可有效减小血栓块的大小。结论:1)新型纳米颗粒Fe3S4的制备可行,纳米颗粒具有良好的磁热效应及光热效应,动物实验中纳米颗粒Fe3S4在动物实验中具有良好组织相容性,无明显毒性,可有效代谢分解;2)纳米颗粒Fe3S4在NIR和/或AMF作用下对人脐静脉内皮细胞及肺血管内皮细胞H2O2损伤模型中对内皮细胞具有保护作用;3)经过生物信息学分析基于生物芯片技术的Fe3S4纳米颗粒在NIR和AMF作用下对过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用的探索中本研究发现可能HSP70的调控相关;4)通过构建纳米颗粒Fe3S4介导的u PA载药体系,发现该体系能后在NIR作用下有效缓慢释放负载药物,发挥促进血栓溶解作用。
张铭华[7]（2020）在《miR-22介导姜黄素抑制血管平滑肌细胞增生、迁移及血管内膜新生》文中提出研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。经皮冠状动脉支架植入术已成为我国冠心病患者普遍接受的治疗手段,但支架植入后支架内再狭窄问题至今未能完全解决,目前支架内再狭窄普遍观点认为与新生内膜增生、支架贴壁不良及损伤后内皮修复等因素相关。支架后再狭窄的具体分子机制尚未清楚,有效的预防措施也有待进一步研究。姜黄素（curcumin）是从姜黄属植物中分离出来一种具有生物活性的多酚类化合物。目前研究已发现其具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等功效。microRNA（miRNA）是一组天然存在的非编码小分子RNA,研究认为miRNA在平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡、分化等过程中起着调控作用,尽管部分研究发现miR-22在心脏中丰富表达,且在心肌细胞中调控多种信号通路,但miR-22在血管平滑肌细胞中表达尚不明确。研究目的通过体内外实验明确姜黄素调控血管平滑肌细胞miR-22的表达及miR-22对平滑肌细胞功能的影响,阐述姜黄素抑制平滑肌细胞增殖、迁移及血管内膜新生的可能分子机制。研究方法1.姜黄素干预大鼠动脉平滑肌细胞,观察对miR-22的表达情况,同时观察血清刺激动脉平滑肌细胞对miR-22的表达。2.通过瞬时转染技术过表达和抑制miR-22的表达,观察miR-22对血管平滑肌细胞功能的影响。3.通过生物信息学分析,利用分子克隆及测序的方式确定miR-22的功能靶基因。4.姜黄素预处理平滑肌细胞,观察miR-22表达及下游靶基因的表达并验证对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。5.构建大鼠动脉球囊损伤内膜的动物模型,予姜黄素干预后检测miR-22的表达及血管内膜病理增生程度,验证miR-22在姜黄素抑制血管内膜增生的作用。结果1.姜黄素浓度是10μM时干预血管平滑肌细胞,miR-22的表达升高最明显,血清刺激血管平滑肌细胞24小时,与对照组比较miR-22的表达下降有显着性差异。2.通过MTS及Edu细胞增殖实验发现,过表达miR-22抑制平滑肌细胞的增殖,通过划痕实验及transwell迁移实验发现,过表达miR-22抑制平滑肌细胞的迁移,反之亦然。3.利用生物信息网站数据库预测SP1是miR-22的靶基因。过表达miR-22在mRNA和蛋白水平上SP1表达下降均有显着性差异,反之亦然。荧光素酶报告实验证明miR-22过表达显着降低荧光素酶活性,SP-1结合位点突变后荧光素酶活性不变。4.姜黄素抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,提高miR-22的表达。予miR-22抑制剂预处理,则减弱姜黄素对血管平滑肌细胞的增殖和迁移作用,同时提高了 SP1在mRNA及蛋白水平的表达。5.血管损伤后内膜增生过程中miR-22的表达显着下降,姜黄素干预后miR-22的升高,SP1显着下降,同时明显减轻血管内膜增生程度。结论本研究表明姜黄素可促进血管平滑肌细胞miR-22的表达,miR-22抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。miR-22可以直接靶向SP1并下调SP1的表达。姜黄素可部分通过miR-22/SP1抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移及动脉损伤后血管内膜增生。姜黄素可能为将来防治冠状动脉粥样硬化及支架后狭窄提供新思路。
郭校银[8]（2020）在《高强度聚焦超声治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管影响的临床研究》文中认为研究背景目前,胰腺癌（Pancreatic Cancer,PC）仍是消化道肿瘤中恶性程度最高的一种肿瘤;其预后差,五年生存率极低。随着胰腺癌的发病率和死亡率呈逐年增高趋势,越来越多的局部消融治疗方法应用于胰腺癌的临床治疗中,而高强度聚焦超声（High-intensity Focused Ultrasound,HIFU）作为一种非侵入微无创的治疗技术,在治疗胰腺癌中取得了较好的临床效果,但现目前的研究缺乏较为系统全面地评估HIFU治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管的影响。研究目的通过观察比较血管形态学及测量血管血流动力学来评估HIFU治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管的影响,同时记录HIFU治疗胰腺癌血管不良事件发生情况,最终评估HIFU治疗胰腺癌对侵犯及邻近血管的安全性。研究方法1.回顾性观察分析2018年1月至2019年12月在重庆医科大学附属第二医院符合标准的51例胰腺癌患者资料。观察患者在接受HIFU治疗前及治疗后1周、1月的计算机断层扫描（Computed Tomography,CT）或磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）等影像学资料,评估胰腺肿瘤侵犯及邻近血管的情况;观察相关血管形态变化;测量相关血管内径,观察是否有血管破裂出血、血管血栓形成、血管闭塞等治疗相关的血管不良事件发生。2.观察分析了2018年8月至2019年12月在重庆医科大学附属第二医院符合标准的26例胰腺癌患者临床资料,所有患者均接受彩色多普勒血流成像（Color Doppler Flow Imaging,CDFI）评估,测量肿瘤侵犯及邻近血管血流动力学参数,观察血管血流动力学相关变化及血管功能情况。研究结果1.在血管形态学研究中,HIFU治疗前有40例胰腺癌患者出现了血管侵犯,其中肿瘤病灶侵犯44根动脉、64根静脉;病灶1cm以内的相邻血管有69根动脉、23根静脉。通过CT或MRI测量肿瘤侵犯及邻近血管的血管内径（Vascular Diameter,VD）;比较术前及术后1周相关血管内径变化未见明显变化（P>0.05）;未观察到治疗后出现血管破裂出血、血管血栓形成、血管闭塞等血管不良事件的发生。2.在血管血流动力学研究中,HIFU治疗前有19名患者出现了血管受侵犯,其中肿瘤病灶侵犯、22根动脉、31根静脉;病灶1cm以内的相邻血管有37根动脉、14根静脉。通过CDFI测量肿瘤侵犯及邻近血管的血流动力学参数:平均血流速度（Mean Blood Flow Velocity,MFV）、峰值血流速度（Peak Systolic Blood Flow Velocity,PSV）、搏动指数（Pulsatility index,PI）、阻力指数（Resistance index,RI）、血流量（Blood Flow,BF）、血管内径等指标,评估增强CT/MRI影像学中血管灌注情况,比较术前及术后血流动力学资料差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者均安全地进行HIFU治疗而没有观察到血管不良事件的发生。研究结论针对有肿瘤侵犯或压迫邻近胰周血管的胰腺癌,HIFU可以进行安全地消融,对肿瘤侵犯及邻近血管的血管形态学、血管血流动力学未造成明显变化,不影响血管血流灌注;未观察到血管破裂出血、血管血栓形成、血管闭塞等治疗相关的血管不良事件发生。
陈乙菲[9]（2020）在《基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究》文中提出目的:基于CaN/NFAT信号通路,探讨血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响,探讨血府逐瘀汤对大鼠颈动脉损伤模型病理变化的影响、该信号通路标志因子和炎症因子的相关影响,明确血府逐瘀汤治疗血管内膜损伤可能的作用机制,丰富血府逐瘀汤的治疗范围和药理机制。方法:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响用BEGM培养基培养人脐静脉内皮细胞。实验用药为血府逐瘀汤冻干粉用无血清培养基BEGM配制成100mg/ml含药培养基,在涡旋仪上充分混匀后,用0.22μm滤膜除菌过滤后,高压灭菌分装保存,4℃冷藏备用。MTS实验检测不同浓度血府逐瘀汤对HUVECs细胞增殖的影响,分为正常对照组（加等体积不含药培养基）、含药培养基组（浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml、50μg/ml）,培养24h和48h,分别检测OD值。细胞划痕实验检测血府逐瘀汤对HUVECs细胞迁移和修复的影响,分为对照组（无血清培养基）,血府逐瘀汤12.5μg/ml组、血府逐瘀汤25μg/ml组、血府逐瘀汤50μg/ml组。将6孔板封好,放入37℃,5%CO2培养箱,分别于0h、24h、48h镜下拍照（×10）。Real-time PCR检测HUVECs细胞物理损伤后24h和48hCaN/NFAT标志因子的表达量。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:健康SD大鼠72只,分为6组,假手术组、模型组、他克莫司组、血府逐瘀汤高剂量组、血府逐瘀汤中剂量组、血府逐瘀汤低剂量组。假手术组只结扎颈外动脉,不做球囊扩张损伤,其余各组大鼠行球囊损伤术对大鼠颈动脉造成损伤,给药28天后取材。大鼠颈动脉做HE染色看各组病理形态变化情况,采各组大鼠血清用ELISA法检测血清MCP-1。实验二:取大鼠颈动脉组织,用免疫组化方法检测CaN含量,用Real-time PCR检测各组大鼠颈动脉中CaN、NFATc2、NFATc3、IL-2、TNF-α、COX2、S100A4 mRNA和蛋白表达水平。结果:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响MTS细胞增殖实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞增殖的作用,到48h时血府逐瘀汤50μg/ml组表现出抑制细胞增殖的作用。细胞划痕实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞迁移和修复的作用,48h血府逐瘀汤50μg/ml组体现抑制细胞迁移的作用。Real-time PCR结果显示:血府逐瘀汤给药24h,12.5μg/ml、25μg/ml血府逐瘀汤组可显着上调CaN、NFATc1、NFATc2、NFATc3 mRNA的表达量（*P<0.05,#P<0.01）;到给药48h时CaN/NFAT信号通路标志因子有表达量下调的趋势,但无统计学差异。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:颈动脉HE染色结果示:与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组有极少量血管新生内膜,极薄,有少量炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱,弹力纤维板不平整比模型组要有明显改善减轻。血清MCP-1结果示:与假手术组相比各组大鼠血清MCP-1含量具有极显着差异(**P<0.01)。他克莫司组与中剂量中药组血清含量比较未见明显差异（P>0.05）,高剂量中药组与他克莫司组比较含量降低,有极显着差异(&&P<0.01)。实验二:免疫组化检测大鼠颈总动脉组织切片CaN的表达结果示:假手术组很少见棕黄色颗粒,模型组有内膜明显增厚,CaN表达呈阳性,可见数个棕黄色颗粒;他克莫司组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组棕黄色颗粒与模型组比较明显减少,提示药物干预后大鼠颈总动脉组织中CaN表达下降。血府逐瘀汤对大鼠颈总动脉组织中CaN/NFAT信号通路标志因子的影响:与假手术组相比,模型组CaN/NFAT信号通路标志因子CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调标志因子的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。血府逐瘀汤对球囊损伤后的大鼠颈总动脉中炎症因子的影响:与假手术组相比,模型组炎症因子IL-2、TNF-α、COX2的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调三者的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。结论:1.血府逐瘀汤对HUVECs细胞的增殖和迁移在一定浓度剂量有促进作用,而随着浓度的升高有抑制作用,且这种抑制作用会随药物作用时间延长而体现出来。2.血府逐瘀汤对HUVECs损伤后CaN/NFAT信号通路标志因子在初期有促进作用,随药物作用时间延长会体现抑制趋势。3.血府逐瘀汤能有效改善球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的病变情况,为研究再狭窄提供基础。4.血府逐瘀汤可以降低大鼠颈总动脉组织中IL-2、TNF-α、COX2含量,能降低血清中MCP-1的含量,具拮抗炎症的作用。5.血府逐瘀汤能抑制大鼠颈总动脉组织中CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达量,提示血府逐瘀汤可通过CaN/NFAT信号通路抑制内膜过度增生,发挥防治再狭窄的作用。
路芳芳[10]（2020）在《阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究》文中指出第一部分小鼠血管内膜增生模型的的构建目的:构建小鼠血管内膜增生模型,探讨其引起内膜增生和管腔狭窄的相关机制。方法:根据文献报道的方法[1],使用硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生,对照侧实行假手术,分离股动脉后不进行套管。手术后进行体重连续监测,取血管进行组织形态分析前用小动物超声仪检测小鼠双侧股动脉内血流的变化,作为再狭窄形成的辅助诊断指标。通过对实验处股动脉切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE staining）来判断血管内新生内膜的面积和管腔狭窄的程度,分别对内膜面积,中膜面积,内膜与中膜的比例（I/M）用ImageJ软件处理后进行定量。结果:经测定,与假手术侧相比,小鼠股动脉手术侧的血流速度[（126.2334±21.43199）vs（70.97854±4.646153）,P=0.002]显着加快,差异有统计学意义,即手术侧管腔的横截面积小于对照侧。取小鼠股动脉切片后进行HE染色,可见血管内膜显着增生和管壁增厚及管腔狭窄。内膜中可见大量的血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）增生,血管周可见炎性细胞浸润。血管狭窄参数的定量结果显示,手术侧的内膜面积[（2563.67±398.31）vs（7974.67±1491.69）,P=0.004],中膜面积[（6939.67±570.507）vs（12227.67±1487.02）,P=0.005],I/M 比值[（0.37±0.04）vs.（0.66±0.13）,P=0.019]都明显高于对照侧（图3D）,差异有统计学意义。结论:成功构建了简单实用的通过血管外膜损伤诱导小鼠股动脉内膜增生的模型。第二部分体外评价阿苯达唑对平滑肌细胞生物学功能的影响目的:利用体外实验评价阿苯达唑（Albendazole,ABZ）对VSMCs生物学功能的影响并简要探讨其作用机制。方法:体外各实验均用与实验组等体积的DMSO作为对照,且DMSO在培养基中的浓度≤0.2%。MTT法检测ABZ对VSMCs和内皮细胞（endothelial cell,ECs）增殖的影响,3-D细胞迁移实验和Annexin V-PI染色分别评估ABZ对VSMCs迁移和凋亡的影响。细胞划痕实验用来评估ABZ对ECs迁移的影响。在VSMCs体外迁移的过程中,使用特异性鬼笔环肽荧光染料标记丝状肌动蛋白（F-actin）,用来反映ABZ对细胞骨架结构变化的影响。免疫印迹法（Western blotting）检测肌球蛋白磷酸酶1（MYPT1）和肌球蛋白轻链2（MLC）磷酸化水平的变化。结果:MTT实验检测结果显示,与对照组相比,ABZ以0.5μM[（0.60±0.03）vs（0.50±0.04）,P<0.001]1μM[（0.60±0.03）vs（0.33±0.03）,P<0.001]浓度作用 48h后,均能显着抑制VSMCs的增殖,最小起效浓度为0.5μM。细胞迁移实验结果显示,与对照组相比,ABZ 以 0.5μM[（118.55±3.39）vs（81.00±4.00）,P<0.001]和1μM[（118.55±3.39）vs 78.875±3.01),P<0.001]浓度作用 48h 时后对 VSMCs 迁移具有抑制作用,穿过胶原贴附到Transwell小室膜外侧的细胞数显着减少。流式细胞术检测结果表明,ABZ作用48h后,0.5μM浓度对细胞凋亡没有显着影响[（18.29±2.79）vs（20.02±2.23）,P=0.420],但在 1.0μM时可以促进细胞凋亡[（18.29±2.79）vs（25.13+1.35）,P=0.002]。本实验室之前的实验研究表明,ABZ将VSMCs的细胞周期阻滞在G2/M期。使用MTT细胞增殖试剂盒对ECs的检测结果表明,与对照组相比,ABZ处理48h,0.5μM[（0.34±0.11）vs.（0.42±0.09）,P=0.146]和 1μM[（0.34±0.11）vs.（0.40±0.10）,P=0.427]浓度对ECs的增殖作用均未见显着的抑制作用。细胞划痕实验用来体外模拟ABZ对ECs损伤愈合的影响,ImageJ软件分别对Oh和24h划痕愈合的面积进行定量。愈合面积用Oh划痕面积与24h划痕面积之差表示。相较于对照,ECs 经过 0.5μM[（85423.89±29521.03）vs（18211.33±4985.28）,P<0.01]和 1μM[（85423.89±29521.03）vs（21810.00±17750.62）,P<0.001]ABZ 处理 24h 后,创面愈合面积都具有明显差异。Western blot检测结果显示,与对照相比,0.5μM[（0.64±0.12）vs（0.37±0.12）,P=0.04]和1.0μM[（0.64±0.12）vs（0.24±0.07）,P=0.007]ABZ 分别作用24h后,MYPT1磷酸化水平显着降低。MLC磷酸化水平在0.5μM[（0.89±0.06）vs（0.56±0.13）,P=0.01]和 1μM[（0.89±0.06）vs（0.34±0.08）,P<0.001]ABZ 处理后也显着降低。结论:ABZ能够在体外抑制VSMCs增殖和迁移,对细胞凋亡影响较小,并且不会影响ECs的增殖作用。ABZ对VSMCs迁移的影响与细胞骨架中F-actin的拆解有关,能够显着抑制F-actin的拆解,其机制可能与ABZ对MLC和MYPT1磷酸化水平的调节有关。第三部分阿苯达唑对小鼠股动脉内膜增生和管壁重塑的影响目的:利用小鼠血管内膜增生模型评价ABZ在体内对小鼠股动脉损伤后再狭窄形成的影响,探讨ABZ成为血管再狭窄潜在预防药物的可能。方法:取10周龄野生型雄性C57BL/6小鼠,硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生模型,对侧实行假手术。术后将小鼠随机分为实验组和对照组,两组小鼠同时用高脂饲料喂养。期间实验组将ABZ以1.5 mg/天的剂量进行灌胃,对照组以同体积的芝麻油灌胃。4周后用小动物超声仪评价血管内膜增生的严重程度。HE染色后观察血管组织的形态学变化,ImageJ软件处理后对内膜面积,中膜面积及内膜与中膜的比例（I/M）进行定量。通过免疫组织化学染色评价平滑肌细胞表型转换分子（α-SMA）,内皮细胞标记（CD31）,巨噬细胞标记（Mac-3）,以及平滑肌细胞核增殖抗原（PCNA）表达的变化。结果:与对照组相比,实验组小鼠双侧股动脉内血流速度的差值[（40.37±2.88）vs（25.08±7.37）,P=0.008]减低,差异有统计学意义,即ABZ作用后股动脉血管腔的横截面积大于对照侧,狭窄程度得到改善。HE染色结果表明,相较于对照组小鼠,ABZ 能够显着抑制内膜[（5605.79±1246.96）vs（2988.66±365.58）,P=0.017]增生及I/M的比例[（1.12±0.20）vs（0.76±0.15）,P=0.005],对中膜的面积并无显着效应[（4114.46±970.57）vs（3913.79±528.51）,P=0.661]。免疫组化染色结果显示,α-SMA阳性细胞显着减少[（0.35±0.02）vs（0.21±0.04）,P=0.008]。CD31染色结果表明,ABZ不会影响再内皮化。PCNA染色结果显示ABZ处理后,PCNA阳性细胞数明显减少[（0.32±0.03）vs（0.20±0.04）,P=0.007]。与对照组相比,巨噬细胞阳性数也减少[（0.08±0.02）vs（0.04±0.01）,P=0.03]。结论:ABZ通过作用于VSMCs和炎症细胞,有效的改善了动脉内膜增生和血管壁重塑,对术后血管再狭窄的形成具有较好的预防作用。
二、超声辐照对血管损伤模型内膜增生的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、超声辐照对血管损伤模型内膜增生的影响（论文提纲范文）
（1）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 脂肪细胞来源外泌体介导的内皮间质转化在糖尿病血管再狭窄中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 脂肪细胞来源外泌体在血管新生中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| SCI论文Ⅲ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肌动蛋白概述 |
| 1.2 WDR1的结构和actin切割 |
| 1.3 WDR1的生物学功能 |
| 1.3.1 WDR1与癌症 |
| 1.3.2 WDR1与内皮发育 |
| 1.3.3 WDR1与肌节组装 |
| 1.3.4 WDR1与血液疾病 |
| 1.4 本课题研究内容 |
| 1.4.1 血管损伤模型构建 |
| 1.4.2 探究血管损伤与WDR1的相关性 |
| 1.4.3 体外证实WDR1对平滑肌细胞的影响 |
| 1.4.4 STAT3与WDR1相互调控的分子机制 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 WDR1在血管损伤模型中的表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成功构建颈动脉损伤的小鼠模型 |
| 2.3.2 颈动脉结扎后Wdr1表达水平呈时间依赖性增高 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Wdr1的缺失抑制血管新生内膜的形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建Wdr1条件性敲除小鼠 |
| 3.3.2 Wdr1条件性敲除抑制了血管内膜的增厚 |
| 3.3.3 敲除Wdr1抑制平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.3.4 原代血管平滑肌细胞敲降Wdr1抑制细胞的增殖和迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 STAT3直接调控Wdr1的转录来促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.3.2 活化的STAT3参与动脉损伤修复过程 |
| 4.3.3 STAT3 的激活是WDR1介导的平滑肌细胞的增殖和迁移所必需 |
| 4.3.4 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移需要ADF/Cofilin介导的肌动蛋白动力学的参与 |
| 4.3.5 STAT3直接结合Wdr1的启动子调节其转录活性 |
| 4.3.6 体内抑制JAK2/STAT3途径可降低Wdr1的表达和新内膜形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Wdr1的缺失抑制STAT3的核转移 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HAVSMCs中Wdr1的缺失不影响STAT3 的表达和活化 |
| 5.3.2 WDR1介导pSTAT3的核转移 |
| 5.3.3 WDR1通过调控Importinβ的表达和Ran的核质分布来影响p STAT3 的核 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究内容的创新与应用 |
| 6.3 本研究中的不足以及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（3）负载MCC950的粘附型双网络水凝胶用于动脉损伤的止血修复（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 双网络水凝胶的制备和性能测试 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 大动物实验验证双网络水凝胶的粘附止血效果 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 负载MCC950 双网络水凝胶对股动脉损伤的止血修复效果 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 用于止血的生物粘合剂 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章及成果 |
| 致谢 |
（4）OVGP1升高血压的机制研究及高血压脑出血circRNA标志物研究（论文提纲范文）
| 第一部分 OVGP1升高血压的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 1.1 Ovgp1全身性转基因小鼠 |
| 1.2 Ovgp1全身性敲除小鼠 |
| 1.3 人主动脉平滑肌细胞 |
| 2. 实验材料与仪器 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 构建Ovgp1全身性转基因小鼠模型 |
| 3.2 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 3.3 构建Ovgp1全身性敲除小鼠模型 |
| 3.4 血管紧张素诱导的高血压模型小鼠构建 |
| 3.5 小鼠血压监测 |
| 3.6 小鼠超声检测 |
| 3.7 小鼠血尿生化检测 |
| 3.8 小鼠取材 |
| 3.9 组织包埋与切片 |
| 3.10 组织病理染色 |
| 3.11 RT-RCR检测目的基因的表达 |
| 3.12 蛋白提取和蛋白免疫印迹(Western blot)实验 |
| 3.13 酶联免疫吸附实验（ELISA) |
| 3.14 血管张力测定实验 |
| 3.15 小鼠股动脉导丝损伤模型构建 |
| 3.16 小鼠股动脉取材 |
| 3.17 小鼠股动脉病理染色 |
| 3.18 细胞培养 |
| 3.19 平滑肌细赋表达OVGP1后转录组测序 |
| 3.20 Pull-down实验捕捉OVGP1相互作用蛋白 |
| 3.21 质谱检测 |
| 3.22 质谱检测结果验证 |
| 3.23 免疫共沉淀实验(CoIP) |
| 3.24 TG小鼠注射MYH9抑制剂Blebbistatin (BLEB) |
| 3.25 数据统计 |
| 研究结果 |
| 1.OVGP1在髙血压小鼠血浆中升高 |
| 2.OVGPl促进小鼠血压升高 |
| 2.1 Ovgp1转基因小鼠基因型和表达情况鉴定结果 |
| 2.2 Ovgp1敲除小鼠基因型鉴定结果 |
| 2.3 Ovgp1转基因小鼠血压升高 |
| 2.4 敲除Ovgp1减轻了AngⅡ诱导的血压升高 |
| 3. 探讨OVGP1升高血压的机制 |
| 3.1 OVGP1在小鼠组织中表达检测 |
| 3.2 小鼠血尿生化检测结果 |
| 3.3 小鼠超声检测结果 |
| 3.4 OVGP1在AngⅡ诱导的血管重塑模型中表达升高 |
| 3.5 OVGP1在股动脉损伤模型重塑血管中表达升高 |
| 3.6 OVGP1在血管损伤后新生内膜中呈显着的时相表达 |
| 4. OVGP1促进血管重塑 |
| 4.1 OVGP1促进小鼠血管纤维化 |
| 4.2 OVGP1促进小鼠血管炎症反应 |
| 4.3 OVGP1促进小鼠主动脉氧化应激反应 |
| 4.4 OVGP1促进血管损伤后内膜重塑 |
| 5. OVGP1促进小鼠血管功能障碍 |
| 5.1 过表达OVGP1促进小鼠血管功能障碍 |
| 5.2 敲除OVGP1减轻了AngⅡ诱导的血管功能障碍 |
| 6. OVGP1在平滑肌细胞中的作用和机制 |
| 6.1 OVGP1主要在平滑肌细胞中表达 |
| 6.2 主动脉平滑肌细胞过表达OVGP1转录组测序结果 |
| 6.3 转录组测序结果验证 |
| 6.4 OVGP1促进平滑肌细胞增殖和迁移 |
| 6.5 OVGP1促进平滑肌细胞氧化应激 |
| 6.6 AKT/ERK是OVGP1下游的主要通路 |
| 7. OVGP1通过与MYH9相互作用影响平滑肌细胞的功能 |
| 7.1 OVGP1相互作用蛋白的筛选 |
| 7.2 CoIP验证OVGPl与MYH9相互作用 |
| 7.3 OVGP1与MYH9在平滑肌细胞和血管组织中共定位 |
| 7.4 OVGP1通过MYH9引起平滑肌细胞的氧化应激反应 |
| 7.5 敲低MYH9抑制OVGP1下游AKT通路的磷酸化 |
| 7.6 MYH9抑制剂Blebbistatin改善了OVGP1引起的血管重塑和血压升高 |
| 8. 研究结果总结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 高血压脑出血环状RNA表达谱鉴定及生物标志物研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 样本收集和基线资料采集 |
| 3.2 RNA提取与浓度测定 |
| 3.3 文库构建与上机测序 |
| 3.4 信息分析流程 |
| 3.5 数据质控 |
| 3.6 circRNA识别 |
| 3.7 差异表达基因分析 |
| 3.8 生物信息学分析 |
| 3.9 RT-PCR验证 |
| 3.10 circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 3.11 统计分析 |
| 研究结果 |
| 1. 临床基线资料统计 |
| 2. 测序结果质量 |
| 3. circRNA的分类 |
| 4. 差异基因表达分析结果 |
| 4.1 发现人群ICH vs HTN差异表达基因 |
| 4.2 验证人群ICH vs HTN差异表达基因 |
| 4.3 CI vs HTN差异表达基因 |
| 4.4 ICH特异性差异表达的circRNA |
| 5. circRNA宿主基因功能分析 |
| 6. RT-RCR验证候选基因 |
| 7. circRNA作为脑出血诊断标志物的潜在价值 |
| 8. circRNA的表达情况与ICH患者临床特征的相关性分析 |
| 9.候选circRNA作为脑出血独立预测因子的研究 |
| 10. circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 11. circRNA的靶基因miRNA和mRNA的功能分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 高血压表观遗传学的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）右上肢缺血预处理对经右侧桡动脉途径冠状动脉介入术后患者桡动脉闭塞的影响及其机制（论文提纲范文）
| 第一部分 右上肢缺血预处理对经右侧桡动脉途径冠状动脉介入术后患者桡动脉闭塞的影响 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肢体缺血预处理影响动脉机械损伤后动脉闭塞机制的探究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 图表 |
| 参考文献 |
| 综述Ⅰ 预防及治疗经桡动脉途径冠脉介入治疗术后桡动脉闭塞率的方法 |
| 参考文献 |
| 综述Ⅱ 缺血预适应及其在心血管方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（6）新型载药纳米体系的构建及其促进血栓溶解作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Fe_3S_4 纳米颗粒的制备与特性检验及Fe_3S_4 纳米颗粒在体内代谢及毒性的相关验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 Fe_3S_4 纳米颗粒在NIR和 AMF作用下对过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 Fe_3S_4 纳米颗粒在NIR和 AMF作用下对过氧化氢处理人肺血管内皮细胞氧化损伤的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 基于生物芯片技术的Fe_3S_4 纳米颗粒在NIR和 AMF作用下对过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用相关机制的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五部分 尿激酶型纤溶酶原激活剂在Fe_3S_4纳米颗粒上的固定化后光热激发药物释放加速血栓溶解 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 纳米载药体系的建立及其在在临床治疗中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）miR-22介导姜黄素抑制血管平滑肌细胞增生、迁移及血管内膜新生（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-22调控血管平滑肌细胞功能 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 参考文献 |
| 第二部分 miR-22靶向调控SP1的表达 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 参考文献 |
| 第三部分 miR-22介导姜黄素对血管平滑肌细胞功能的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 参考文献 |
| 第四部分 姜黄素通过调控大鼠动脉损伤后miR-22表达抑制血管内膜增生 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）高强度聚焦超声治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管影响的临床研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:高强度聚焦超声治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管形态学的影响 |
| 1.资料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分:高强度聚焦超声治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管血流动力学的影响 |
| 1.资料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（9）基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、中医学对冠心病介入术后再狭窄的认识 |
| 二、现代医学对冠心病介入术后再狭窄的认识 |
| 三、血府逐瘀汤治疗心血管疾病药理机制的研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究 |
| 实验一 血府逐瘀汤对球囊损伤大鼠颈总动脉病理形态及MCP-1 的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 血府逐瘀汤对球囊损伤大鼠颈总动脉CaN/NFAT信号通路干预作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
（10）阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 血管再狭窄模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 4. 统计学处理 |
| 结果 |
| 1. 建立小鼠股动脉狭窄模型 |
| 2. 小鼠体重变化 |
| 3. 血管周套囊性狭窄小鼠模型中血流改变和管壁重塑 |
| 讨论 |
| 第二部分 阿苯达唑对VSMCs体外生物学功能的影响及其作用机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 细胞 |
| 2. 材料 |
| 3. 方法 |
| 结果 |
| 1. 体外用药浓度确定 |
| 2. ABZ抑制VSMCs的增殖和迁移 |
| 3. ABZ对ECs增殖和迁移的作用 |
| 4. ABZ通过调节MLC和MYPT磷酸化抑制F-actin分解,从而抑制细胞迁移. |
| 讨论 |
| 第三部分 阿苯达唑对小鼠血管再狭窄的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1. ABZ治疗后股动脉血流的变化 |
| 2. ABZ在再狭窄小鼠模型中抑制新生内膜的增生 |
| 3. ABZ在对组织抗原表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 预防动脉支架内再狭窄药物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文及基金参与情况 |
| 致谢 |
四、超声辐照对血管损伤模型内膜增生的影响（论文参考文献）
- [1]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
- [2]WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究[D]. 胡继盛. 武汉科技大学, 2021(12)
- [3]负载MCC950的粘附型双网络水凝胶用于动脉损伤的止血修复[D]. 赵小林. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]OVGP1升高血压的机制研究及高血压脑出血circRNA标志物研究[D]. 白丛霞. 北京协和医学院, 2021
- [5]右上肢缺血预处理对经右侧桡动脉途径冠状动脉介入术后患者桡动脉闭塞的影响及其机制[D]. 刘淼. 山东大学, 2020(04)
- [6]新型载药纳米体系的构建及其促进血栓溶解作用的研究[D]. 付大鹏. 新疆医科大学, 2020(03)
- [7]miR-22介导姜黄素抑制血管平滑肌细胞增生、迁移及血管内膜新生[D]. 张铭华. 南方医科大学, 2020(01)
- [8]高强度聚焦超声治疗胰腺癌对其侵犯及邻近血管影响的临床研究[D]. 郭校银. 重庆医科大学, 2020(12)
- [9]基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究[D]. 陈乙菲. 长春中医药大学, 2020(08)
- [10]阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究[D]. 路芳芳. 苏州大学, 2020(02)